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Article de méthode

Human Trophoblast primaire Culture cellulaire de modèle pour étudier les effets protecteurs de la mélatonine contre l'hypoxie / perturbation induite par la réoxygénation-

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DOI :

10.3791/54228

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30 juillet 2016

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1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit présente un modèle in vitro unique de cellules cytotrophoblastes villositaires humaines immunopurifiées cultivées sous hypoxie/réoxygénation. Ce modèle est adapté pour étudier les effets protecteurs de traitements prometteurs, tels que la mélatonine, sur les complications de la grossesse associées à une augmentation du stress oxydatif et à une altération de la fonction placentaire.

Résumé

Ce protocole décrit comment les cellules cytotrophoblastes villeuses sont isolées à terme du placenta par digestions enzymatiques successives, suivies d’une centrifugation par densité, d’un isolement par gradient de milieu et d’une purification immunomagnétique. Comme observé in vivo, les cellules de cytotrophoblaste villeux mononucléées en culture primaire se différencient en cellules syncytiotrophoblastes multinucléées après 72 heures. Par rapport à la normoxie (8 %O2), les cellules cytotrophoblastes villeuses qui subissent une hypoxie/réoxygénation (0,5 % / 8 %O2) subissent un stress oxydatif accru et une apoptose intrinsèque, similaires à celles observées in vivo dans les complications de la grossesse telles que la prééclampsie, l’accouchement prématuré et le retard de croissance intra-utérin. Dans ce contexte, les trophoblastes villeux primaires cultivés dans des conditions d’hypoxie/réoxygénation représentent un système expérimental unique pour mieux comprendre les mécanismes et les voies de signalisation qui sont altérés dans le placenta humain et faciliter la recherche de médicaments efficaces qui protègent contre certains troubles de la grossesse. Les trophoblastes villeux humains produisent de la mélatonine et expriment ses enzymes et récepteurs synthétisants. La mélatonine a été suggérée comme traitement de la prééclampsie et du retard de croissance intra-utérin en raison de ses effets antioxydants protecteurs. Dans le modèle primaire de cellules cytotrophoblastes villeuses décrit dans cet article, la mélatonine n’a aucun effet sur les cellules trophoblastiques à l’état normoxique mais rétablit l’équilibre redox des cellules syncytiotrophoblastes perturbées par l’hypoxie/réoxygénation. Ainsi, les cellules trophoblastiques villeuses humaines en culture primaire constituent une excellente approche pour étudier les mécanismes à l’origine des effets protecteurs de la mélatonine sur la fonction placentaire pendant l’hypoxie/réoxygénation.

Introduction

Tout au long de la grossesse humaine, les cellules placentaires cytotrophoblaste, qui sont des cellules souches mononucléées, prolifèrent rapidement et se différencient en cellules soit de cytotrophoblaste villeux ou extravilleux. cytotrophoblastes extravillositaire envahissent et remodeler les artères spiralées de la paroi utérine. Cytotrophoblastes villeux, d'autre part, continuent à proliférer, se différencient et fusionnent pour former syncytiotrophoblaste multinucléés (le syncytium) 1. Le maintien de l'homéostasie villous trophoblaste est essentiel pour le bien-être du fœtus et la grossesse en bonne santé. En fait, trophoblaste villeux permettent l'échange d'oxygène et de nutriments materno-fœtale, et produisent des hormones essentielles pour la grossesse. Par ailleurs, le syncytiotrophoblaste est le seul type de cellule en contact direct avec la circulation sanguine maternelle et fournit une barrière physique et immunologiques essentielles. Par conséquent, le syncytiotrophoblaste doit subir l'apoptose et de remplacement pour l'entretien homéostatique et Avoid placentaire pathologies 2-5.

La technique développée par Kliman et al. , 6 en 1986 pour isoler cytotrophoblastes villosités primaires de placentas humains a provoqué une révolution dans la recherche placentaire en permettant l'étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation du trophoblaste villeux. Cette technique classique, sur la base des digestions enzymatiques séquentielles avec de la trypsine et de l'ADNase, suivie d'un isolement en milieu de centrifugation de densité (particules de silice colloïdale revêtue par de la polyvinylpyrrolidone ou de Percoll) est maintenant reconnu comme l'étalon-or pour isoler des cellules du cytotrophoblaste villeux. La technique peut être optimisée par immunopurification magnétique, une procédure qui sépare cytotrophoblastes villeux des cellules non trophoblastiques basées sur l'expression différentielle des antigènes spécifiques sur les surfaces de ces cellules. Nous avons choisi le leucocyte humain antigène ABC (HLA-ABC) en raison de l'absence de son expression sur le Membran cellulaire trophoblastiquee 7,8.

Le placenta est un organe qui subit des variations considérables dans les niveaux d'oxygène au cours de la grossesse. Au cours du premier trimestre de la grossesse, le taux d'oxygénation est physiologiquement très faible (2% d' O 2) , mais augmente à des niveaux d'oxygénation légers (8% O 2) dans le deuxième et le troisième trimestre de la grossesse. Tuuli et al. 9 décrit que la reproduction in vitro de l'environnement à l' intérieur du trophoblaste villosités placentaires est un défi et des variations dans les niveaux d'oxygénation peuvent même conduire à des changements phénotypiques. Il est donc suggéré d'adopter 8% d' oxygène en normoxie pour imiter la tension d'oxygène trouvé dans villosités placentaires au cours du troisième trimestre de la gestation 8,9. Chen et al. 10 longuement étudié plusieurs variables liées à la tension d'oxygène dans la culture de cellules de trophoblaste et ont démontré l'importance de la détermination des niveaux d'oxygène dans un environnement péricellulaire. Les niveaux d'oxygène dans les villosités tendent à accroîtreen raison de la vasculogenèse. Le flux sanguin dans les villosités placentaires augmente constamment et le niveau de peroxyde d'hydrogène (une espèce d'oxygène réactif abondant) est un signal important qui contrôle la vasculogenèse 11,12. Dans complications de la grossesse, un manque de vasculogenèse génère l'hypoxie, et plus important encore, les variations intermittentes de l'oxygénation (appelé hypoxie / réoxygénation). Ces conditions conduisent à une augmentation anormale du stress oxydatif, ce qui compromet la viabilité fœtale placentaire et 13,14. Les modifications que les cellules trophoblastiques subissent in vivo au cours des épisodes d'hypoxie / réoxygénation peuvent être imitées in vitro comme suit: cytotrophoblastes villosités sont maintenues dans des conditions normoxiques (8% de O 2) jusqu'à ce qu'ils se différencient en syncytiotrophoblaste. Elles sont ensuite soumises à des conditions hypoxiques (0,5% O 2) pendant 4 heures, suivie d'une 18 heure supplémentaire normoxie (réoxygénation). En utilisant cette approche hypoxie / réoxygénation, trophoblastes exHiBit déréglementé état ​​redox et des niveaux accrus d'apoptose intrinsèque 8, comme cela a été observé dans certaines complications de la grossesse. Par conséquent, cela est un utile dans le modèle in vitro pour évaluer de nouvelles approches préventives et thérapeutiques pour lutter contre les complications de la grossesse associés à placentaire hypoxie / réoxygénation.

Les cellules placentaires produisent la mélatonine, qui a plusieurs fonctions importantes telles que la capacité à prévenir le stress oxydatif et à un dysfonctionnement placentaire 15. Ici, nous présentons les modèles d'approche et de cellules expérimentales utilisées pour démontrer les effets protecteurs de la mélatonine dans les cellules trophoblastiques placentaires au niveau moléculaire, cellulaire et fonctionnelle 8.

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Protocole

Placentas ont été obtenus immédiatement après les accouchements vaginaux spontanés des grossesses sans complication au CHUM-Hôpital St-Luc, Montréal, QC, Canada, avec le consentement du patient éclairé et l'approbation des comités d'éthique (CHUM-Hôpital St-Luc et l'INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada).

1. Isolement et purification de cellules Villous Cytotrophoblaste

  1. Solutions et médias
    1. Préparer les milieux de transport en le complétant de Dulbecco Modifié Moyen Haut-glucose (DMEM-HG) avec 1% vol / vol antibiotique (10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine) et magasin d'Eagle à 4 ° C.
    2. Préparer un milieu de culture primaire en complétant DMEM-HG avec 10% en volume / volume de sérum de fœtus bovin (FBS), 25 mM d' acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1% en volume / volume d' antibiotiques (10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine) et conserver à 4 ° C. médias chauds à 37 ° C avantutilisation.
    3. Préparer 4 L de solution saline (0,9% de chlorure de sodium en poids / vol).
    4. Prepare modifié une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) en y ajoutant 25 mM de HEPES à 1x HBSS (pH 7,4).
    5. Préparer une solution fraîche, quatre bouteilles de solution de digestion avec du HBSS modifiée (préparée 1.1.4), le sulfate de magnésium (MgSO 4), du chlorure de calcium (CaCl 2), la trypsine, la désoxyribonucléase IV (désoxyribonucléase IV) et 1% vol / vol antibiotique ( 10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine) , comme indiqué dans le tableau 1.
    6. Préparer gradient de densité de milieux de centrifugation
      1. Préparer la solution de support de centrifugation de densité en complétant les médias de centrifugation de densité avec 10% vol / vol HBSS 10x.
      2. Préparer 14 des tubes à essai avec une solution de milieu de centrifugation de densité et HBSS modifiée, telle que décrite dans le tableau 2.
      3. Mélanger chaque solution de densité (étape 1.1.6.2) vigoureusement avant d'ajouter son contenu au gradient. Doucementajouter les solutions de densité dans un tube à centrifuger en verre de 50 ml avec une pompe péristaltique (1 ml / min), en commençant par la plus forte concentration (70%). Éviter des gouttelettes en drainant les solutions contre la paroi du tube pour maintenir la bonne séparation de chaque couche de gradient.
        1. En l'absence d'une pompe péristaltique, appliquer les couches très doucement avec des pipettes Pasteur.
    7. Préparer finale tampon en cours d'exécution en complétant le tampon en cours d' exécution (voir le tableau des matériaux) avec 2% vol / vol antibiotique / antimycosique (10.000 unités / ml de pénicilline G, 100 mg / ml de sulfate de streptomycine). Conserver à 4 ° C.
  2. isolement cytotrophoblaste villeux
    Remarque: L' utilisation stérile chirurgical équipement, verrerie, pipettes, flacons, etc.
    1. Le jour de l'isolement du cytotrophoblaste villeux, dans un bain-marie à 37 °, de chauffer les solutions de digestions (étape 1.1.5) et 70 ml de FBS. Remarque: Utilisez 50 ml de FBS pour interrompre les digestions et larestante 20 ml pour l'étape de congélation (1.2.22) qui peut être placé sur la glace une fois décongelé.
    2. Après l'accouchement, amener le placenta au laboratoire dans un milieu de transport glacé (de l'étape 1.1.1) aussi rapidement que possible (moins de 1 h).
    3. moyen de transport Jeter et le sang placentaire poubelle liquide. Peser le placenta et plonger dans une solution saline froide.
    4. Mesurer et analyser les caractéristiques suivantes: longueur du cordon ombilical; localisation du cordon ombilical; longueur placentaire, la largeur, la forme (ovale, discoïde); la couleur de la membrane; des pathologies de la structure de cotylédons. Note: Les données sont présentées dans la section des résultats.
    5. Couper le cordon ombilical aux côtés de son insertion placentaire (ie, à sa base avec un 1 cm cercle de rayon supplémentaire autour du cordon). Immerger dans 300 ml de solution de fixation de tissu histologique (formaline 10%) pour une analyse histologique ultérieure.
    6. Couper le placenta entier en cubes de 5 x 5 x 5 cm. Laver à fond (4 fois x ~ 1 min) dans une solution saline solution (0,9%) pour éliminer les cellules de sang jusqu'à ce que la solution saline est claire. Jeter le liquide de rinçage.
    7. Dans un verre de montre, retirer les membranes placentaires et les tissus hachis pour enlever les vaisseaux sanguins et calcifications. Tenir les vaisseaux sanguins fermement avec une pince et retirer les tissus en utilisant le dos de ciseaux Metzenbaum.
      1. Placez le placenta émincé dans un entonnoir Büchner. Rinçage avec environ 100 ml de tampon salin. Continuer émincer jusqu'au 30 - on obtient 35 g de tissu haché (plastique à usage bateau et balance). Si nécessaire, émincer le reste du placenta pour obtenir jusqu'à trois 30 supplémentaires - 35 g préparations. Pendant ce temps, mettre le tissu émincé dans un bateau pesant sur la glace.
        Remarque: Cette étape dure environ 45 min à 1 h.
    8. Ajouter le 30 - 35 g de tissu placentaire haché dans un flacon de trypsinisation. Transfert 150 ml de la digestion préparée solution 1 (Tableau 1) dans le flacon de trypsinisation et bien mélanger.
    9. Placer le ballon dans trypsinisationun bain-marie agitateur pendant 30 mn à une vitesse de pas plus de 50 cycles / min et mélanger manuellement le flacon trypsinisation toutes les 5 minutes pour la digestion homogène.
    10. A la fin de la première digestion, enlever le ballon trypsinisation du bain d'eau et de l'incliner (45 ° C) pendant 1 min pour sédimenter le tissu placentaire. Avec un 10 ml pipette stérile, enlever et jeter environ 80 ml de surnageant. Éviter l'aspiration du tissu.
    11. Verser 100 ml d' une solution de digestion 2 (tableau 1) dans le ballon de trypsinisation; bien mélanger et répéter l'étape 1.2.9.
    12. A la fin de la deuxième digestion, enlever le ballon trypsinisation du bain d'eau et de l'incliner à 45 ° C pendant 1 min. Avec une pipette de 10 ml stérile, enlever 80 ml de surnageant et le transfert en douceur vers un tube centrifuge avec un tamis cellulaire (100 um de maille). Transférer le surnageant filtré dans un bêcher contenant 2 ml de FBS à chaque fois que le tube de centrifugeuse est pleine.
    13. Effectuer la troisième digestion comme décrit pour ladeuxième digestion (1.2.11 et 1.2.12) en utilisant 75 ml de solution de digestion 3. En parallèle, effectuez les étapes 1.2.15 à 1.2.16.1 pour la digestion 2.
    14. Effectuer la quatrième digestion exactement comme la troisième digestion en utilisant la solution de digestion 4 (75 ml), mais collecter un maximum de surnageant. Effectuer les étapes 1.2.15 à 1.2.16.1 en parallèle pour la digestion 3, et enfin pour la digestion 4.
    15. Aliquoter le surnageant (de digestions 2, 3 et 4) dans 13,5 ml parties, chaque partie en un seul 15 ml tube de centrifugeuse. Avec un 22,8 cm de long pipette Pasteur en verre, très doucement et placez lentement 1,5 ml de FBS au bas de chaque tube afin de créer une couche séparée. Ne pas mélanger FBS et surnageant. Centrifuger les tubes sans frein pendant 20 min à 1.250 xg à la température ambiante.
      Nota: Après la centrifugation, 4 couches sont visibles dans le tube, comme représenté sur la figure 1 La séparation des cellules à la trypsine et trophoblastiques évite la digestion cellulaire excessive..
    16. Avec une pompe à vide, aspirmangé et jeter le surnageant (solution de digestion) et des couches de FBS, y compris le film blanchâtre entre les deux couches. Remettre en suspension le culot (les trophoblastes et les couches de cellules sanguines rouges) avec 1 ml de milieu de culture cellulaire chaude (étape 1.1.2, sans FBS et non HEPES).
      1. Collecter les cellules remises en suspension de tous les tubes et les combiner dans 1 tube. Laissez le tube reposer à température ambiante jusqu'à ce que la fin de toutes les digestions. Note: Après tous les digestions, le rendement habituel est de 3 tubes de cellules remises en suspension (un par digestion).
    17. Compléter le volume à 15 ml avec chaud milieu de culture cellulaire. Centrifuger à 1250 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant avec une pompe à vide. Évitez aspirer le culot.
    18. Resuspendre doucement le culot obtenu à partir des 3 tubes avec 1 ml de chaleur du milieu de culture cellulaire. En commun leur contenu dans 1 tube. Pour obtenir 8 ml, compléter le volume avec chaud milieu de culture cellulaire.
    19. Très couche doucement la suspension cellulaire sur un grad de séparationient avec une pipette Pasteur. Centrifugeuse sans frein pendant 30 min à 507 xg à la température ambiante.
    20. Après centrifugation, identifier les différentes couches de cellules dans le gradient avec rétro-éclairage. Repérez les couches contenant trophoblaste et contaminantes cellules entre 40 - 50% du milieu de centrifugation de densité. Avec une pompe à vide, enlever les couches supérieures (> 50%).
    21. Recueillir les cellules situées dans les couches d'intérêt à l'aide d'une pipette Pasteur et les transférer dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Compléter le volume à 50 ml avec du milieu de culture cellulaire. Centrifuger pendant 10 min à 1.250 xg à la température ambiante.
    22. Dans des conditions stériles, jeter le surnageant, resuspendre le culot avec 20 ml de FBS et de compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Sur la glace, ajouter 2,22 ml de diméthylsulfoxyde stérile (DMSO) et mélanger doucement en retournant. Aliquote de 1,5 ml de suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques, le gel pendant une nuit à -80 ° C et on transfère vers un réservoir d'azote liquide.
  3. Purification de Trophoblast
    1. Installez le rinçage et des tampons en cours d'exécution et une nouvelle colonne de filtre sur l'instrument de purification magnétique selon les instructions du fabricant. Effectuer le «programme de nettoyage" pour nettoyer les ports négatifs 1, positif 1 et positive 2, puis introduire les tubes de 50 ml dans chaque port selon les instructions du fabricant.
    2. Décongeler les cellules qui ont été gelés à l'étape 1.2.22 rapidement dans un bain d'eau C 37 °. Transfert des cellules à un tube de 50 ml et les cellules doucement avec 20 ml de solution tampon froide de resuspendre. Centrifuger le tube pendant 5 minutes à 450 xg et 4 ° C.
    3. Jeter le surnageant. Répétez l'étape de lavage avec un tampon froide. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre pour déterminer la viabilité. Répéter la centrifugation (5 min, 450 x g à 4 ° C). Retirez délicatement le surnageant. Ajouter 1 ml de tampon froid contenant 1 roulement% en volume / volume de souris d' anticorps anti-HLA-ABC. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, mixing doucement toutes les 5 min.
    4. Ajouter 6 ml de tampon courante froide. Centrifugeuse pendant 5 min à 450 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et répéter cette étape. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon courante froide contenant 10% en volume / volume de billes magnétiques secondaires couplées à des anticorps anti-souris. Incuber à 4 ° C pendant 15 minutes, en mélangeant doucement toutes les 5 min.
    5. Ajouter 6 ml de tampon courante froide. Centrifugeuse pendant 5 min à 450 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de tampon courante froide.
    6. Séparer les cellules trophoblastiques en utilisant l'instrument de purification magnétique. Recueillir les cellules au port négatif et ajouter 20 ml de tampon courante froide.
      Nota: Les cellules du trophoblaste ne contiennent pas le complexe HLA-ABC, et sont ainsi séparées des autres types de cellules et dirigés vers le négatif 1 port.
    7. Centrifugeuse pendant 5 min à 450 xg et 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre doucement les cellules dans 20 ml chaud milieu de culture primaire. Compter les cellules USINga hémocytomètre pour déterminer la viabilité.
    8. Plaque les cellules à des densités suivantes: 0,15 x 10 6 cellules / puits dans des plaques à 96 puits, 1,6 x 10 6 cellules / puits dans des plaques à 24 puits et 4,5 x 10 6 cellules / puits dans des plaques à 6 puits. Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2.
    9. Confirmer la pureté des cellules trophoblastiques par cytométrie de flux 16,17 et / ou par immunocytochimie 18.
      Remarque: La pureté des cellules immunopurifiés a été déterminée en utilisant des anticorps monoclonaux conjugués à FITC contre-cytokératine 7 et 17 à 19 vimentine. Ce protocole est bien détaillé dans Lanoix et al., 2008 7.
    10. Après au moins 4 heures, rincer les cellules deux fois avec un milieu de culture chaude pour éliminer les cellules seules et ensuite transférer les plaques à la chambre de normoxie, qui est composé de 8% O 2 (voir la figure 2 et à la section 2).

2. in vitro induction de normoxie et hypoxie / réoxygénation

  1. Fonctionnement de la chambre de l' incubateur (voir Figure 2A pour set-up).
    1. Dans une hotte à flux laminaire, placer une boîte de Pétri contenant de l'eau stérile, au fond de la chambre de l'incubateur pour éviter la sécheresse; puis placer les plaques ou flacons (étape 1.3.10) culture de cellules préalablement préparées sur les étagères supérieures de la chambre.
    2. À l' extérieur du capot, fixer la chambre (orifice d' entrée) au tuyau de gaz (Figure 2A: 5a, b et c) pour atteindre le tube de gaz (8% d' O 2 , soit 0,5% de O 2) (figure 2A: 7). Ouvrez les deux ports de la chambre d'entrée et de sortie. A ce moment, le régulateur de gaz (Figure 2A: 4) doit rester fermé.
    3. Ouvrir la vanne de régulation de gaz (Figure 2A: 4). Flush pendant 4 min avec un débit d'air de 25 L / min pour remplacer complètement l'air dans la chambre.
    4. Après le rinçage de la chambre, fermer le régulateur de gaz, puis l'entrée et ousports tlet de la chambre.
    5. Débrancher le tuyau de sortie du débitmètre (figure 2A: 5c) de l'orifice d'entrée de la chambre et à mettre la chambre dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C.
    6. Remplacer l'air actuellement présent dans les assiettes, flacons et dissous dans le milieu de culture en remplissant la chambre avec le gaz 1 h après l'étape 2.1.3.
    7. Répéter les étapes 2.1.1 à 2.1.6 pour les autres compositions de gaz (par exemple, 2% d' O 2 pour le premier trimestre de la grossesse trophoblaste culture 9).
  2. Confirmer le pourcentage d'oxygène (figure 2B-C)
    1. Pour confirmer que la concentration d'oxygène dans le milieu de culture cellulaire (sans cellules) à l'intérieur de la chambre, en utilisant une électrode d'oxygène relié à un adaptateur d'oxygène. Connecter l'électrode d'oxygène à un voltmètre.
    2. Créer une courbe d'étalonnage dans la même solution ( par exemple, la culture cellulaire moyenne) en exposant la solution à gaz avec des teneurs en oxygène connues (par exemple, 0% et21% d'oxygène). Une fois que les valeurs se stabilisent pour chaque concentration, d'introduire l'électrode dans le milieu dans la chambre.
      Remarque: Prenez toutes mesures à la même profondeur afin d'éviter tout biais de la concentration en oxygène 10.
  3. Induction de normoxie et hypoxie / réoxygénation dans trophoblastes.
    1. Après avoir ajouté les cellules trophoblastiques primaires dans les flacons de culture cellulaire appropriés, des plaques ou des boîtes de Petri, effectuer des traitements selon les besoins.
    2. En parallèle, à l' intérieur de la chambre, exposer les cellules au mélange de gaz désiré pour reproduire une condition spécifique à chaque 24 heures (figure 3).

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Résultats

Isolement et immunopurification des cellules cytotrophoblaste villeux à partir d' un placenta à terme normaux obtenus par voie vaginale ont donné 1 x 10 8 cellules viables. Le placenta pesait 350 g, était de 19 cm de diamètre, 4 cm de haut avec forme discoïde et membranes transparentes. Aucune cotylédons malformation n'a été détectée. Le cordon ombilical avait localisation paracentral et une longueur de 56 cm. La pureté a été évaluée par cytométrie en flux en utilisant...

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Discussion

Chez les mammifères, le développement du foetus est directement dépendante de la fonction placentaire adéquate. Les origines développementales des troubles de santé sont fondées sur l'hypothèse que la cause des maladies qui se manifestent plus tard dans la vie peut être retracée au développement précoce et que le placenta a un rôle mécanique dans la programmation fœtale 30-32. Le placenta est le médiateur clé de la croissance et le développement du fœtus: il régule le transfert des nutriments, protège con...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Soutenu par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (n° 262011-2009) à CV et une subvention de recherche en sciences sociales et comportementales de la Marche des dix sous (#12-FY12-179) à CV et JTS ; par des bourses d’études à LSF du ministère de l’Éducation, de l’Enseignement supérieur et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) et de la Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, à SC du Réseau québécois en reproduction-CRSNG-FONCER, à l’AAHT des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et du FRQ-Santé, et au CPM du CRSNG ; grâce à une bourse du Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) et du Programme de bourses d’excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ciseaux incurvés MetzenbaumShandon9212matériel chirurgical (isolation cellulaire) (2 unités)
Pince à échardes fine 41/2 inFisherbrand13-812-42matériel chirurgical (isolation cellulaire) (2 unités)
Ciseaux 4.5 Str DissectionFisherbrand08-940matériel chirurgical (isolation cellulaire) (2 unités)
Éponge de gaze 10 cm x 10 cmCardinal Health
Plat de cuisson en verre oblongVerrerie1105397Pyrex (2,8 L)
Entonnoir BuchnerCoorstek Inc10-356EVerrerie (114 mm de diamètre)
Verre de montre  ;pyrex9985100EMDVerrerie
Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %Sigma-AldrichHT501128-4Lsolution fixatrice tissulaire histologique
Flacons trypsinisantsWheaton355395Verrerie (1 unité)
Tubes de culture jetablesKimble73750-13100Verrerie
Verre borosilicaté Pasteur Pipet (22,8 cm)FisherbrandK63B1367820Cverrerie
250 ml Béchers en verreFisherbrandKFS14005250Glassware
Bouteilles en verre avec bouchonFisherbrandKFS14395250Glassware (8 unités)
Tube Corex de 50 ml  ;Corning8422-A(1 unité)
Tube à centrifuger en polystyrène de 15 mlCorning430791
Tube à centrifuger en polystyrènede 50 ml Corning430829
10 ml Pipette sérologiqueCorning11415038
Cell Strainer 100 &mu ; m NylonCorning431752
AbsorbantLiner Scienceware1199918
500  ; ml Bouteilles Filtre supérieurCorningPore : 0.22  ; et micro ; m / medium et HBSS préparation
2 ml Flacons criogéniquesCorning430488
Conteneur de congélation, Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EA
Pompe péristaltiquePharmacia Fine ChemicalsP3 modèle
Bain d’eau agitéeFishermodèle 127
Pompe à videABM4EKFS6CX-4
Chlorure de sodiumFisherbrandEC231-598-3Solution saline 0,9 %
Hank' s Solution saline tamponnée (Hbss)Sigma-AldrichH2387Quantité : 9,25 (un flacon) pour 1 L de solution de digestion
Acide hydroxypipérazinéthansulfonique (Hepes)Life Technologies15630-08025 ml (1 M) pour 1 L de solution de digestion
Trypsine de type ISigma-AldrichT80039 888 U
Désoxyribonucléase de type IVRoche10-104-159-001402 000
U Chlorurede calcium Sigma-AldrichC4901100 mM
Sulfate de magnésiumBaker2500-01800 mM
Dulbecco' s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)Life Technologies10564-045
Pénicilline/Streptomycine SulfateHycloneSV30010
Sérum de bovin fœtalCorning35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644Densité gradient de milieu de centrifugation. Contenance : 36 ml
IsopropanolAcros42383-001050 ml
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich472301
Automacs  ;Miltenyi BiotecModèle 003
Automacs  ; Colonnes  ;Miltenyi Biotec130-021-101
Tampon de fonctionnement Automacs  ;Miltenyi Biotec130-091-221http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Solution de rinçage Automacs  ;Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Clone Purifié Hla Abc Anti-Humain W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82Anticorps anti-souris
Microbilles Iggde souris Miltenyi Biotec130048401
multiples -  ; 6 Puits Avec CouvercleCorning3335Surface de liaison
cellulaire Plaque à puits multiples -  ; 24 Puits avec couvercleCorning3337Surface de liaison
cellulaire Plaque à puits multiples -  ; 96 Puits avec couvercleCorning3300Surface de liaison de cellule
Chambre d’incubation modulaire  ;Billups-RothenbergMIC-101Un jeu de deux est nécessaire pour générer simultanément des conditions de normoxie et d’hypoxie/réoxygénation
Débitmètre uniqueBillups-RothenbergSFM3001
50 mm Filtre en ligneWhatman6721-5010PTFE, pores : 1.0 µ ; m
Régulateur de gazPro StarPRS301233Un ensemble de deux est nécessaire pour générer simultanément des conditions de normoxie et d’hypoxie/réoxygénation
Tuyau de gaz Classe Vi Clair 5/16  ;Parker100-050701023 pièces avec ~ 0,5 m
17 mm Collier de serrage de tuyau de gaz réglableAttachesTHCSS-16
Normoxia Cylindre  ;PraxairNI CDOXR1U-KTaille K (3rd Composition du trimestre : 5 % CO2, 8 % O2, Bal. N2)
Normoxia Gas Cylinder  ;PraxairNI CDOXR1U-KTaille K (3rd Composition du trimestre : 5 % CO2, 0,5 % O2, Bal. N2)
Microélectrode à oxygène Mi-730Microélectrodes INC84477
Microélectrodes adaptateurs d’oxygèneINC3572
ROS Réactif de détection : CM-H2DCFDA  ;InvitrogenC-400
&beta ;-hCG Kit ELISAnbsp ;DRG internationalEIA-4115
Anticorps purifié anti-VimentineeBioscience14-9897Hôte : souris
Anticorps anti-cytokératine 7 (FITC)  ;Abcamab119697Hôte : souris
Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-mousse IgG H& Anticorps LLife TechnologiesA-11029
361020733 Séparateur magnétique Plaque à puits

Références

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