Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Summary

Ce protocole décrit une méthode simple pour extraire et fractionner les transcrits des tissus végétaux sur la base du nombre de ribosomes liés. Il permet une estimation globale de l’activité de traduction et la détermination de l’état de traduction d’ARNm spécifiques.

Abstract

La traduction de l’ARNm en protéine est un processus biologique fondamental et hautement régulé. Le profilage des polysomes est considéré comme un étalon-or pour l’analyse de la régulation translationnelle. La méthode décrite ici est un moyen simple et économique de fractionner les polysomes de divers tissus végétaux. Un dégradé de saccharose est réalisé sans avoir besoin d’un créateur de dégradés en congelant séquentiellement chaque couche. Les extraits cytosoliques sont ensuite préparés dans un tampon contenant du cycloheximide et du chloramphénicol pour immobiliser les ribosomes cytosoliques et chloroplastiques en ARNm et sont chargés sur le gradient de saccharose. Après centrifugation, six fractions sont directement collectées du bas vers le haut du gradient, sans percer le tube d’ultracentrifugation. Pendant la collecte, l’absorbance à 260 nm est lue en continu pour générer un profil de polysome qui donne un aperçu de l’activité translationnelle globale. Les fractions sont ensuite regroupées pour préparer trois populations d’ARNm différentes : les polysomes, des ARNm liés à plusieurs ribosomes ; les monosomes, ARNm liés à un ribosome ; et les ARNm qui ne sont pas liés aux ribosomes. Les ARNm sont ensuite extraits. Ce protocole a été validé pour différentes plantes et tissus, notamment les semis et les plantes adultes d’Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum et les feuilles d’Oryza sativa.

Introduction

La synthèse des protéines est un processus essentiel et coûteux en énergie dans toutes les cellules ^1. Tout d'abord, les cellules doivent investir de l'énergie dans la production de la machine de traduction, les ribosomes. Par exemple, une cellule de levure divisant activement produit jusqu'à 2000 ribosomes par minute. Une telle production nécessite jusqu'à 60% de l'activité totale de la transcription et jusqu'à 90% de l'activité totale de raccordement de la cellule ^2. En outre, l'énergie est nécessaire pour la synthèse des acides aminés, des aminoacyl-ARNt et des liaisons peptidiques. Chez les plantes, l' ajout d' un acide aminé à un coût de la chaîne peptidique de 4,5 à 5,9 molécules d'ATP ^3. Par conséquent, il est peu surprenant que la traduction de l'ARNm de la protéine est un site majeur de la réglementation, notamment en matière de traitement des conditions environnementales changeantes.

L'étape d'initiation de la traduction, qui est l'association d'un ARNm avec le ribosome, est la cible principale de la régulation desTraduction ^4. En conséquence de la régulation de la traduction, ainsi que d' autres mesures réglementaires post-transcriptionnel, seulement 40% des variations de la concentration de protéine peut être expliquée par l'abondance d' ARNm ^5,6. Ainsi, l'étude de l'ARNm total donne relativement peu d'informations sur les protéines d'abondance. D'autre part, l'association de l'ARNm aux ribosomes donne une meilleure idée de l'abondance des protéines en donnant accès à ces ARNm impliqués dans la traduction. ARNm traduit activement sont associés à plusieurs ribosomes dans des structures appelées polysomes. A l'inverse, les ARNm mal traduits seront associés à un seul ribosome (monosome). Par conséquent, le statut de la traduction d'un ARNm peut être évaluée en surveillant son association avec les ribosomes ^7.

Ce protocole décrit l'isolement de polysomes de six jours plants âgés d' Arabidopsis thaliana, l'isolement ultérieur de l' ARN et l'analyse des résultats. Polysosomes et les monosomes sont séparés par un gradient de densité de saccharose. Dégradés sont recueillies en six fractions. Certaines des fractions sont réunies pour obtenir trois fractions bien séparées: polysomes, monosomes et la fraction légère (ci-après appelé surnageant), qui contient les libres 60S et 40S sous-unités ribosomiques et ARNm qui ne sont pas associés à des ribosomes. l'activité de traduction globale peut être évaluée en générant un polysomes rapport signal / bruit de monosome, qui est déterminé par intégration de l'aire sous la courbe, et en comparant les profils de polysomes. ARNm et les protéines sont ensuite extraits des différentes fractions et utilisées pour l'analyse par RT-PCR, la qRT-PCR, transfert de type Northern, puces à ADN, transfert ou protéomiques occidental. Ce protocole a été validé pour d'autres plantes et tissus.

L'équipement nécessaire pour effectuer ce protocole sont couramment dans la plupart des laboratoires: Il n'y a pas besoin d'une machine à gradient. Congélation chaque couche avant d'ajouter la suivante prévenirs de tout mélange ou de perturbation des couches. Aucun tube perforateur est utilisé pour la collecte de gradient qui peut être obtenue par immersion d'un tube capillaire en verre dans le gradient. Par conséquent, les tubes d'ultracentrifugation coûteux restent intacts et peuvent être réutilisés plusieurs fois. Collectivement, ce qui rend le présent protocole d'une méthode facile et pas cher pour le profilage polysomes.

Protocol

1. Préparation de 20 à 50% (p / v) de saccharose Gradients

Nota: Les gradients sont constitués de 4 couches de saccharose (50%, 35% et 2 couches de 20%) dans un tube d'ultracentrifugation 13,2 ml. Dans notre expérience, la coulée du saccharose à 20% en deux couches séparées améliore grandement la qualité des préparations de polysomes.

1. Préparer les solutions mères. Veiller à ce que toutes les solutions sont RNAse et DNAse libre.
   1. Préparer une solution saline 10X: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM de KCl et 100 mM de MgCl _2.
   2. Préparer 2 M sucrose Solution: Pour 200 ml, dissoudre 137 g de saccharose dans 1X solution saline.
2. Diluer la solution de saccharose dans une solution saline, telle que décrite dans le tableau 1, pour préparer les gradients. Les volumes sont donnés à six gradients.

La concentration finale en saccharose	saccharose 2M (ml)	Sel solution 1X (ml)	Vol final. (ml)
50%	8.8	3.2	12
35%	12.9	12.1	25
20%	7.4	17.6	25
20%	5.8	14.2	20

Tableau 1. Dilutions de la solution de sucrose pour préparer six gradients.

3. Verser les couches selon le tableau 2.

couche sucrose	50%	35%	20%	20%
Vol. (Ml)	1.85	3.65	3.65	1,35

Tableau 2. Volume de solution de saccharose par couche.

4. Après avoir versé chaque couche, garder les tubes dans un -40 ° C ou -80 ° C congélateur jusqu'à congélation complète avant d'ajouter la couche suivante de saccharose. La congélation est généralement atteint après 2 heures à -40 ° C, mais en attendant environ 6 heures avant de verser la couche suivante est recommandée. La dernière couche de 20% peut être congelé ou ajouté fraîchement le jour de l'expérience.
   Remarque: La congélation chaque couche avant d'ajouter le suivant empêche de tout mélange ou de perturbation des couches. Gradients peuvent être conservés dans un -40 ° C ou -80 ° C congélateur pendant au moins six mois.
5. Si elle n'a pas déjà été fait, ajoutez la dernière couche de 20% aux gradients le jour de l'expérience. Ensuite, laissez les gradients dégeler dans une chambre froide ou un réfrigérateur.

2. Préparation de cytosoliques Extraits

Note: Nous RECOMMmettre fin à l'aide de deux gradients par échantillon biologique. 300 mg est la quantité optimale de matériel végétal pour préparer deux gradients lorsque l'on travaille avec 6 jours plants âgés d' Arabidopsis thaliana. Lorsque l'on travaille avec moins de tissus traductionnelle actifs, la quantité de matière végétale peut être augmentée jusqu'à 600 mg.

1. Récolte de six jours vieux plants cultivés sur ½ Murashige et Skoog ⁸ supplémenté avec 1% de saccharose ou un document équivalent par congélation rapide dans de l' azote liquide
2. matériel végétal Grind dans un mortier et un pilon prérefroidi avec de l'azote liquide.
3. Peser 300 mg de matériau en poudre dans un plat de pesage prérefroidi. Effectuez cette étape rapidement pour éviter la décongélation de l'échantillon.
   Remarque: Conservez les échantillons congelés pour plus d'une semaine dans un -80 ° C congélateur.
4. Ajouter 2,4 ml de tampon de pré - refroidi polysomes (solution saline 4X, 5,26 mM d' EGTA, 0,5% (v / v) octylphénoxy poly (éthylèneoxy) éthanol, ramifiés, 50 μg.ml ^-1 cycloheximide, 50 μg.ml ¹chloramphénicol) et homogénéiser par mélange avec la pointe de la pipette. Transfert en deux tubes de 1,5 ml. Travaillez rapidement pour empêcher les échantillons de se réchauffer.
5. Centrifuger à 16 000 g pendant 15 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse pour sédimenter les débris.
   Remarque: Pour éviter la dégradation de l'ARN, toujours garder les échantillons à 4 ° C, utiliser RNase / DNase solutions gratuites et de travailler dans RNase / DNase conditions libres. L' héparine peut être ajoutée au tampon de polysomes, à une concentration finale de 300 μg.ml - ^1, pour renforcer la protection de l' ARN. Cependant, étant donné que l'héparine peut interférer avec l'analyse en aval, elle devra être enlevée pendant l'étape de précipitation de l'ARN en effectuant la précipitation du chlorure de lithium au lieu de précipitation à l'éthanol (voir note 4.7).

3. polysomes Profiling

1. Pipetter prudemment le surnageant sans perturber le culot. Si des fragments de plantes ont été pipetés, répétez l'étape 2.5. Chargez le surnageant au-dessus du gradient par pipettin doucementg sur la paroi latérale du tube dans un flux constant. Utilisez un gradient pour chaque tube de 1,5 ml.
2. Transfert à prérefroidi seaux et centrifuger à 175.000 xg pendant 2 h 45 min à 4 ° C, dans une ultracentrifugeuse (par exemple 32.000 rpm lors de l'utilisation d'un rotor SW41).
3. Mettre en place le système de collecte de gradient tel que décrit dans la figure 1. La cuvette UV a une longueur de trajet de 1 mm.

Figure 1. Le système de collecte de gradient. La cuvette UV est relié par un tube de chlorure de polyvinyle dans un tube capillaire en verre qui descend vers le bas de la pente. Le gradient progresse dans le système grâce à une pompe péristaltique. OD ₂₆₀ est continuellement lu et fractions de 2 ml sont recueillies. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandecette figure.

4. Réglez le collecteur de fraction à la température ambiante, et régler le carrousel à une vitesse qui permettra la collecte de fractions de 2 ml. Utiliser des tubes pré-refroidi collecte.
5. Collecter les fractions de bas en haut à l'aide d'un tube capillaire en verre relié par un tube de polychlorure de vinyle dans le système de collecte de gradient. Utiliser un film plastique de paraffine pour assurer la liaison entre le tube en chlorure de polyvinyle et le tube capillaire en verre.
6. Lire l'absorbance à 260 nm à partir du bas vers le haut du gradient. Lorsque l'ensemble du gradient est recueilli, placer les tubes de prélèvement sur la glace avant l'extraction de l'ARN.

4. Extraction de l'ARN

1. Réunir les fractions recueillies à partir de deux gradients, dans 50 ml plafonnés tubes de centrifugation, comme suit:
   Polysomes: fractions 1 à 3 (12 ml)
   Monosomes: fraction 4 (4 ml)
   Les fractions surnageantes: 5 et 6 (8 ml)
2. Pour chaque fraction, ajouter 1 vol. le chlorhydrate de guanidine 8M,50 pg de support de acryl et 1,5 vol. l'isopropanol.
   Note: Le support acrylique est l'acrylamide linéaire, utilisé en tant que coprécipitant pour améliorer la récupération des acides nucléiques lors de la précipitation à l'alcool.
3. Mélanger en retournant les tubes et précipiter O / N à -20 ° C.
4. Centrifuger à 175 000 g pendant 1 heure à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse (32.000 tpm dans un rotor SW32). Si l'étape de précipitation est effectuée dans un tube qui est incompatible avec l'ultracentrifugation, transvaser dans un tube approprié.
5. Rejeter le surnageant et on dissout le culot dans 200 ul de tampon TE sans RNase (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 à 1 mM d'EDTA). Transfert à un nouveau tube de 1,5 ml.
6. Extraire l'ARN par addition de 1 vol. l'eau phénol saturé (pH 6,6) et 1 vol. chloroforme: alcool isoamylique (24: 1). Mélanger vigoureusement. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 ml.
   Remarque: le phénol acide (pH 4,5) peut être utilisé afin de minimiser la contamination de l'ADN.
7. Précipiter l'ARN par addition de 1/10 volume. L'acétate de sodium 3 M et 3 vol. 100% d'éthanol. Autoriser la précipitation à -80 ° C pendant 20 min ou O / N à -20 ° C. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
   Remarque: Si vous utilisez l' héparine dans le tampon de polysomes (cf. note 2.5), effectuer un chlorure de lithium (LiCl) précipitation au lieu de la précipitation de l' éthanol pour éliminer correctement toute trace de l' héparine qui pourrait interférer avec l' analyse aval ^9. Après extraction, ajouter LiCl à une concentration finale de 2,5 M. Laisser la précipitation pendant 30 min à -20 ° C ou O / N à 4 ° C. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
8. Laver le culot avec 500 ul de 75% d'éthanol. Air sécher le culot et dissoudre dans un tampon TE 30 pl. Évaluer la qualité de l'ARN par électrophorèse sur un libre 1,2% gel d'agarose ARNase (100 V, 15 min) ou par des procédés d'électrophorèse capillaire.

Analyse 5. Données

1. données brutes à l'exportation vers un logiciel graphique et l'analyse des données.
   Remarque: Comme le montre la figure 2A et B, les profils premières donnent une information qualitative: le nombre de pics de polysomes qui peut être vu, la hauteur du pic de monosome, et la présence d'un épaulement correspondant aux sous - unités ribosomiques libres.
2. Fusionner les profils pour permettre la comparaison des profils entre les échantillons. Utilisez l'outil de lecture d'écran pour déterminer la valeur de X du pic de monosome pour chaque échantillon et aligner les pics de monosome en supprimant les points de données supplémentaires au début des courbes. Identifier le point de la courbe le plus bas et de déterminer sa valeur Y (en utilisant l'outil de lecture d'écran). Réglez la valeur la plus faible de Y points à 0 en utilisant la fonction "valeur de colonnes de jeu".
3. Déterminer le rapport polysomes / monosomes en intégrant la surface sous la courbe des profils bruts (figure 3C). Utiliser l'outil de sélection de données pour définir la limite de la zone à intégrer. Ensuite, utilisez la fonction d'intégrer (Analyse-mathématiques).
4. Normaliserles courbes à pic de monosome en divisant tous les points de données d'une courbe par la valeur Y du sommet du pic de monosome (déterminées en utilisant l'outil de lecture d'écran). Sélectionnez la colonne, puis sous Analyse-Mathématiques, sélectionnez Normaliser et choisir les méthodes "divisé par une valeur spécifiée". Cette étape permet de comparer le niveau relatif de polysomes (figure 3D).

Figure 2. profils de polysomes représentatifs. Type sauvage Arabidopsis thaliana (poids, écotype Col-0) et les plantules mutantes ont été cultivées pendant six jours sur ½ Murashige et Skoog sous photopériode de jours longs (lumière 16 h, 8 h sombres). A: profils de polysomes premières de semis wt. B: profils de polysomes premières provenant de plants mutants. C: Détermination du pourcentage de polysomes et monosomes par intégration de l'aire sous la courbe D: profi polysomesles normalisée au pic de monosome. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Results

Dans la littérature, les profils de polysomes sont souvent montrés à partir de la fraction légère de la fraction lourde en raison de la façon dont les gradients sont recueillis, à savoir du haut vers le bas. Etant donné que dans le protocole décrit ici les gradients sont collectées à partir du bas vers le haut, les profils que nous montrons commencent avec la fraction lourde (les polysomes) et aller à la fraction légère (sous - unités de ribosomes libres et ARN) (figure 2A).

Discussion

Le protocole que nous présentons ici est une méthode simple et peu coûteuse pour générer des profils de polysomes et isoler des ARNm associés à des polysomes, des ribosomes simples ou exempts de ribosomes. Un large éventail de méthodes différentes de fractionnement des polysomes est décrit dans la littérature. La méthode que nous avons décrite ici a été optimisée pour ne conserver que les composés nécessaires et a été adaptée au matériel végétal. En particulier, nous avons réduit la quantité de^détergent11 et a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube d’ultracentrifugation, paroi mince, polyallomère - 13,2 ml	Beckman Coulter	331372
Tube d’ultracentrifugation, paroi mince, polyallomère - 38,5 ml	Beckman Coulter	326823
Tube capillaire en verre	Drummond Scientific	1-000-1000
Ultracentrifugeuse  ;	Rotor d’ultracentrifugeuse Beckman Coulter	série
SW41	Rotor d’ultracentrifugeuse Beckman Coulter	331362
SW32	Beckman Coulter	369650
Pompe péristaltique	Tout
tube en polychlorure de vinyle Tygon R3607  ;	Fisher Scientific	070534-22	Tube en polychlorure de vinyle, 2,29 mm  ;
Collecteur de fractions Modèle 2110	Bio-Rad	731-8120
Cuvette UV	Hellma	170.700-QS	Cuvette à quartz à circulation
Spectrophotomètre UV	Varian	Cary50	Lire toutes les 0.0125 s
Tous les produits chimiques	N’importe quel		Utilisation uniquement Biologie moléculaire
Grade Murashige et Skoog Mélange de sels de base (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Eau sans RNASE	Toutes les
boîtes de Pétri Fisher	Scientific	10083251  ;
Octylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol, ramifié (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Acrylamide linéaire (support acrylique)	ThermoFischer scientific	AM9520	Support de précipitation d’ARN
OriginPro 8	Logiciel d’analyse OriginLab