Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Summary

Ce protocole décrit une méthode simple pour extraire et fractionner les transcrits des tissus végétaux sur la base du nombre de ribosomes liés. Il permet une estimation globale de l’activité de traduction et la détermination de l’état de traduction d’ARNm spécifiques.

Abstract

La traduction de l’ARNm en protéine est un processus biologique fondamental et hautement régulé. Le profilage des polysomes est considéré comme un étalon-or pour l’analyse de la régulation translationnelle. La méthode décrite ici est un moyen simple et économique de fractionner les polysomes de divers tissus végétaux. Un dégradé de saccharose est réalisé sans avoir besoin d’un créateur de dégradés en congelant séquentiellement chaque couche. Les extraits cytosoliques sont ensuite préparés dans un tampon contenant du cycloheximide et du chloramphénicol pour immobiliser les ribosomes cytosoliques et chloroplastiques en ARNm et sont chargés sur le gradient de saccharose. Après centrifugation, six fractions sont directement collectées du bas vers le haut du gradient, sans percer le tube d’ultracentrifugation. Pendant la collecte, l’absorbance à 260 nm est lue en continu pour générer un profil de polysome qui donne un aperçu de l’activité translationnelle globale. Les fractions sont ensuite regroupées pour préparer trois populations d’ARNm différentes : les polysomes, des ARNm liés à plusieurs ribosomes ; les monosomes, ARNm liés à un ribosome ; et les ARNm qui ne sont pas liés aux ribosomes. Les ARNm sont ensuite extraits. Ce protocole a été validé pour différentes plantes et tissus, notamment les semis et les plantes adultes d’Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum et les feuilles d’Oryza sativa.

Introduction

La synthèse des protéines est un processus essentiel et coûteux en énergie dans toutes les cellules ^1. Tout d'abord, les cellules doivent investir de l'énergie dans la production de la machine de traduction, les ribosomes. Par exemple, une cellule de levure divisant activement produit jusqu'à 2000 ribosomes par minute. Une telle production nécessite jusqu'à 60% de l'activité totale de la transcription et jusqu'à 90% de l'activité totale de raccordement de la cellule ^2. En outre, l'énergie est nécessaire pour la synthèse des acides aminés, des aminoacyl-ARNt et des liaisons peptidiques. Chez les plantes, l' ajo....

Protocol

1. Préparation de 20 à 50% (p / v) de saccharose Gradients

Nota: Les gradients sont constitués de 4 couches de saccharose (50%, 35% et 2 couches de 20%) dans un tube d'ultracentrifugation 13,2 ml. Dans notre expérience, la coulée du saccharose à 20% en deux couches séparées améliore grandement la qualité des préparations de polysomes.

1. Préparer les solutions mères. Veiller à ce que toutes les solutions sont RNAse et DNAse libre.
   1. Préparer une solution saline 10X: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM de KCl et 100 mM de MgCl _2.
   2. Préparer 2 M sucrose Solution: Pour 200 ml, dissoudre 137 g de saccharose dans 1....

Results

Dans la littérature, les profils de polysomes sont souvent montrés à partir de la fraction légère de la fraction lourde en raison de la façon dont les gradients sont recueillis, à savoir du haut vers le bas. Etant donné que dans le protocole décrit ici les gradients sont collectées à partir du bas vers le haut, les profils que nous montrons commencent avec la fraction lourde (les polysomes) et aller à la fraction légère (sous - unités de ribosomes libres et ARN) (figure 2A).

Discussion

Le protocole que nous présentons ici est une méthode simple et peu coûteuse pour générer des profils de polysomes et isoler des ARNm associés à des polysomes, des ribosomes simples ou exempts de ribosomes. Un large éventail de méthodes différentes de fractionnement des polysomes est décrit dans la littérature. La méthode que nous avons décrite ici a été optimisée pour ne conserver que les composés nécessaires et a été adaptée au matériel végétal. En particulier, nous avons réduit la quantité de^détergent11 et a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube d’ultracentrifugation, paroi mince, polyallomère - 13,2 ml	Beckman Coulter	331372
Tube d’ultracentrifugation, paroi mince, polyallomère - 38,5 ml	Beckman Coulter	326823
Tube capillaire en verre	Drummond Scientific	1-000-1000
Ultracentrifugeuse  ;	Rotor d’ultracentrifugeuse Beckman Coulter	série
SW41	Rotor d’ultracentrifugeuse Beckman Coulter	331362
SW32	Beckman Coulter	369650
Pompe péristaltique	Tout
tube en polychlorure de vinyle Tygon R3607  ;	Fisher Scientific	070534-22	Tube en polychlorure de vinyle, 2,29 mm  ;
Collecteur de fractions Modèle 2110	Bio-Rad	731-8120
Cuvette UV	Hellma	170.700-QS	Cuvette à quartz à circulation
Spectrophotomètre UV	Varian	Cary50	Lire toutes les 0.0125 s
Tous les produits chimiques	N’importe quel		Utilisation uniquement Biologie moléculaire
Grade Murashige et Skoog Mélange de sels de base (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Eau sans RNASE	Toutes les
boîtes de Pétri Fisher	Scientific	10083251  ;
Octylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol, ramifié (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Acrylamide linéaire (support acrylique)	ThermoFischer scientific	AM9520	Support de précipitation d’ARN
OriginPro 8	Logiciel d’analyse OriginLab