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Article de méthode

Préparation des colonies mono-cohorte et Traitement hormonal des travailleurs Honeybees à Analyser Physiologie Associé à Rôle et / ou le système endocrinien

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DOI :

10.3791/54240

⸱

6 septembre 2016

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Graduate School of Sciences, The University of Tokyo, 2Faculty of Pharmaceutical Sciences, Doshisha Women's College

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici notre protocole détaillé pour la préparation de colonies d'abeilles seule cohorte - un outil utile pour analyser le travailleur physiologie rôle associé. Nous décrivons également des protocoles détaillés pour traiter les travailleurs avec l'hormone juvénile et ecdysone pour évaluer l'implication de ces hormones dans la régulation du comportement et / ou de la physiologie des travailleurs.

Résumé

Les ouvrières sont engagées dans diverses tâches liées au maintien de l’activité de la colonie. Les tâches des travailleurs changent en fonction de leur âge (division du travail liée à l’âge). Les jeunes ouvrières allaitent le couvain (abeilles nourricières), tandis que les ouvrières plus âgées sont engagées dans la recherche de nectar et de pollen (butineuses). La physiologie des travailleurs change en association avec ce changement de rôle. Par exemple, la fonction principale des glandes hypopharyngées (HPG) passe de la sécrétion des principales protéines de la gelée royale (MRJP) à la sécrétion d’enzymes métabolisant les glucides. Étant donné que les tâches des ouvrières changent à mesure que les ouvrières vieillissent dans des colonies typiques, il est difficile de distinguer les changements physiologiques qui se produisent avec le vieillissement de ceux qui se produisent avec le changement de rôle. Pour étudier les changements physiologiques dans les tissus des ouvrières, y compris les HPG, en association avec le changement de rôle, il serait utile de manipuler la population de colonies d’abeilles mellifères en préparant des colonies à cohorte unique dans lesquelles les ouvrières presque du même âge effectuent des tâches différentes. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour préparer des colonies à cohorte unique pour cette analyse. Six à huit jours après la préparation d’une seule cohorte de colonies, les butineuses précoces qui effectuent les tâches de recherche de nourriture plus tôt que d’habitude apparaissent dans la colonie. Des résultats représentatifs ont indiqué des changements associés au rôle dans l’expression du gène HPG, suggérant une fonction HPG associée au rôle. En plus de manipuler la population de la colonie, l’analyse du système endocrinien est importante pour étudier la physiologie associée aux rôles. Ici, nous décrivons également un protocole détaillé pour traiter les travailleurs avec la 20-hydroxyecdysone (20E), une forme active d’ecdysone, et le méthoprène, un analogue de l’hormone juvénile. Des changements d’expression génique ont été observés en réponse à un traitement à l’E et/ou au méthoprène, ce qui suggère que les traitements hormonaux induisent des changements physiologiques des HPG. Le protocole de traitement hormonal décrit ici est approprié pour examiner les effets hormonaux sur la physiologie des travailleurs.

Introduction

L'abeille européenne, Apis mellifera, est un insecte eusocial avec une société hautement organisée 1. Abeilles travailleurs (caste de travail) sont engagés dans diverses tâches pour maintenir l' activité de la colonie, et ces tâches changent en fonction de l'âge de l'abeille des travailleurs après l' éclosion, qui est désigné comme division du travail 2-4 liée à l' âge. Les jeunes travailleurs (<13 jours old) prendre soin de la couvée dans la ruche en sécrétant la gelée royale (infirmières des abeilles), tandis que les travailleurs plus âgés (> 15 jours old) recueillent le nectar et le pollen à l' extérieur de la ruche (butineuses) 2-4. La physiologie des travailleurs change en association avec ce rôle changement. Par exemple, la fonction des glandes hypopharyngiennes (de HPG), jumelé glandes exocrines situées dans la tête, des changements en association avec le rôle passage de soins infirmiers à la recherche de nourriture 2,5. HPG infirmière d'abeilles synthétisent majoritairement des protéines majeures de la gelée royale, qui sont les principaux composants du lait d'abeille. D'autre part, HPG butineuses principalementla synthèse des hydrates de carbone, les enzymes du métabolisme tels que α-glucosidase III, pour traiter le nectar en miel en convertissant le saccharose en glucose et fructose. Nos études antérieures ont révélé que l'expression de mrjp2, qui code pour une protéine de gelée royale majeure, et Hbg3, qui code pour α-glucosidase III, les changements au cours du rôle déplacement 6-9.

Pour déterminer si les changements physiologiques dans les tissus des travailleurs, y compris les HPG, est associé au rôle décalage ou avec l'âge des travailleurs, il serait utile de manipuler la composition de la population d'une colonie d'abeilles, comme pour préparer une seule cohorte colonies dans lesquelles les travailleurs de presque le même âge effectuer différentes tâches 10,11. Robinson et al. (1989) ont décrit un procédé pour établir une colonie unique cohorte 10. colonies mono-cohorte comprennent d'abord une reine et 0-2 jour anciens travailleurs. Plusieurs jours après avoir établi les colonies, les travailleurs de almost le même âge assumer des tâches différentes. Certains travailleurs effectuent des tâches de soins infirmiers dans les colonies typiques, alors que d'autres travailleurs effectuent des tâches butinage plus tôt que d'habitude et sont donc appelés butineuses précoces. Comparaisons d'expression génique entre les infirmières et les abeilles butineuses précoces fournirait des informations utiles sur la physiologie de rôle associé à des tissus des travailleurs 12-16. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la préparation de colonies seule cohorte pour l' analyse de la physiologie de rôles et / ou associée à l' âge de 16 HPG. Nous avons également décrit brièvement comment examiner l'expression du gène de mrjp2 et Hbg3 par inversion quantitative réaction en chaîne par polymérase-transcription (RT-PCR) pour évaluer HPG physiologie.

En plus de l'analyse des travailleurs de la physiologie dans les colonies seule cohorte, l'examen du système endocrinien est important d'analyser les mécanismes de régulation de rôle associé travailleur physiologie. hormone juvénile (JH), qui est known comme l'hormone «statu quo» dans les larves d' insectes, accélère le changement dans le rôle de soins infirmiers à la recherche de nourriture chez les abeilles ouvrières 11. En outre, ecdysone, qui est connu comme l'hormone de mue durant la métamorphose, pourrait être impliqué dans le rôle de changement des gènes codant pour des molécules de signalisation de l' ecdysone sont exprimées dans les corps pédonculés, un centre supérieur du cerveau des travailleurs 17-19. Par conséquent, nous décrivons également le protocole détaillé utilisé dans notre étude précédente 16 pour traiter les travailleurs avec 20E, qui est une forme active de ecdysone, et méthoprène, un analogue de JH, pour l' analyse de l'effet du système endocrinien sur HPG physiologie (expression de et mrjp2 Hbg3).

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Protocole

1. Préparation des colonies mono-cohorte

  1. Préparer trois colonies d'abeille pour créer deux colonies une seule cohorte et pour obtenir un nombre suffisant de travailleurs nouvellement apparus.
    1. Vérifiez que certains pupes dans les cellules périphériques plafonnés dans les rayons ont des yeux bruns et une cuticule pigmentée en ouvrant les peignes coiffés à l'aide de pinces. Si ces pupes existent dans les cellules peigne périphériques, la plupart des pupes dans l'ensemble des peignes émergera dans environ 1-3 jours.
    2. Par la suite, de recueillir les rayons contenant ces pupes après toutes les abeilles adultes adhérentes ont été enlevées avec un pinceau, et mélanger des peignes des trois colonies pour réduire au minimum la variabilité entre les colonies.
  2. Placez les peignes collectés dans une boîte de ruche vide et incuber à 33 ° C dans des conditions humides (> 60% d'humidité relative). Collecter environ 6000 travailleurs nouvellement apparus sur 3 jours (3.000 travailleurs par colonie) des peignes collectés.
  3. Déterminer la quantité de workers sur la base du poids de cinq travailleurs nouvellement écloses recueillies au hasard à partir de colonies non manipulées.
    1. Peser cinq travailleurs nouvellement écloses recueillies au hasard à partir de colonies non manipulées à l'aide de machines de pesage.
      Note: Le poids de cinq travailleurs nouvellement émergé est généralement 500-600 mg.
    2. Estimer la quantité de travailleurs recueillies en divisant le poids des travailleurs recueillies par le poids moyen des cinq travailleurs nouvellement apparus.
  4. Appliquer des marques de peinture aux thoraces d'environ 1 800 travailleurs (900 travailleurs par colonie) en utilisant des marqueurs de peinture d'affiches à base d'eau.
    Note: marqueur Lavable qui est utilisé pour appliquer la peinture est listé dans la table des matières.
  5. Introduire une reine et environ 3.000 des travailleurs âgés 0-2 d'une journée à une nouvelle boîte de ruche qui contient deux peignes, un peigne contenant du miel et de pollen que les aliments conservés et un autre peigne vide pour la ponte de la reine. Recueillir le peigne contenant du miel et de pollen from une autre colonie intouchée après toutes les abeilles adhérentes sont enlevées.
    Note: L'utilisation de la boîte de ruche nucléaire (petite boîte de ruche moyenne) est recommandé.
  6. Collecter nourrices et butineuses précoces avec des marques de peinture 6 à 8 jours après la création de colonies seule cohorte.
    1. Pour collecter les abeilles nourrices, ramasser les travailleurs qui mettent leur tête dans les cellules de peigne pour prendre soin de la couvée. Utilisez des pinces pour recueillir les abeilles nourricières de peignes qui contiennent de nombreux travailleurs du couvain et des adultes.
      Remarque: Si HPG des travailleurs recueillies sont développés lorsque disséqués comme décrit à l'étape 1.7, ces travailleurs sont définis comme nourrices. Tenir les thoraces par des pinces est recommandé de ramasser les travailleurs des peignes.
    2. Pour collecter des butineuses, utiliser un filet pour capturer les insectes travailleurs qui retournent à leurs ruches avec des charges de pollen sur leurs pattes de derrière.
      Remarque: Si HPG des travailleurs capturés apparaissent rétrécis quand disséqués comme décrit à l'étape 1.7, les travailleurs sont définis comme butineuses.
  7. ClasSify le HPG en trois groupes, «développés», «intermédiaire» et «ratatinées» par la dissection sous un stéréomicroscope.
    1. Anesthetize 10-15 abeilles dans une cage d'insecte dans un réfrigérateur pendant 10-15 min jusqu'à ce que les abeilles ne peuvent pas voler ou marcher. Ensuite, déplacer les abeilles sur de la glace et de compléter l'anesthésie sur la glace pendant 5 min.
      Remarque: Il faut environ 15-20 minutes au total pour réaliser une anesthésie. Si le temps de l'anesthésie doit être raccourci, le nombre d'abeilles dans une cage devrait être réduite à 1-3 abeilles par cage.
    2. Disséquer la tête du corps avec des ciseaux et des pinces. Fixer la tête de cire dentaire placé sur une boîte de Pétri avec des épingles. Insérez deux broches dans les bases des antennes pour fixer la tête. Faire tremper les têtes fixes dans une solution saline insectes (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de CaCl2).
    3. Retirez la face antérieure de la cuticule de la tête en utilisant des pinces fines et un couteau chirurgical sous un microscope binoculaire.
      Remarque: Les HPG peuvent être facilement trouvés dans la tête après le retrait de cuticle. Le HPG est un organe botryoïde qui existe autour du cerveau dans la tête.
    4. Enlever le tissu trachéal qui est un tissu membraneux blanc sous la cuticule. Puis, disséquer les HPG de la tête en les tirant lentement avec des pincettes.
    5. Classez HPG avec acini grande et circulaire comme «développés». Classez HPG avec petites et déformées acini comme «ratatinées». Classifier HPG correspondant ni «Développé» ni «ratatinées» comme «intermédiaire».
      Note: les photographies représentatives qui montrent ces trois classes d'états HPG sont indiqués sur la figure 2.
    6. Sujet «développés» et HPG 'ratatinées' à l'extraction de l'ARN comme «infirmière abeille HPG» et «HPG butineuses», respectivement, et comparer l'expression des gènes dans les HPG entre les nourrices et les butineuses (section 4).

2. Injection de 20E

  1. Collecter nourrices de colonies typiques comme described dans la procédure 1.6.1.
    Remarque: HPG ne peuvent pas être examinées dans ces abeilles que les abeilles seront élevés.
  2. Anesthésier les abeilles à 4 ° C dans un réfrigérateur (et non sur la glace).
    Remarque: Il faut environ 30 minutes pour réaliser une anesthésie. Si le temps de l'anesthésie est raccourci, le nombre d'abeilles dans la cage doit être réduite à 1-3 abeilles par cage.
  3. En utilisant une pince à épiler, immobiliser les abeilles sur cire dentaire placés sur une boîte de Pétri.
  4. Injecter 1 pl de solution de 20E dans la face antérieure de la tête à l'aide d'une pointe d'injection faite à partir d'une micropipette capillaire calibré à l'aide d'un extracteur d'aiguille de verre.
    1. 20E se dissoudre dans une solution saline à l'éthanol insectes mélange (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de CaCl2) (1: 4) à 2,5 pg / pl.
    2. Branchez la pointe d'injection à un tube en caoutchouc, et connecter une pointe de micropipette jaune sur le côté opposé du tube.
    3. Placez 1 pi de solution de 20E sur parafilm en utilisant une micropipette, maintenez la pointe de micropipette jaune dans la bouche, und aspirer la solution dans la pointe d'injection.
    4. Insérez la pointe d'injection dans la base des antennes, et injecter la solution en soufflant à travers la pointe de micropipette jaune.
      Remarque: Le protocole indiqué dans cette étape est le procédé d'injection représentatif, mais l'utilisation de la machine d'injection automatique est recommandée pour la sécurité nécessaire 20.
  5. Rear les abeilles injectées dans des cages d'insectes à 33-36 ° C (la température idéale est de 35 ° C) dans des conditions sombres et humides (> 60% d'humidité relative) pour 1 ou 3 jours. mélange miel-eau électrique (1: 1) pour les abeilles. Si nécessaire, comptez survivre abeilles après l'injection.

3. Application de méthoprène

  1. Ramassez les peignes qui contiennent des pupes de colonies typiques après toutes les abeilles adultes adhérentes sont enlevées avec un pinceau. Incuber les peignes à 33-36 ° C (la température idéale est de 35 ° C) dans des conditions humides (> 60% d'humidité relative) pendant 1 jour.
  2. Collecter les abeilles nouvellement écloses des peignes collectés et appliquer des marques de peinture à leurs thoraces avec de la peinture d'affiche comme décrit dans le protocole de préparation des colonies mono-cohorte. Retour les abeilles marquées à leurs colonies.
  3. Après 6 jours, recueillir des travailleurs peints (âgés de 6 jours) à partir des colonies. Ramassez les travailleurs peints des peignes en tenant leurs thoraces avec des pincettes.
  4. Anesthésier les abeilles à 4 ° C dans un réfrigérateur (et non sur la glace) comme dans la procédure 2.2. En utilisant une pince à épiler, immobiliser les abeilles sur cire dentaire placés sur une boîte de Pétri et appliquer 1-5 pi de solution de méthoprène (50-250 ug / ul) dissous dans de l'acétone à leurs têtes à l'aide d'une micropipette. Utiliser un embout de filtre qui est résistant à l'acétone.
    Note: Acétone peut avoir des effets nocifs sur les abeilles conduisant à la mort. Si la forte mortalité des abeilles est observée, la réduction du volume de l'acétone à 1 ul au minimum est recommandée.
  5. Rear les abeilles dans des cages d'insectes à 33-36 ° C (le t idéalemperature est de 35 ° C) pendant 7 jours dans des conditions sombres et humides (> 60% d'humidité relative). mélange miel-eau électrique (1: 1) pour les abeilles. Si nécessaire, comptez survivre abeilles après application topique.
    Remarque: Dans cet article, les abeilles survivantes sont comptées 7 jours après l' application (tableau 3).

4. Extraction de l'ARN et RT-PCR quantitative

  1. Anesthetize abeilles et de disséquer HPG comme décrit dans les étapes 1.7.1 à 1.7.4.
  2. Ramassez les HPG disséqués dans un tube à centrifuger sur glace sèche et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  3. Ajouter 400 ul de réactif pour la dénaturation des protéines.
    Remarque: Ce réactif est disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
  4. Homogénéiser les tissus HPG utilisant une main tendue mélangeur électrique avec un pilon d'homogénéisation qui correspond à l'intérieur d'un tube de microcentrifugation. Homogénéiser à une vitesse de rotation d'environ 300 tours par minute pendant 1 minute sur de la glace pour briser les cellules des tissus et lysent.
    Note: Le mélangeur électrique à main est disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
  5. Ajouter 80 ul de chloroforme et bien mélanger. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  6. Centrifuger les tubes à centrifuger à 14170 xg pendant 15 min à 4 ° C. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter un volume égal d'isopropanol et 1 ul de glycogène (5 mg / ml). Incuber à -20 ° C pendant au moins 20 min.
  7. Centrifuger les tubes à centrifuger à 14170 xg pendant 10 min à 4 ° C et retirer le surnageant.
  8. Ajouter 400 ul de 75% d'éthanol au culot et bien mélanger, centrifuger les tubes à centrifuger à 14170 xg pendant 15 min à 4 ° C, et retirer le surnageant. Répétez ces procédures une fois de plus.
  9. Air-sécher la pastille pendant 5-10 minutes, puis le dissoudre dans 10 l'eau libre de RNase-ul.
    Remarque: Le séchage complet de la pastille peut provoquer une insolubilisation de la pastille d'ARN dans l'eau. Ainsi, le culot qui est légèrement humide est approprié pourdissolvante.
  10. Mesurer la concentration d'ARN en utilisant un spectrophotomètre tel que NanoDrop ou similaire.
  11. Traiter 500 ng d'ARN total avec 2,0 U de DNase I par incubation à 37 ° C pendant 30 minutes pour dégrader l'ADN génomique contaminant.
  12. Reverse-transcrire 200 ng d'ARN DNase I-traité et effectuer PCR en temps réel en utilisant des kits disponibles dans le commerce (voir la liste dans la table des matières et réactifs) et des amorces spécifiques du gène (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'et 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5 'TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3' et 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3 '). Effectuer la PCR comme suit: [95 ° C x 30 sec + (95 ° C x 5 sec + 60 ° C x 15 sec + 72 ° C x 20 sec) x 45-55 cycles].
  13. Normaliser la quantité de transcription avec celle du facteur d'élongation 1α-F2 (EF1α˗F2) ou protéine ribosomique 49 (rp49) 9,16,21,22. Ces gènes sont un contrôle fiable gènes pour l'analyse de l'expression génique dans les HPG en utilisant la qRT-PCR.
  14. Effectuer deux queues t-test pour détecter les différences significatives entre les deux groupes expérimentaux (abeilles nourricières vs butineuses précoces, les abeilles 20E traité contre les abeilles de contrôle, et les abeilles de méthoprène traité contre les abeilles de contrôle) en utilisant un logiciel statistique.
    Remarque: Si F-test suppose l'homogénéité de la variance, le test t de Student peut être utilisé. Dans le cas contraire, le test t de Welch, peut être utilisé.

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Résultats

Un aperçu du protocole de préparation des colonies mono-cohorte est illustrée à la figure 1A. Le cours du temps des expériences de préparation de colonies seule cohorte à un prélèvement d' échantillon est représenté sur la figure 1B. Les travailleurs qui ont satisfait aux critères de comportement pour le comportement de l' allaitement ou du comportement alimentaire ont été recueillies à partir des colonies mono-cohorte, et le développement HPG a ...

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Discussion

Préparation des colonies mono-cohorte

Ici , nous avons décrit le protocole utilisé dans notre étude précédente 16 pour préparer des colonies mono-cohorte pour l' analyse des HPG physiologie associée au changement dans le rôle des abeilles ouvrières. Abeilles infirmières et butineuses précoces qui ont satisfait aux critères décrits dans les procédures 1,6-1,7 et la figure 2 ont été observées dans les colonies une seule cohorte (tableau 1). Les ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique (B) et une subvention pour la recherche scientifique dans les domaines innovants 'Éthologie moléculaire des systèmes' du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (MEXT) du Japon. T.U. a reçu une subvention de la Société japonaise pour la promotion de la science pour les jeunes scientifiques.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
UNIPOSCACrayon MitsubishiPC-5MMarqueur pour l’application de marques sur les abeilles   ;
20-hydroxyecdysoneSigma AldrichH5142
MéthoprèneSigma Aldrich33375
Insecte de reproductionIRIS OHYAMACP-SS
Electromotion mixier  ;ISO23M-R25homogénéisation du
réactif TRIZoltissulaire Invitrogen15596-026le réactif pour l’extraction de l’ARN total
DNase I  ;Takara2270A
PrimeScript RT kit de réactifsTakaraRR037Ale réactif pour la transcription inverse
SYBR Premix ExTaq IITakaraRR820Ale réactif pour la PCR en temps réel
LightCycle 1.2 InstrumentRoche12011468001l’instrument pour la PCR en temps réel
LightCycle Capillaries (20&mu ; l)Roche4929292001le matériel pour la PCR en temps réel

Références

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