Un protocole est présenté pour la culture cellulaire de macrophages dérivés de monocytes humains différenciés par le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Le protocole utilise la cryoconservation des monocytes associée à leur différenciation en macrophages. Ensuite, les macrophages récoltés peuvent ensuite être ensemencés dans des puits de culture aux densités cellulaires requises pour la réalisation d’expériences.
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Article de méthode
Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés
Dans cet article
Résumé
Résumé
Un protocole est présenté pour la culture cellulaire de macrophages dérivés de monocytes humains différenciés par le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Pour l’initiation des expériences, des monocytes frais ou congelés sont cultivés dans des flacons pendant 1 semaine avec du M-CSF pour induire leur différenciation en macrophages. Ensuite, les macrophages peuvent être récoltés et ensemencés dans des puits de culture aux densités cellulaires requises pour la réalisation d’expériences. L’utilisation d’un nombre défini de macrophages plutôt que d’un nombre défini de monocytes pour initier des cultures de macrophages pour des expériences produit des cultures de macrophages dans lesquelles la densité cellulaire souhaitée peut être atteinte de manière plus constante. L’utilisation de monocytes cryoconservés réduit la dépendance à l’égard de la disponibilité des donneurs et produit des cultures de macrophages plus homogènes.
Introduction
L’étude de macrophages en culture est un modèle utile pour comprendre la fonction de ces cellules dans l’inflammation telle qu’elle se produit dans les plaques d’athérosclérose. Lorsque la recherche se concentre sur les maladies humaines impliquant des macrophages, il est utile d’étudier les macrophages humains primaires plutôt que les macrophages non humains pour éviter les différences entre les espèces. De plus, les effets de la transformation cellulaire peuvent être évités en utilisant des macrophages primaires plutôt que des lignées cellulaires de macrophages. À cette fin, les macrophages différenciés des monocytes isolés du sang humain servent de moyen d’obtenir des macrophages humains primaires.
Les macrophages tissulaires peuvent être soit résidents dans les tissus, soit dérivés de monocytes qui migrent dans le tissu et se différencient en macrophages 1. Deux types de macrophages dérivés de monocytes humains ont été définis, qui diffèrent non seulement par leur morphologie, mais aussi par l’expression des gènes et la fonction cellulaire 2. Ces deux types sont obtenus à partir de monocytes qui sont différenciés en macrophages en présence de M-CSF + sérum de veau fœtal (FBS) et de monocytes qui sont différenciés en macrophages en présence de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) + FBS 2-6. D’après notre expérience (observation non publiée), l’utilisation de sérum humain plutôt que de FBS génère le type GM-CSF, que M-CSF ou GM-CSF soit inclus dans le milieu de différenciation. Les macrophages de type M-CSF ont tendance à être plus allongés que les macrophages de type GM-CSF, qui ressemblent à des œufs au plat dans leur morphologie. Les chercheurs devraient reconnaître que les macrophages humains dérivés des monocytes M-CSF et GM-CSF ne sont pas les mêmes que les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris M1 et M2 6.
Au cours de recherches utilisant des macrophages différenciés M-CSF dérivés de monocytes humains, nous avons rencontré des difficultés liées à la disponibilité des monocytes pour initier des expériences et à la variation des densités cellulaires obtenues des macrophages lors de la différenciation des monocytes en macrophages. Pour surmonter ces problèmes, nous avons mis au point le protocole suivant dans lequel les monocytes sont congelés jusqu’à ce qu’ils soient utilisés et les monocytes sont différenciés en vrac en macrophages qui peuvent ensuite être retirés des flacons de culture et plaqués aux densités cellulaires souhaitées pour obtenir des cultures plus uniformes d’une expérience à l’autre.
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Protocole
La cytaphérèse a été réalisée dans le cadre du protocole de recherche d'un sujet humain approuvé par un National Institutes of Health Institutional Review Board.
1. Isolement et Cryoconservation des monocytes
- Obtenir des cellules mononucléaires par cytaphérèse de donneurs humains, et d' enrichir les monocytes par contre-courant continu élutriation de centrifugation des cellules mononucléaires telles que décrites dans les références 7,8. Obtenir environ 100 x 10 6 cellules décanté (environ 80 - 90% de monocytes) dans un tampon d'élutriation spécifié par le fabricant. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- monocytes centrifuger dans un tube de 15 ml de polypropylène à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension doucement les cellules dans du FBS suivi par le sulfoxyde de diméthyle pour obtenir une concentration finale de 90% de FBS / 10% de diméthylsulfoxyde et 50 x 10 6 cellules / ml.
- Ajouter chaque ml de suspension cellulaire to un cryovial individuel.
- Placer les cryotubes dans un récipient de congélation de cellules et les transférer vers un congélateur à -80 ° C pendant 24 h avant de les transférer vers un réservoir de stockage d'azote liquide cryofiole pour le stockage à long terme.
2. Différenciation de monocytes en Macrophages
- Décongeler un cryotube de cellules en transférant rapidement dans un bain-marie à 37 ° C, puis immédiatement après l'élimination de la suspension cellulaire a décongelé environ 70%.
- Immédiatement après décongélation complète à la température ambiante, transférer les 1 ml contenus cryovial dans 50 ml de 37 ° C réchauffé Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyenne avec 2 mM de L-glutamine, 50 ng / ml de M-CSF, 25 ng / ml interleukine-10 (IL-10) et 10% de FBS (milieu complet).
- Prélever 25 ml de suspension de monocyte dans chacun de deux flacons de 75 cm2 de culture cellulaire en plastique.
- Incuber les cultures à 37 ° C , une culture cellulaire incubateur avec 5% de CO2 / 95% d' air pendant 48 heures.
- Rincer la cultures 3 fois avec 10 ml de milieu RPMI 1640 (préchauffée à 37 ° C), en éliminant doucement le milieu de culture afin d'éviter de déloger toutes les cellules faiblement fixées.
- Après rinçage, ajouter un milieu complet frais, changeant moyenne tous les 2 jours jusqu'à ce que les monocytes se différencient et prolifèrent suffisamment pour devenir confluentes. Ce qui nécessite environ une semaine de culture.
3. Récolte Macrophages pour lancer des expériences
- Rincer les macrophages différenciés dans un ballon 3 fois avec 10 ml de pré-chauffé à tampon phosphate une solution saline de 37 ° C Dulbecco sans Ca2 + et Mg2 + avant d' ajouter 10 ml préchauffée acide trypsine éthylènediaminetétraacétique (EDTA) , solution à 37 ° C de 0,25%.
- Placer dans fiole de culture cellulaire incubateur pendant 10 - 15 min, à laquelle environ 90% des macrophages aurait arrondi et détaché. Vérifiez ceci par un examen microscopique du flacon.
- Ajouter 10 ml de RPMI 1640 contenant 10% de FBS à stop trypsinisation.
- Transférer la suspension cellulaire macrophage de la fiole dans un tube de polypropylene de 50 ml, centrifuger 300 g pendant 5 min, et jeter le surnageant.
- Resuspendre doucement les macrophages dans 1 ml de milieu complet.
- Mélanger 10 ul de suspension cellulaire avec 10 ul macrophage solution bleu Trypan et déterminer le nombre de cellules et la viabilité de macrophage (typiquement> 95%) en utilisant un hémocytomètre.
- Sur la base du comptage des cellules (habituellement environ 15 - 18 x 10 5 macrophages), ajouter un milieu complet supplémentaire pour atteindre la densité cellulaire d'ensemencement souhaitée. Note: 1 x 10 5 macrophages dans 1,5 ml de milieu par puits d'une plaque de 12 puits produira une culture quasi-confluentes.
- À la suite de l' ensemencement, les macrophages incuber pendant une nuit dans une culture de cellules C incubateur à 37 ° avec 5% de CO2 / 95% d' air pour permettre la fixation des cellules. Ensuite, commencer les expériences souhaitées.
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Résultats
La viabilité des monocytes frais ou cryoconservés est supérieure à 95% telle que déterminée par coloration au bleu Trypan 9. La figure 1 et la figure 2 compare à des grossissements inférieurs et supérieurs, respectivement, la progression de la différenciation des monocytes frais et cryoconservés ( par exemple, congelé) dans les macrophages. Notez que les frais comparé à monocytes cryoconservés montrent une sous-popula...
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Discussion
Génération types de macrophage définis peut clarifier certains des résultats contradictoires obtenus par les enquêteurs lors de l'étude de la biologie macrophage. L'utilisation de différentes conditions de culture et des facteurs de différenciation pour générer des macrophages humains primaires peuvent conduire à des types très différents macrophage, un fait qui ne peut être apprécié par le chercheur. Par exemple, les macrophages sont parfois produites à partir de monocytes humains en utilisant pas de sérum, le ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le Département de médecine transfusionnelle, Centre clinique, National Institutes of Health, a fourni des monocytes élutriés. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaque de culture Cellbind 12 puits | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, fiole T-75, traitement pour culture tissulaire | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 milieu de culture | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | chauffé à 37 ° ; C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Sérum fœtal bovin | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 ; | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial ; | Thermo Scientific ; | ||
| DPBS sans Ca2+ et Mg2+nbsp ; | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0,25 % Trypsine-EDTA ; | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml tube conique en polypropylène | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer hémicytomètre à lumière vive améliorée | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX congélation de cellules conteneur | BioCision | BCS-405 | d’autres conteneurs de congélation devraient également être adéquats pour cette étape |
| Système de stockage d’azote liquide, CryoPlus 1 | Thermo Scientific ; | 7400 | Tout réservoir d’azote liquide doit être adéquat |
Références
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Réimpressions et autorisations
