Nous avons collecté, coloré et imagé des cellules de la conjonctive du bord interne de la paupière de sujets humains. En caractérisant la morphologie cellulaire et l’activité métabolique, cette méthode peut approfondir notre compréhension de la sécheresse oculaire et du rôle que le frottement entre les surfaces oculaires peut jouer dans la perception de l’inconfort oculaire.
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Article de méthode
Impression cytologie de la zone d'essuie-glace du couvercle
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il existe peu de rapports sur l’anatomie cellulaire de la zone de l’essuie-glace de la paupière interne et un seul rapport utilise des méthodes cytologiques. L’optimisation d’une méthode de collecte, de coloration et d’imagerie des cellules de la région LW à l’aide de la cytologie d’empreinte (CI) est décrite dans cette étude. Les cellules sont prélevées sur la surface interne de la paupière supérieure de sujets humains à l’aide de membranes hydrophiles en polytétrafluoroéthylène (PTFE) et colorées avec des colorants cytologiques pour révéler la présence de cellules caliciformes, de mucines, de noyaux cellulaires et de divers degrés de pré- et de parakératinisation. Les colorants immunocytochimiques montrent une activité d’estérase cellulaire et des membranes cellulaires compromises par l’utilisation d’un microscope laser à balayage confocal. Jusqu’à 100 images numériques microscopiques sont capturées pour chaque échantillon et assemblées en une image haute résolution à grande échelle de l’ensemble de la portée du circuit intégré. Nous démontrons une sensibilité de la CI plus élevée que celle rapportée précédemment, appropriée pour identifier les morphologies cellulaires et l’activité métabolique dans la zone LW. À notre connaissance, c’est la première fois que cette sélection de colorants fluorescents est utilisée pour imager des membranes de circuits intégrés LW. Ce protocole sera efficace dans les études futures pour révéler des détails non documentés de la zone LW, tels que l’évaluation des particularités cellulaires des porteurs de lentilles de contact ou des patients atteints de sécheresse oculaire ou d’épithéliopathie par essuie-glace.
Introduction
La paupière supérieure humaine exécute environ 10.000 clignote chaque jour 1, avec seulement 1 - région conjonctival 2 mm étroite opposés du globe oculaire. En raison de son mouvement d'essuyage pendant le clignotement, cette partie de la marge de couvercle a été appelé le "couvercle essuie - glace" région 2. On suppose que le frottement est augmenté dans cette région pendant le clignotement habituelle, en raison du couvercle d'essuyage dans le monde entier. Cela peut jouer un rôle important dans le confort oculaire. Porteurs de lentilles de contact dans l' expérience particulière gêne oculaire et ceci est l' une des principales raisons pour cesser port des lentilles 3. Lorsqu'une lentille de contact est placée sur l'oeil, le coefficient de frottement entre le matériau de la lentille et la surface oculaire a été montré pour changer 4. Il existe des preuves pour suggérer que les symptômes de la sécheresse pourraient être liés à ce frottement modifié 2,5,6.
Cette association peut aussi se traduire par des phénomènes observables cliniquement, notamment couvercle wipar épithéliopathie (LWE), également appelé paupière supérieure marge coloration (ULMS) 6. LWE est un signe précoce d'irritation oculaire et un prédicteur potentiel de la maladie de l'oeil sec. On a observé et mesuré par la coloration vitale des régions de marge de couvercle supérieure et inférieure. Bien que ce système de classement 2 et sa validité clinique (c. -à- corrélation avec les symptômes subjectifs) sont encore en débat, gêne oculaire reste une énigme pour les cliniciens et les scientifiques et, surtout, un inconvénient pour les patients.
À ce jour, on sait peu sur les variations cliniquement pertinentes dans le (sous-) anatomie cellulaire et de la physiologie du couvercle zone d'essuie - glace 7 et un seul rapport fait appel à des méthodes cytologiques 8. Impression cytologie (IC) a été employé pendant plus de 40 ans pour recueillir des cellules de la surface épithéliale de la bulbaire ou conjonctive tarsienne par application d'une membrane 9,10. Lors de l'enlèvement, les cellules adhérentes subissent cytological coloration et d'imagerie microscopique. En raison des différences anatomiques et cellulaires de la région d'essuie-glace de couvercle, cette technique nécessite l'optimisation.
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Protocole
déclaration éthique: Avant de recueillir les cellules de sujets humains, le consentement éclairé et l'approbation de l'éthique doit être obtenue.
1. Préparer Stain
NOTE: Préparer la tache le jour de l'expérience.
- Ajouter 5 ul d'éthidium (ou 4 uM) et 5 pi de calcéine AM (ou 4 uM) à 2,5 ml de tampon phosphate salin (PBS) dans 15 ml tube de centrifugation; mélanger. Envelopper dans du papier d'aluminium pour protéger de la lumière et conserver à la température ambiante jusqu'à utilisation.
2. Cellules Collectionnez
- Retirer les inserts de culture cellulaire de leur emballage et l'étiquette pour chaque paupière à échantillonner. Indique l'orientation de prélèvement de cellules sur le côté du support en matière plastique de la membrane en utilisant un marqueur permanent. Conduite fente inspection de la lampe à un grossissement modéré (environ 20X) pour confirmer la santé appropriée de la région à subir IC.
- Déposer une goutte d'anesthésique topique (0,5% de chlorhydrate de proparacaine) dans le sac conjonctival inférieur de l'each oeil et demander des participants de garder les yeux fermés pendant une minute.
- Evert couvercle et oculaire supérieure maintenir en place par les cils; éviter tout contact avec la zone de couvercle d'essuie-glace.
Facultatif: l'aide d'un enquêteur secondaire peut être nécessaire pour effectuer cette étape. - Appliquer la membrane perpendiculairement à la partie centrale de la région d'essuie-glace de couvercle avec une pression minimale.
- Tenir membrane en place pendant 3 - 5 sec. Observer la membrane devient translucide dans la zone de contact. À ce stade, retirer délicatement la membrane et permettre le couvercle du participant de "flip" en place.
- appliquer rapidement une goutte de PBS à l'échantillon, pour l'empêcher de se dessécher. Membrane tournera translucide et ne doit pas devenir opaque à tout moment, car cela indique le séchage. Demandez à l'enquêteur secondaire procéder immédiatement au traitement d'échantillons (section 3).
- Procéder à l'enregistrement des yeux finale pour assurer l'intégrité de la conjonctive. Distribuer des lubrifiants oculaires et instruire participantpour éviter de se frotter les yeux jusqu'à ce que l'effet anesthésique se dissipe (env. 15 min).
Traitement 3. Sample
- Utilisation de micro-ciseaux, couper la membrane dans la moitié (moitié pour chacune des analyses en aval), perpendiculairement à travers le milieu de la collecte de cellules. Couper le long de la marge extérieure de la moitié de la membrane pour le séparer du support en plastique; éviter l'interaction avec les cellules recueillies sur la membrane, y compris veiller à ce que la membrane ne se replie pas sur elle-même.
- Fixer la membrane en utilisant une pince à épiler avant complètement détacher du support. Placer la membrane dans étiqueté tube de centrifugation de 2 ml contenant 500 pi de 95% (v / v) d'éthanol et laisser fixer pour un minimum de 20 minutes à un maximum de 2 heures avant le traitement (section 4.2).
- seconde moitié immédiatement séparée de la membrane (tel que décrit dans la section 3.2) et procéder rapidement à la section 4.1.
Coloration 4. Sample
- Immunocytochemical coloration
- Placez délicatement la membrane en 35 mm à fond de verre plat de la culture avec le côté de la collection vers le bas; assurer la membrane est plate.
- Pipette 20 pi de composition de teinture immunocytochimique assemblé à l'article 1 sur la membrane. Si enroule des échantillons, utiliser des embouts de pipette jetables pour aplatir soigneusement la membrane en poussant ses bords vers le bas. Éviter tout contact avec les zones de collecte de cellules.
- couvrir délicatement la membrane avec couvercle en verre de glissement. Évitez les mouvements inutiles de l'échantillon. Couvrir le plat avec couvercle et sceller avec le laboratoire de film sur les bords. Ne pas obstruer la transparence du plat (en haut et en bas) et la visibilité de l'échantillon. Étiquette avec le marqueur de laboratoire.
- procéder immédiatement à l'imagerie (section 5.1), puis revenir à la section 4.2 de continuer avec une coloration cytologique de l'autre moitié de la membrane.
- cytologique coloration
- Hydrater progressivement la membrane en ajoutant lentement 500 ul d'eau distillée dans le tube used pour la fixation dans la section 3.4. contenu plusieurs fois Aspirer dans la pointe de pipette pour mélanger, puis retirer le contenu.
- Ajouter 500 ul d'eau distillée. Laisser reposer pendant quelques secondes, puis retirez. Ajouter 500 pi de bleu alcian tache et laisser reposer pendant 3 min. Retirer les taches et effectuer 3 l'eau consécutive distillée 500 pi rinçages ou jusqu'à ce que le liquide de rinçage clair.
- Ajouter 500 pi de hématoxyline # 1 tache et laisser reposer pendant 3 min. Retirer les taches et effectuer trois consécutifs 500 pi rinçages à l'eau distillée ou jusqu'à ce que le liquide de rinçage clair. Déshydrater (inverse de la section 4.2.1) par aspiration le liquide clair.
- Ajouter 500 pi de Papanicolaou OG-6 tache et laisser reposer pendant 3 min. Enlever les taches et effectuer une 500 ul de 95% (v / v) rinçage à l'éthanol.
- Ajouter 500 pi de Papanicolaou EA-65 tache et laisser reposer pendant 3 min. Supprimer les taches et effectuer 3 consécutifs 500 ul de 95% (v / v) d'éthanol rinçages.
- déshydrater complètement en utilisant trois 500 ul à 100% d'éthanol rinçages consécutifs. Utilisation de tweezers, retirer l'échantillon de la solution; éviter les zones de collecte de cellules touchantes.
- Placer la membrane sur la lame de verre; faire en sorte que la ligne de collecte de cellules est parallèle ou perpendiculaire à coulisser marge pour faciliter l'alignement lors de l'imagerie.
- Appliquez une goutte de 100% d'éthanol et couvrir avec glissement de verre. procéder immédiatement à l'imagerie (section 5.2).
Imaging 5. Sample
- Imagerie de fluorescence immunocytochimiques Taches
- Utiliser un microscope confocal à balayage laser (CLSM) 11 ou un microscope à fluorescence 12, équipé d'une caméra couleur numérique, connecté à un ordinateur exécutant un logiciel d'acquisition d'images. En raison des échantillons étant contenu dans des boîtes de culture, d'un microscope inversé peut être nécessaire.
- Mettre en place un microscope 11,12 selon les spectres d'absorption et d' émission de éthidium homodimère-1 (528/617 nm des maxima Ex / Em , en présence d'ADN) et la calcéine AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
- Sélectionnez le plus faible grossissement du microscope (par exemple, l' objectif 2.5X) et activer le système d'imagerie numérique; observer l'échantillon affiché sur l'écran d'ordinateur.
- Inspecter l'échantillon pour les fonctions cellulaires d'intérêt.
- Sélectionner le grossissement désiré du microscope et acquérir des images à l'aide d'un logiciel d'imagerie.
- Enregistrer les fichiers dans les deux format de fichier natif microscope ou un format de fichier non compressé (par exemple, * .raw, * .tiff).
- Imaging cytologique Taches
- Utilisez un microscope standard champ lumineux de laboratoire sans filtre, équipé d'une caméra numérique couleur, relié à un ordinateur exécutant un logiciel d'acquisition d'image.
- Lieu et lame de verre serrure (de l'étape 4.2.8) sur la scène du microscope. Réhydrater échantillon avec 100% d'éthanol comme nécessaire, tout au long de la procédure d'imagerie.
- Sélectionnez le plus faible grossissement du microscope (par exemple, l' objectif 2.5X) et activer ee système d'imagerie numérique; observer l'échantillon affiché sur l'écran d'ordinateur.
- Assurer la collecte des cellules est aligné avec l'un des axes X ou Y de contrôle de la platine du microscope. Ajuster si nécessaire, en retirant la lamelle et la rotation de l'échantillon à l'aide d'une pipette ou d'une pince.
- En utilisant le logiciel d'imagerie, l'image (s) de capture de l'ensemble de l'échantillon ayant la plus faible grossissement du microscope.
- Passer à un grossissement de microscope modérée (par exemple, 10 - 20X objectif) et régler la source de lumière du microscope et des paramètres d'imagerie de logiciels (exposition, contraste, balance des blancs, etc.), et désactiver leur contrôle de logiciel automatisé. Enregistrer ces paramètres pour une utilisation future.
- Déterminer les points de balayage (par exemple, en haut à gauche et coins bas à droite de la collecte de cellules) début et de fin.
- En utilisant le logiciel d'imagerie, l'image (s) de capture de l'ensemble de la zone de collecte des cellules à l'intérieur des points de départ et de fin. Veiller à 20% d'un côté à côté et de haut en bas se chevauchent entreen toutes les images adjacentes.
- Enregistrer les fichiers en utilisant le format de fichier natif microscope ou un format de fichier non compressé (par exemple, * .raw, * .tiff).
- Générer image panoramique finale en utilisant un logiciel automatisé de couture de choix (par exemple, Adobe Photoshop Elements). Utiliser des images de référence prises à l'étape 5.2.5) pour confirmer l'exactitude de la couture automatisée dans l'image finale.
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Résultats
La membrane de culture cellulaire sur enjambé le support en plastique est un outil pratique pour recueillir l'ordinateur de poche des cellules épithéliales de la conjonctive couvercle d'essuie-glace. Ce procédé élimine le besoin d'instruments stérilisés supplémentaires généralement utilisés pour préparer et gérer les membranes de circuits intégrés. La figure 1 représente le circuit intégré de la zone d'essuyage de couvercle au moyen d' un insert de cu...
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Discussion
Impression cytologique est généralement effectuée sur la conjonctive bulbaire, en utilisant des membranes d'ester de cellulose mixte. Les échantillons sont coupés à la taille des feuilles de matériau en vrac, stérilisées, appliqué et retiré de la surface de la conjonctive à l'aide de pinces. En utilisant le même matériau de membrane, d' un dispositif à circuit intégré commandé par le piston a récemment été conçue pour correspondre à la géométrie de surface de la conjonctive bulbaire, et maintenir une pressio...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas de financement pertinent ou de conflits à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier notre collègue Dr. Jalaiah Varikooty qui a fourni des idées et une expertise sur le sujet de l’essuie-glace, ce qui a grandement aidé cette recherche.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bleu Alcian, 1 % dans 3 % d’acide acétique | Sigma | B8438-250ML | |
| Hématoxyline, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Coloration de Papanicolaou, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Coloration de Papanicolaou, Modifié EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Kit de viabilité/cytotoxicité vivante/morte | Technologies | L-3224 | contient de l’homodimère-1 d’éthidium et des colorants Calcein AM |
| Alcaine (0,5 % de chlorhydrate de proparacaïne) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 ; mm, PTFE hydrophile, 0,4 ; et micro ; m | EMD Millipore | PICM01250 ; | |
| Plats à fond en verre de 35 mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Références
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Réimpressions et autorisations
