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Article de méthode

Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain

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DOI :

10.3791/54264

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12 septembre 2016

 ,  ,  ,  , 
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

Dans cet article

Résumé

Le but de ce manuscrit est de présenter une méthode de mesure de la phagocytose des monocytes et des granulocytes et de l’activité oxydative dans des échantillons de sang humain.

Résumé

Le test de phagocytose des granulocytes et des monocytes et de l’activité oxydative (OB) peut être utilisé pour étudier le système immunitaire inné. Ce manuscrit fournit la méthodologie nécessaire pour ajouter ce test à un arsenal d’immunologie d’exercice. La première étape de ce test consiste à préparer deux aliquotes (« H » et « F ») de sang total (héparine). Ensuite, du dihydroéthidium est ajouté à l’aliquote H, et les deux aliquotes sont incubées dans un bain d’eau chaude suivi d’un bain d’eau froide. Ensuite, Staphylococcus aureus (S. aureus) est ajouté à l’aliquote H et S. aureus marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine est ajouté à l’aliquote F (bactérie :phagocyte = 8:1), et les deux aliquotes sont incubées dans un bain d’eau chaude suivi d’un bain d’eau froide. Ensuite, du bleu de trypan est ajouté à chaque aliquote pour éteindre la fluorescence extracellulaire, et les cellules sont lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, les globules rouges sont lysés et les globules blancs sont fixés. Enfin, un cytomètre en flux et un logiciel d’analyse approprié sont utilisés pour mesurer la phagocytose des granulocytes et des monocytes et l’activité des OB. Ce test est utilisé depuis plus de 20 ans. Après un effort intense et prolongé, les athlètes ressentent une augmentation significative mais transitoire de la phagocytose et une diminution prolongée de l’activité OB. L’augmentation de la phagocytose après l’exercice est corrélée à l’inflammation. Contrairement aux individus de poids normal, la phagocytose des granulocytes et des monocytes est chroniquement élevée chez les participants en surpoids et obèses, et est modestement corrélée avec la protéine C-réactive. En résumé, ce test basé sur la cytométrie en flux mesure la phagocytose et l’activité OB des phagocytes et peut être utilisé comme mesure supplémentaire de l’inflammation induite par l’exercice et l’obésité.

Introduction

Le granulocytes et des monocytes phagocytose / oxydatif (OB) dosage de l' activité est une technique simple, straight-forward qui est fréquemment utilisé pour recueillir des informations sur la fonction immunitaire innée après un exercice prolongé et intensif. 1-4 Lors de l' étude de la réponse du système immunitaire à un stimulus, les granulocytes et les monocytes sont d' un intérêt particulier parce qu'ils jouent un rôle central dans la défense de l' hôte et sont les premières cellules immunitaires à accumuler sur le site de l' infection. 5 neutrophiles, un type de granulocytes, sont les premières cellules à translocation dans le muscle endommagé tissus après un exercice intensif. 6 phagocytose et l' activité de l' OB sont les mesures les plus courantes de granulocytes et des monocytes fonction, 7 et sont préférés comme des indicateurs de la fonction immunitaire innée des cellules en raison de leur rôle central tant dans le processus d'infection et le processus de réparation.

L'essai décrit dans ce utili manuscritzes un flux de base cytomètre pour fournir une détermination quantitative des granulocytes et des monocytes phagocytose et l'activité OB dans le sang total. L'utilisation du sang entier dans cette technique est avantageuse car elle permet le dosage à effectuer, sans un procédé de purification du temps. Ce test peut être facilement modifié pour accueillir une variété de modèles de recherche et des capacités de laboratoire. Par exemple, Liao et al. A utilisé une technique similaire pour montrer que l' activité neutrophile OB est augmentée et neutrophiles phagocytose est diminué suite à une lésion cérébrale traumatique. 8 Dans un autre exemple, McFarlin et al. Décrit une modification élégante de cette technique qui utilise allophycocyanine (APC ) conjugué à CD66b et tandem haute performance APC conjugué étiquetage CD45 avec cytométrie en flux à base d'images pour classer les granulocytes en termes de leurs activités de phagocytose et OB. 7,9

Notre groupe de recherche a utilisé diverses adaptations de ce technique comme un indicateur de la fonction immunitaire innée chez les populations en surpoids, obèses, et athlétiques depuis près de 20 ans. 10,11 Le texte ci - dessous fournit au lecteur des instructions étape par étape pour effectuer ce test et mettre en évidence les zones que le lecteur peut adapter pour répondre aux besoins de leur recherche.

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Protocole

NOTE: Toutes les procédures de collecte de sang ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices énoncées par l'Appalachian State University Board Review (ASU) Institutionnel (CISR).

1. Assay Préparation

  1. Recueillir, préparer et organiser les matériaux spécifiés pour la procédure (s'il vous plaît se référer au tableau des matériaux spécifiques / Équipement).
    1. Étiquette 12 x 75 mm tubes.
      1. Étiquette deux tubes pour chaque participant: un tube pour l'essai de phagocytose (étiqueter ce tube avec de l'encre noire et un «F» pour l'isothiocyanate de fluorescéine [FITC]) et un tube pour le dosage de l'activité de l'OB (étiqueter ce tube avec de l'encre rouge et un " H "pour dihydroethidium [HE]).
        NOTE: L'utilisation de 12 x 75 tubes stériles mm est recommandé de réduire au minimum l'activation cellulaire involontaire et l'augmentation associée dans le bruit de fond.
      2. Etiqueter trois tubes pour les contrôles de dosage: un tube pour l'essai de phagocytose (contrôle FITC: étiquette de ce tube avec black encre et un «F»), un tube pour le dosage de l'activité de l'OB (HE contrôle: étiqueter ce tube avec de l'encre rouge et un «H»), et un tube pour le contrôle négatif (Blood seulement: étiqueter ce tube avec de l'encre verte et «sang seulement»).
    2. Préparer des solutions mères d'au moins un jour avant le jour de l'essai.
      1. Préparer la solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Diluer 100 ml de 10x PBS avec 900 ml de 18,2 MQ H 2 O. Stériliser par filtration avec un filtre de 0,2 um. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      2. Préparer le PBS-glucose stérile. Dissoudre 1,0 g de glucose dans 100 ml de PBS. Stériliser par filtration avec un filtre de 0,2 um. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      3. Préparer le tampon citrate 0,1 M stérile. Dissoudre 1,2 g d'acide citrique et 1,1 g de citrate de sodium dans 100 ml de H 2 18,2 MQ O. Ajuster le pH à 4,0. Stériliser par filtration avec un filtre de 0,2 um. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      4. Préparer la solution mère HE. Resuspend 1,0 mg de SE dans 1,0 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Mélanger doucement, aliquote et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
      5. Préparer le FITC Staphylococcus aureus (S. aureus) solution mère (2 x 10 9 particules / ml). Resuspendre 10 mg de FITC S. aureus dans 1,5 ml (ou quantité appropriée) de PBS. Diviser en trois 500 aliquotes et sonication selon la recommandation du fabricant. Aliquoter et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
      6. Préparer le S. non marqué solution mère aureus (2 x 10 9 particules / ml). Resuspendre 100 mg de S. non marqué aureus dans 15 ml (ou quantité appropriée) de PBS. Diviser en trente 500 aliquotes et sonication selon la recommandation du fabricant. Aliquoter et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
    3. Préparer des solutions de travail fraîches le jour de l'essai.
      1. Préparer la solution de travail HE. Transférer 10 pl dedécongelé HE solution mère à 990 pi de PBS-glucose. Protéger de la lumière et de garder sur la glace jusqu'à utilisation.
      2. Préparer le S. FITC solution aureus travail (133.333 particules / ul). Transfert 70 pi de décongelé S. marqué au FITC aureus solution mère à 980 pi de PBS. Protéger de la lumière et de garder sur la glace jusqu'à utilisation.
      3. Préparer le S. non marqué solution aureus travail (133.333 particules / ul). 70 pl de transfert S. décongelé non marqué aureus solution mère à 980 pi de PBS. Protéger de la lumière et de garder sur la glace jusqu'à utilisation.
      4. Préparer la solution de trempe. Ajouter 750 ul d'une solution de bleu trypan à 0,4% de 11,25 ml de tampon citrate 0,1 M stérile. Conserver dans un bain d'eau glacée jusqu'à utilisation.
    4. Avoir un phlébotomiste certifié prélever du sang selon les directives de l'Organisation mondiale de la santé pour le prélèvement de sang.
      1. Prélever le sang dans un tube de 4 ml de collecte de sang contenant de l' EDTA K 2. DansTube de prélèvement de sang vert selon les instructions du fabricant. Gardez le tube de collecte de sang à la température ambiante sur une bascule paillasse jusqu'à utilisation. Utilisez ce sang pour la numération globulaire complète (CBC) avec l'analyse des globules blancs (WBC) différentiel décrit à l'étape 1.2.1.
      2. Prélever le sang dans le tube de collecte d'un 4 ml de sang contenant l'héparine de lithium. Invertir le tube de prélèvement de sang selon les instructions du fabricant. Gardez le tube de collecte de sang à la température ambiante sur une bascule paillasse jusqu'à utilisation. Utilisez ce sang pour le dosage des monocytes et des granulocytes phagocytose et l'activité OB décrit à l'étape 2.
  2. Déterminer la quantité de bactéries ( par exemple, S. aureus) qui seront nécessaires pour effectuer l'essai pour chaque échantillon.
    1. Utiliser un analyseur d'hématologie pour effectuer une analyse de SRC leucocytaire du sang, comme décrit dans les instructions du fabricant. Prenez note de la numération des globules blancs (dans les cellules / ml),% des neutrophiles, et%Les valeurs de monocyte.
    2. Utilisez les équations ci-dessous pour déterminer les neutrophiles et les monocytes compte pour chaque échantillon.
      Numération des neutrophiles (dans les cellules / ml) =% Neutrophiles x WBC (en cellules / ml)
      Numération des monocytes (en cellules / ml) =% Monocyte × WBC (en cellules / ml)
    3. Utiliser les équations ci-dessous pour déterminer le nombre de phagocytes pour chaque échantillon et le nombre de phagocytes présents dans 100 ul d'échantillon.
      Comptage des phagocytes (en cellules / ml) = nombre de neutrophiles (en cellules / ml) + nombre de monocytes (en cellules / ml)
      Nombre de phagocytes dans 100 pl = (nombre de phagocytes (en cellules / ml)) / 10
    4. Utiliser l'équation ci - dessous pour déterminer le nombre de bactéries ( par exemple, S. aureus) nécessaires pour chaque échantillon et la quantité de FITC S. aureus ou non marqué S. solution aureus travail (133.333 particules / ml) qui devrait être ajouté à chaque tube.
      NOTE: La bactérie cible: rapport phagocyte est de 8: 1.
      Nombre de bactéries nécessaires =Nombre de phagocytes dans 100 pi x 8
      Volume de la solution de travail non marqué au FITC ou au besoin (en ul) = (nombre de bactéries nécessaires) / (particules 133.333 / pl)

2. Effectuez Assay

  1. Préparer du sang entier pour le dosage.
    1. Pour chaque tube de participant et de contrôle, en utilisant une pointe de pipette longueur étendue pour transférer 100 pi de sang entier à partir du tube de collecte de sang héparine de lithium au fond d'un tube étiqueté de façon appropriée de 12 x 75 mm. Replacer les bouchons.
      NOTE: Soyez prudent pour éviter d'avoir du sang sur les côtés des 12 x 75 mm tubes.
    2. Utilisez un micropipette pour ajouter 10 ul de solution aux tubes marqués à l'encre rouge et un «H», y compris le tube de commande HE HE travail. Replacer les bouchons et brièvement vortex.
    3. Incuber tous les tubes dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Ensuite, transférer immédiatement tous les tubes dans un bain d'eau glacée pendant 12 min.
      REMARQUE: Utilisez un rack métallique ouvertet secouez doucement la crémaillère toutes les 5 minutes pour assurer que les tubes sont rapidement et adéquatement chauffés ou réfrigérés.
  2. Ajouter des bactéries ( par exemple, S. aureus) aux tubes d'échantillon et de contrôle.
    1. Utilisez un micropipette pour ajouter le montant approprié (calculé à l' étape 1.2.4) de S. non marqué la solution de travail aureus aux tubes marqués à l' encre rouge et un «H», y compris le tube de commande HE. Replacer les bouchons et brièvement vortex.
    2. Utilisez un micropipette pour ajouter le montant approprié (calculé à l' étape 1.2.4) de FITC S. la solution de travail aureus aux tubes marqués à l' encre noire et un «F», y compris le tube de commande FITC. Replacer les bouchons et brièvement vortex.
    3. Vortex le «sang seulement" tube de commande, mais ne pas ajouter les deux types de bactéries (ie, S. aureus) à elle.
    4. Incuber tous les tubes dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 20 min. Utilisez un support en métal ouvert et secouez doucement la crémaillère toutes les 5 minfaire en sorte que les tubes sont réchauffés rapidement et de manière adéquate. Après la période d'incubation, transférer immédiatement les tubes dans un bain d'eau glacée pendant 1 min.
  3. Laver les cellules.
    1. Utiliser une pipette de répéteur pour ajouter 100 pi de solution de trempe glacée à tous les tubes. Replacer les bouchons, vortex brièvement, puis incuber tous les tubes sur la glace pendant 1 min.
    2. Utiliser une pipette à répétition pour ajouter 1 ml de PBS glacé à tous les tubes. Vortex brièvement, puis ajouter un 2 ml supplémentaires de PBS glacé à tous les tubes et remplacer bouchons. Centrifuger tous les tubes pendant 5 min à 4 ° C et 270 x g, puis aspirer le surnageant.
    3. Répétez l'étape 2.3.2 une fois (total de 2 lavages).
  4. Préparer les échantillons pour la cytométrie de flux.
    1. Utiliser une pipette à répétition pour ajouter 50 pi de sérum de veau fœtal glacé à tous les tubes. vortex brièvement tous les tubes.
    2. Transférer tous les tubes à un carrousel approprié et utiliser une lyse cellulaire préparation poste de travail automatisé avec le rouge de sang cell (RBC) et WBC des réactifs de lyse pour lyser les globules rouges et fixer des globules blancs comme décrit dans les instructions du fabricant de fixation.
    3. Après la lyse cellulaire préparation poste de travail exécution automatique est terminée, envelopper les tubes dans une feuille d'aluminium et conserver dans un 4 ° C jusqu'à ce que le réfrigérateur cytométrie analyse peut être effectuée.

3. Acquisition de cytométrie en flux

  1. Installer le système de cytométrie en flux.
    1. Réchauffez cytométrie de flux système comme indiqué dans le mode d'emploi fourni par le fabricant. Ensuite, vérifiez les niveaux de réactifs et de réservoirs de déchets. Si nécessaire, remplir les réservoirs de réactifs et / ou vider le réservoir de déchets.
    2. Utilisez la fonction "Panel Clean" pour exécuter le système cycle de nettoyage. Ensuite, lancez l'alignement et de vérification des fluidics fluorosphères, et veiller à ce que le coefficient demi-pic de variation (HPCV) pour chaque détecteur est dans la plage prédéfinie décrite dans le contrôle de la qualité (QC) protocoles fournis par la fabricationr.
  2. Créer acquisition spécifique à dosage et les protocoles de réglage de l'instrument.
    1. Créer des protocoles d'acquisition spécifiques à essai pour les phagocytose et l'activité OB essais.
      REMARQUE: Les protocoles d'acquisition décrits ici peuvent être adaptés pour une utilisation sur un cytomètre de flux avec un laser bleu (488 nm), un filtre (530/30) pour FITC, et un filtre (575/26) pour HE.
      1. Ouvrez cytométrie de flux logiciel d'acquisition de système et de créer un "nouveau protocole".
      2. Choisissez l'option "FL1 Paramètre" pour le dosage de la phagocytose (FITC) et le "FL2 Paramètre" pour le dosage de l'activité de l'OB (HE).
      3. Créer les parcelles (ie, diffusion vers l' avant [FSC] vs. diffusion latérale [SSC] tracé de points, FL1 histogramme, FL2 histogramme) nécessaire pour l' acquisition.
      4. Créer des régions polygonales pour le WBC (cellules de globules blancs), les populations de granulocytes et de monocytes sur le terrain SSC FSC vs et créer des régions linéaires sur les histogrammes FL1 et FL2. Set a & #34; empêchez le comte »de 50.000 événements pour la porte WBC.
      5. Enregistrer les protocoles avec des noms spécifiques à l'essai.
    2. Créer des protocoles fixant instruments spécifiques à essai pour les phagocytose et l'activité OB essais.
      1. Glissez et déposez les "protocoles spécifiques essai d'acquisition» (définies à l'étape 3.2.1) de la "Explorateur de ressources» à la «Acquisition Manager» à la cytométrie de flux logiciel d'acquisition du système.
        REMARQUE: Les informations ajoutées de cette façon apparaîtra toujours à la fin de la liste de travail.
      2. Entrez les informations échantillon dans la liste de travail, et enregistrez le worklist.
      3. Retirer les tubes échantillons de commande du réfrigérateur à 4 ° C et les laisser revenir à température ambiante pendant 15 min. Puis, vortex brièvement chaque tube d'échantillon témoin.
      4. Utilisez les «protocoles d'acquisition spécifiques à dosage" définis à l' étape 3.2.1 pour exécuter l'échantillon témoin négatif (c. -à- sang seulement) et le contrôle positiféchantillons (c. -à- HE contrôle, le contrôle FITC) à travers le système de cytométrie de flux. Examiner les histogrammes et régler le tube photomultiplicateur (PMT) tensions de la phycoérythrine (PE) canaux FITC et au besoin.
      5. Vortexer les échantillons témoins et les transférer vers le carrousel de cytométrie en flux système selon l'ordre de la liste de travail. Ensuite, placez le carrousel dans la chambre d'échantillonnage, puis cliquez sur la barre d'outils bouton cytomètre "Démarrer" pour acquérir des données pour les échantillons de contrôle. Enregistrez le "xxx Réglage Pro" protocole de réglage.
  3. Acquérir des échantillons d'étude sur le système de cytométrie de flux.
    1. Retirer l'échantillon à l'étude des tubes du réfrigérateur à 4 ° C et le laisser se stabiliser à température ambiante pendant 15 min.
    2. Bien que les échantillons sont équilibrant, faites glisser les protocoles d'acquisition spécifiques de l'étude prédéfinis à l'espace worklist de faire une liste de travail du projet.
    3. Vérifiez que le "protocole de réglage" est lié à la &# 34;. Protocoles de réglage spécifiques de dosage »définis à l' étape 3.2.2 Ensuite, entrez les informations d' identification (par exemple, le nom de l' étude, dessiner, numéro de visite, sous réserve ID) pour chaque tube dans la liste de travail.
    4. Après la période d'équilibration de 15 minutes, les échantillons d'étude de vortex et les transférer vers le carrousel de cytométrie en flux système selon l'ordre de la liste de travail. Ensuite, placez le carrousel dans la chambre d'échantillonnage, puis cliquez sur la barre d'outils bouton cytomètre "Démarrer" pour acquérir des données pour les échantillons de l'étude.
    5. Examiner la qualité des données en inspectant l'efficacité de lyse RBC et la distribution des sous-groupes de cellules WBC, des proportions, des valeurs absolues, et les intensités de fluorescence sur le panneau de chaque échantillon de rapport.
      NOTE: La qualité des données est considérée comme acceptable si tous ces critères sont dans leurs limites prédéfinies. Si tous les critères ne sont pas remplies, l'échantillon doit être retraité.
    6. Nettoyer et arrêter le système de cytométrie de flux. Rangez la cytométrie de fluxles données sur les deux disques informatiques différents pour prévenir la perte accidentelle de données.

Analyse 4. Données

  1. Effectuer l'analyse de phagocytose.
    1. Consolidez tous les phagocytose (ie, F-étiqueté) des données de mode d'échantillonnage et la liste de contrôle (LMD) des fichiers de données dans un seul dossier. Ensuite, ouvrez cytométrie de flux logiciel d'analyse et faites glisser les fichiers dans l'espace de l'échantillon.
    2. Réglez le WBC, granulocytes, monocytes et lymphocytes portes.
      1. Double-cliquez sur le nom du fichier à ouvrir l'un des "échantillons de contrôle FITC". Utilisez les menus déroulants pour définir l'axe x à "FSC" et "linéaire" et l'axe-y pour "SSC" et "linéaire".
      2. Utilisez le «sélecteur de grille de polygone" pour préparer une porte de la population totale WBC.
        REMARQUE: Assurez-vous d'inclure toutes les cellules sur les bords de la carte. Etiqueter cette porte "WBC".
      3. Double-cliquez sur la "nouvelle porte WBC" et utiliser la gouttemenus déroulants pour définir l'axe des x à "FSC" et "linéaire" et l'axe-y pour "SSC" et "linéaire".
      4. Utilisez le «sélecteur de grille de polygone" pour régler le "granulocytes porte" et monocytes porte ", et ensuite utiliser le" sélecteur de grille elliptique "pour régler le" Lymphocytes porte ". Etiqueter chaque porte en conséquence. Faites glisser les" données de grille (%) "sur le côté afin que les cellules sont facilement visualisables.
    3. Réglez le "phagocytose positive gate" et la "phagocytose porte négative" pour les populations de granulocytes et de monocytes.
      1. Double-cliquez sur le "échantillon témoin FITC" utilisé à l'étape 4.1.2.1. Ensuite, cliquez sur la "porte de granulocytes" et utilisez les menus déroulants pour définir l'axe x à "FL1" et "Connexion" et l'axe des y à "SSC" et "linéaire".
      2. Utilisez la «porte sélecteur carré" pour définir un "phagocytose porte négative" et un "phagocytose Positive gate ".
        NOTE: Étant donné que les échantillons de contrôle FITC n'a pas reçu bactériennes (c. -à S. aureus) stimuli, toutes les cellules doivent être théoriquement phagocytose négative. Faites preuve de discrétion lors de l'établissement des limites pour ces populations.
      3. Répétez l'étape 4.1.3.1 et 4.1.3.2 Étape pour la population de monocytes.
    4. Ajouter des statistiques pour "% de WBC", "intensité de fluorescence", et "% phagocytose cellules positives" pour les populations de granulocytes et de monocytes.
      1. Cliquez sur le "échantillon témoin FITC" utilisé à l'étape 4.1.2.1. Mettez en surbrillance le "granulocytes gate", puis cliquez sur "espace de travail" et "Ajouter statistique". Mettez en surbrillance "moyenne géométrique" et "FL1 Log" et cliquez sur "Ajouter". Ensuite, choisir la "Fréquence de Parent" statistique et cliquez sur "Ajouter".
        NOTE: Cela donnera l'intensité de fluorescence (moyenne géométrique) de l'ensemble de la population de granulocytes etle pourcentage de globules blancs (parent) qui sont granulocytes.
      2. Cliquez sur le "échantillon témoin FITC" utilisé à l'étape 4.1.2.1. Mettez en surbrillance le "phagocytose porte positive" de la population de granulocytes, puis cliquez sur "espace de travail" et "Ajouter statistique". Mettez en surbrillance "moyenne géométrique" et "FL1 Log" et cliquez sur "Ajouter". Ensuite, choisissez la "Fréquence de Parent" statistique et cliquez sur "Ajouter".
        NOTE: Cela donnera l'intensité de fluorescence (moyenne géométrique) des phagocytose granulocytes positifs et le pourcentage des granulocytes (parents) qui sont la phagocytose positive.
      3. Répétez l'étape 4.1.4.1 et 4.1.4.2 Étape pour la population de monocytes.
      4. Cliquez sur le "échantillon témoin FITC" utilisé à l'étape 4.1.2.1. Mettez en surbrillance le "Lymphocytes gate", puis cliquez sur "espace de travail" et "Ajouter statistique". Mettez en surbrillance le "Fréquence de Parent" statistique et cliquez sur "Ajouter".
        NOTE: Cedonnera le pourcentage de globules blancs (parent) qui sont des lymphocytes.
      5. Mettez en surbrillance toutes les portes et les statistiques créées dans l'échantillon témoin FITC utilisé dans l'étape 4.1.2.1. Faites-les glisser dans "Tous les échantillons" dans le panneau "groupe" en haut de l'écran.
        NOTE: Ce sera appliquer ces paramètres à tous les échantillons de l'étude.
      6. Enregistrer et nom travail en tant que fichier .wsp dans le même dossier qui contient le dossier LMD.
    5. Ajustez les portes individuelles de l'échantillon.
      1. Cliquez sur le "premier échantillon" dans l'ensemble de données et de confirmer que la porte WBC correspond de manière appropriée la distribution des cellules sur l'écran. Si elle n'a pas, cliquez et faites glisser les bords de la porte d'ajuster la porte pour cet échantillon. Cliquez sur la "flèche droite" (ie, "˃") pour passer à l'échantillon suivant. Répétez cette étape jusqu'à ce que tous les échantillons ont été examinés.
      2. Cliquez sur la "porte WBC" pour le premier échantillon dans l'ensemble de données et de confirmer que la "Granulocyte porte "," monocytes porte ", et" Lymphocytes porte "pour chaque échantillon correspond de façon appropriée la répartition des cellules sur l'écran. Ajustez au besoin. Cliquez sur la" flèche droite "(ie," ˃ ") pour passer à l'échantillon suivant .
      3. Répétez l'étape 4.1.5.2 jusqu'à ce que tous les échantillons ont été examinés. Ensuite, cliquez sur "Enregistrer".
    6. Afficher les données dans un tableur électronique.
      1. Cliquez sur l'icône "Table Editor" en haut de l'écran. Cliquez sur "Modifier", "Mots clés", et "$ DATE" pour inclure la date de prélèvement sur la feuille de calcul final. Ensuite, cliquez sur "Modifier", "Mots clés", et "@ SAMPLEID1" pour inclure l'identification d'échantillonnage sur la feuille de calcul final. Répétez l'opération pour "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3", et "@ SAMPLEID4".
      2. Réglez l'écran "Table Editor" et l'écran "échantillon" de sorte qu'ils peuvent tous deux être visualisées sur l'écran d'ordinateur. Select tout «échantillon» sur la feuille d'échantillon. Ensuite, faites glisser chaque statistique d'intérêt pour la "Table Editor".
        1. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique figurant sous la «porte de granulocytes" à la "Table Editor". Tapez "% WBC comme granulocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        2. Faites glisser la statistique "moyenne géométrique" figurant sous la «porte de granulocytes" à la "Table Editor". Tapez "Geometric Fluorescence moyenne, granulocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        3. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique énumérés sous la rubrique "granulocytes / phagocytose positive porte" à la "Table Editor". Tapez "% Phagocytose granulocytes positifs" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        4. Faites glisser la statistique "moyenne géométrique" figurant sous la rubrique "granulocytes / phagocytose positive porte" à the "Table Editor". Tapez "Geometric Fluorescence moyenne, Phagocytose granulocytes positifs" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        5. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique figurant sous la «porte de monocytes" à la "Table Editor". Tapez "% WBC comme monocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        6. Faites glisser la statistique "moyenne géométrique" figurant sous la «porte de monocytes" à la "Table Editor". Tapez "Geometric Fluorescence moyenne, monocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        7. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique énumérés sous la rubrique "monocytes / phagocytose positive porte" à la "Table Editor". Tapez "% Phagocytose monocytes positifs" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
        8. Faites glisser la statistique "moyenne géométrique" figurant sous la rubrique "monocytes / Phagocycytose positive porte "à la" Table Editor ". Tapez" Geometric Fluorescence moyenne, Phagocytose monocytes positifs "sous la" "colonne du" Nom Table Editor ".
        9. Faites glisser le "Fréq. De Parent" statistique énumérés sous la rubrique "Lymphocytes porte" à la "Table Editor". Tapez "% WBC comme Lymphocytes" dans la colonne "Nom" de la "Table Editor".
      3. Glissez et déposez les paramètres visibles dans la "Table Editor" jusqu'à ce qu'ils soient disposés dans l'ordre préféré.
      4. Cliquez sur "Enregistrer". Ensuite, cliquez sur "Créer un tableau" pour afficher les données dans un format de feuille de calcul. Cliquez sur "Enregistrer sous" pour enregistrer et le nom travail .xlsx fichier.
  2. Répétez l' étape 4.1 pour le dosage de l' activité de l' OB (c. - H-marqué) des échantillons et de contrôle des fichiers de données DMT.
    REMARQUE: Assurez-vous de remplacer toutes les références à la phagocytose avec des références à l'activité de l'OB.

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Résultats

Un exercice prolongé et intensif a des effets profonds sur la fonction immunitaire innée, y compris la fonction naturelle de tueur de cellules, la réponse de cytokine macrophage à une infection virale, et granulocytes et des monocytes phagocytose et l'activité de l'OB. Plusieurs études indiquent que la phagocytose des augmentations de granulocytes et de monocytes de manière significative après l'exercice, ce qui reflète l'inflammation induite par des lésions musculaires e...

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Discussion

Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape, pour la détermination des deux indicateurs de granulocytes et de la fonction des monocytes. Nous avons identifié quelques étapes qui sont essentielles à la réussite de cet essai. Une telle étape est l'incubation au bain de glace qui se produit immédiatement avant l'addition de bactéries. refroidissement approfondie de tous les échantillons permettra de minimiser l'effet de la température sur la phagocytose et OB activité. Une autre étape essentielle est l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Zack Shue, Casey John et Lynn Cialdella-Kam pour leur aide lors de l'optimisation de cette procédure.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
12 tubes de 75 mm, avec capuchonVWR20170-579Vous aurez besoin de 2 tubes par échantillon (« H » et « F ») plus 3 tubes par lot (pour les contrôles de dosage ; « F », « H » et « Sang uniquement »).
PBS (10x), pH 7,4Life Technologies70011-044
Bouchon de bouteille 0,2 & micro ; Filtre en acétate de cellulose (capacité de 500 ml)Fisher Scientific09-741-07  ;
Glucose, poudreLife Technologies15023-021
Acide citrique (anhydre, culture cellulaire testée, culture cellulaire végétale testée)Sigma-AldrichC2404-100G
Citrate de sodium tribasique dihydratéSigma-AldrichS4641-25G
Dihydroéthidium (Hydroéthidine) (HE)Life TechnologiesD11347
Diméthyle sulfoxyde (DMSO) AnhydrusLife TechnologiesD12345
Staphylococcus aureus  ;( Souche de bois sans protéine A) Bioparticules, conjuguée à la fluorescéine (FITC)Life TechnologiesS2851
Staphylococcus aureus  ;( Souche de bois sans protéine A) Bioparticules, non étiquetéeLife TechnologiesS-2859
Trypan Blue Solution, 0,4 %Life Technologies15250-061
4,0 ml de vacutainer contenant 7,2 mg de K2EDTA, VWR séché par pulvérisationBD367861Vous aurez besoin de 1 tube de prélèvement sanguin K2EDTA par échantillon.
Vacutainer de 4,0 ml contenant 68 unités USP d’héparine de lithium, revêtement par pulvérisationde BD367884Vous aurez besoin de 1 tube de prélèvement sanguin d’héparine de lithium par échantillon.
COULTER Ac· ; T 5diff CPBeckman Coulter6605705c’est-à-dire , analyseur d’hématologie
COULTER Ac· ; T 5diff RinçageBeckman Coulter8547167
COULTER Ac· ; T 5diff FixBeckman Coulter8547171
COULTER Ac· ; T 5diff WBC LyseBeckman Coulter8547170
COULTER Ac· ; T 5diff Hgb LyseBeckman Coulter8547168
COULTER Ac· ; T 5diff Cal CalibratorBeckman Coulter7547175
COULTER Ac· ; T 5diff Control PlusBeckman Coulter7547198
AcT 5diff DiluantBeckman Coulter8547169
200 µ ; l Pointes de pipette allongéesVWR37001-526
Bac à glace isoléVWR89198-980Pour bain d’eau glacée.
Rack de tubes métalliques ouvertVWR60916-702
Fetal BovineSerum Life Technologies26140-111
TQ-Prep WorkstationBeckman Coulter6605429i.e., poste de travail automatisé de préparation de lyse cellulaire Système de réactifs
ImmunoPrepBeckman Coulter7546999i.e., système de réactifs de fixation de lyse/WBC
Système de cytométrie en flux Cytomics FC500 MCL avec logiciel CXPBeckman Coulter626553
Fluide de gaineIsoFlow Beckman Coulter8547008
COULTER CLENZBeckman Coulter8546929
Flow-Check Fluorospheres  ;Beckman Coulter6605359i.e., fluorosphères d’alignement et de vérification fluidique
Logiciel FlowJoFlowJo FlowJoc’est-à-dire , logiciel d’analyse de cytométrie en flux
Logiciel ExcelMicrosoftMicrosoft Excelc’est-à-dire , tableur électronique
RBC

Références

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  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
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  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963(2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Phagocytose des granulocytescytom trie en fluxessai sur sang totalStaphylococcus aureusbact ries marqu es au FITCdihydro thidiumextinction au bleu de trypanlyse des cellules sanguines
Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain
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