Article de méthode

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

10K vues

⸱

DOI :

10.3791/54276

⸱

25 juillet 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de différenciation des cardiomyocytes robuste, rapide et évolutif pour les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Les cardiomyocytes dérivés à l’aide de cette méthode à grande échelle peuvent fournir un nombre suffisant de cellules pour leur utilisation efficace dans la modélisation des maladies cardiovasculaires humaines, le criblage de médicaments à haut débit et potentiellement des applications cliniques.

Résumé

Maximiser le bénéfice de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) pour la recherche, la modélisation des maladies, des produits pharmaceutiques et des applications cliniques nécessite des méthodes robustes pour la production à grande échelle de types de cellules fonctionnelles, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous démontrons que la manipulation temporelle de WNT, le TGF-β, et les voies de signalisation SHH conduit à des lignes HPSC différenciation des cardiomyocytes très efficace de cellule unique à des passages à la fois la suspension statique et les systèmes de suspension de bioréacteurs agités. Employant cette stratégie a donné lieu à ~ 100% battant sphéroïdes, contenant toujours> 80% de troponine cardiaque des cellules T positives après 15 jours de culture, validés sur plusieurs lignes HPSC. Nous présentons également une variante de ce protocole d'utilisation avec des lignées cellulaires actuellement pas adaptés aux passages à cellule unique, dont le succès a été vérifiée dans 42 lignes HPSC. Cardiomyocytes générés en utilisant ces protocoles expriment des marqueurs spécifiques de la lignée et spectacle attendu electrophysfonctionnalités siologiques. Notre protocole présente une plate-forme simple, robuste et efficace pour la production à grande échelle de cardiomyocytes humains.

Introduction

Les cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et induites des cellules souches pluripotentes (de hiPSCs), ont la capacité d'auto-renouvellement et la capacité de se différencier en cellules des trois couches germinales embryonnaires 1,2. En raison de ces caractéristiques, hPSCs fournissent une source précieuse et illimité pour la production de génération et évolutive de types de cellules pathologiques pertinentes pour la modélisation de la maladie humaine 3-5, pour criblage à haut débit de la drogue et de toxicité des essais 6,7 et potentiellement pour des applications cliniques 8 . Génération de cardiomyocytes de hPSCs offre la possibilité d'étudier spécifiquement les mécanismes de maladies cardio-vasculaires humaines complexes et leurs traitements possibles, déjà au-delà de la portée de nos capacités en raison de l'absence de modèles animaux pertinents et / ou la disponibilité de tissus primaires touchés.

Toutes les applications précitées de hPSCs necessitate la production d'un nombre massif de cardiomyocytes hautement enrichis et fonctionnels. Ainsi, la disponibilité d'une manière efficace, reproductible et évolutive in vitro protocole de différenciation cardiaque approprié pour plusieurs lignes HPSC est crucial. Protocoles de différenciation des cardiomyocytes classiques ont utilisé différentes stratégies telles que la formation de corps embryoïdes 9, les techniques de co-culture 10, l' induction avec des cocktails de cytokines 11 et méthodes de protéine de transduction 12. En dépit des progrès réalisés dans ces techniques, qui souffrent le plus encore d'une mauvaise efficacité, exigent des facteurs de croissance coûteux, ou d'offrir l'universalité limitée lorsque l'on tente d'utiliser plusieurs lignes HPSC. À ce jour, ces défis ont fixé des limites à la production de cardiomyocytes HPSC dérivées pour les études de thérapie cellulaire dans des modèles animaux, ainsi que dans l'industrie pharmaceutique pour la découverte de médicaments 13. Par conséquent, le développement de techniques robustes et abordables pour les grandsproduction -scale de cardiomyocytes fonctionnels HPSC dérivés dans les systèmes de culture évolutive serait largement faciliter leurs applications commerciales et cliniques.

Dans ce manuscrit, nous rapportons le développement d'un système de différenciation cardiaque rentable et intégrée avec une grande efficacité, la reproductibilité et l'applicabilité de CSEh et hiPSCs générés à partir d'une variété de sources et des méthodes de culture, y compris une méthode pour la production à grande échelle de très populations enrichies de cardiomyocytes HPSC dérivées en utilisant un bioréacteur. De plus, nous avons optimisé ce protocole pour les lignes HPSC non adaptées à feeder culture cellulaire libre et / ou simple, comme hiPSCs nouvellement établies ou de grandes cohortes de lignes HPSC pertinentes à l'analyse du mécanisme de la maladie.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Préparation de la Culture Media, Revêtement de culture cellulaire Plaques et entretien des indifférencié hPSCs

  1. Préparation des médias
    Note: Stériliser les médias en utilisant un dispositif de 0,22 um de filtration et conserver à 4 ° C à l' abri de la lumière jusqu'à 4 semaines. Noms de réactifs, les fournisseurs et les numéros de catalogue sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
    1. Pour fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) moyenne, mélanger 445 ml DMEM, 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) et 5 ml de milieu de culture cellulaire (par exemple, Glutamax).
    2. Pour CSEh moyen, mélanger 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml Knockout Sérum de remplacement (KO-SR), 5 ml de milieu de culture cellulaire, 5 ml MEM minimum solution essentielle d'acides aminés et 0,5 ml 55 mM β-mercaptoéthanol.
      ATTENTION: β-mercaptoéthanol est toxique. Éviter l'inhalation, ingestion et contact avec la peau.
    3. Pour RPMI-B27 (RB) moyenne, mélanger 475 ml de RPMI 1640, 10 ml B27 minusinsuline, 5 ml de milieu de culture cellulaire, 5 ml de MEM au moins une solution d'acides aminés essentiels, 5 ml de pénicilline / streptomycine et 0,5 ml de 55 mM de β-mercaptoéthanol.
    4. Pour la solution de dissociation (DS), mélanger 10 ml de trypsine à 0,05%, 4 ml KO-SR, 1 ml de collagénase de type IV (1 mg / ml), 5 ml de DMEM-KO et 20 ul de CaCl2 (1 M).
    5. Pour Feeder-cell milieu conditionné, ajouter 15 ml de milieu de CSEh (sans bFGF) à un flacon T75 avec con fl uent des cellules nourricières (de MEF ou fibroblastes de prépuce humain) qui ont été préalablement inactivées par traitement avec soit la mitomycine C ou par irradiation. Récolte milieu conditionné après 24 h et le remplacer par un milieu de CSEh frais. Les cellules peuvent être utilisées pendant jusqu'à 2 semaines.
  2. Revêtement de culture cellulaire Plaques
    1. ECM Gel Coating:
      1. Lors de l'achat, dégeler l'extrait de gel d'ECM à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit dans un état liquide uniformément cohérente, selon les instructions du fabricant. Diluer à un rapportde 1: 2 dans le froid KO-DMEM, aliquote et conserver à -20 ° C.
        Remarque: Lors de la préparation du gel d'ECM, conservez les matériaux nécessaires pour une utilisation dans le aliquotage et le revêtement intérieur froid. La concentration de gel ECM varie avec le numéro de lot. Veiller à ce que la concentration est notée sur aliquotes. Des portions aliquotes peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
      2. Décongeler un gel aliquote ECM à 4 ° C. Lors de la décongélation, ajouter du milieu DMEM KO-froid pour obtenir une concentration finale de 0,34 mg / ml. Pipette bien et ajouter 0,75 ml par un puits d'une plaque à 6 puits. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    2. Mitotique inactivé souris embryonnaires Fibroblast Feeder cellulaire (MEF) Revêtement
      Remarque:. Préparation des cellules nourricières MEF a été décrit précédemment 14
      1. Enduire un 6 puits plaque de culture cellulaire avec le facteur d'attachement (AF) ou 0,1% de gélatine (voir étape 1.2.3) à température ambiante pendant 5 min (0,75 ml par un puits d'une plaque à 6 puits).Retirez et laissez la plaque dans l'armoire de biosécurité (BSC) à sécher.
      2. Décongeler MEF en transférant un flacon congelé dans un bain d'eau C 37 ° C pendant environ 2-3 min.
      3. Ajouter 7 ml de milieu FAE à un tube de 15 ml. Lorsque le flacon de cellules est décongelé, transférer lentement le contenu du tube de 15 ml. Centrifuger à 300 g pendant 4 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu MEF.
      4. Compter les cellules et la plaque 1 × 10 6 cellules par 6 plaque de puits (~ 1,7 x 10 5 cellules / puits). Transfert à un incubateur à 37 ° C / 5% de CO 2 et permettent aux cellules de joindre O / N avant utilisation.
    3. Gélatine Revêtement:
      1. Dissoudre 1 g de poudre de gélatine dans de l'eau ultra-pure pour faire une solution à 0,1% (p / v). Incuber pendant 15 min à 37 ° C, puis on autoclave la solution à 121 ° C pendant 15 min. Une fois refroidi, ajouter le nombre requis de puits (0,75 ml par un puits d'une plaque à 6 puits) et incuber pendant 15 min à 37 ° C.
        Note: Toute solution de gélatine à 0,1% peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois.
    4. Laminine Revêtement:
      1. Décongeler la laminine (1 mg / ml) à 4 ° C jusqu'à décongélation. 5 pi de solution de laminine, ajouter 1 ml de PBS froid. Pipette bien puis ajouter le nombre requis de puits (0,75 ml par un puits d'une plaque à 6 puits) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    5. Silicon Revêtement de surface Spinner Flask interne:
      1. Laver soigneusement 100 ml spinner flacon (avec 1 verre pendule) avec de l'eau distillée, en utilisant une brosse de nettoyage pour enlever la poussière et / ou des résidus de culture. Remplir avec 70% d'éthanol et après 30 min de rinçage avec de l'eau distillée. Ajouter NaOH 5 M et de laisser O / N.
      2. Retirer une solution de NaOH et rincer le flacon sous l'eau courante pendant 5 min. Remplissez le ballon avec HCl 1 M et laisser reposer pendant 15 min. Laver le ballon avec de l'eau courante pendant 5 min, puis deux fois avec de l'eau distillée deux fois complètementéliminer toute trace de HCl. Laissez le ballon sécher complètement dans le BSC.
      3. Ajouter 1,5 ml de solution de siliciuration dans le ballon et tourner horizontalement pour couvrir toutes les surfaces. Répétez la même procédure pour le pendule de verre.
      4. Chauffer le ballon revêtu dans un four sec à 100 ° C pendant 1 heure ou laisser sécher O / N à la température ambiante. Si chauffé dans un four, laisser refroidir à la température ambiante pendant 30 - 60 min.
      5. Rincer la fiole 3 fois avec de l'eau déminéralisée pendant 15 min chacun, puis stériliser à l'autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
  3. Entretien des indifférenciées hPSCs
    Note:     Pour chacun des protocoles décrits, sauf indication contraire, les cellules sont cultivées et cultivées dans des puits de 6 puits des plaques et des volumes de culture sera donnée appropriée pour ce format.
    1. hPSCs Cultured comme indifférenciées Spheroids dans un système de suspension statique
      Note: Les cellules utilisées dans ces étapes devraient déjà être adaptées auxunicellulaire culture. 15
      1. Commencez l'expérience avec hPSCs cultivées sur gel de ECM dans une plaque de culture à 6 puits à environ 70 - 80% de confluence. Retirez toutes les colonies différenciées en utilisant le stéréomicroscope dans le BSC. Ajouter inhibiteur de ROCK 10 uM Y-27632 et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
        Remarque: Pour retirer les colonies différenciées, utilisez une pointe de pipette pour détacher et retirer délicatement toutes les parties différenciées manuellement sous le stéréomicroscope. Veillez à ne pas retirer les colonies indifférenciées.
      2. Retirer les cellules de l'incubateur et le milieu de aspirée. Laver les cellules avec 1 ml de PBS, supprimer et ajouter 0,5 ml cellule de dissociation enzymatique. Incuber les cellules pendant 4 - 5 min à 37 ° C.
      3. Ajouter 1 ml de milieu de CSEh et récolter les cellules en utilisant un grattoir à cellules. Dissocier les cellules dans des cellules individuelles à l'aide d'une pipette de p1,000. Compter les cellules viables en utilisant le bleu Trypan et un hémocytomètre.
      4. Resuspendre les cellules à 2 x 10 5 c viableElls / ml dans feeder cellules milieu conditionné complétés avec 100 ng / ml de bFGF et 10 inhibiteur de ROCK uM Y-27632. Transférer les cellules sur des plaques de fixation ultra-basses à l'aide d'une pipette de 5 ml (3 ml par puits de plaque à 6 puits).
      5. Après 2 jours, retirez délicatement les cellules de l'incubateur et aspirer la moitié du milieu (environ 1,5 ml). Remplacez-le par du milieu conditionné frais complété avec 100 ng ml bFGF /.
      6. Changer la moitié du milieu tous les jours avec un milieu conditionné additionné de 100 ng ml bFGF / jusqu'au jour 5. Maintenant, soit d'autres cellules de culture, le passage de la culture indifférenciée continue (étape 1.3.1.2 - 5), ou d'utiliser pour la différenciation cardiaque (Section 2 ). Si la culture continue, les cellules de passage tous les 4 - 8 jours.
    2. hPSCs Cultured sur des cellules nourricières et repiquées Utilisation collagénase de type IV
      1. Avant repiquage hPSCs, supprimez toutes les colonies différenciées en utilisant le stéréomicroscope dans le BSC. Aspirer le milieu et laver les cellules avec 1 mlPBS par puits. Enlever puis ajouter 0,75 ml de collagénase de type IV (1 mg / ml) et on incube à 37 ° C pendant 5 à 15 min, tel que requis pour avoir les bords des colonies qui commencent à se décoller.
      2. Aspirer collagénase et ajouter 1 ml de milieu CSEh par puits. Détachez colonies à de petits groupes en utilisant un grattoir à cellules, puis de transférer les cellules à l'aide d'une pipette de p1,000 dans un tube de 15 ml. Veillez à ne pas briser les grappes en petits morceaux.
      3. Laver le milieu bien avec 1 ml de CSEh pour recueillir toutes les cellules restantes et ajouter 15 ml tube. Centrifuger à 100 g pendant 2 min. Aspirer les cellules surnageant et remettre en milieu CSEh additionné de 100 ng ml bFGF /.
      4. Retirer une plaque recouverte MEF de l'incubateur et aspirer le milieu MEF. Transférer les cellules dans un rapport compris entre 1: 3 et 1:10, selon le cas. Changer le milieu tous les jours avec un milieu de CSEh frais supplémenté avec 100 ng ml bFGF /. cellules Passage toutes les 4 - 8 jours.

2. Differentiation de hPSCs que Spheroids dans un système de suspension statique

  1. Commencez expérience en utilisant le jour 5 sphéroïdes indifférenciées tel que préparé dans la section 1.3.1.
    Remarque: A ce stade, la taille moyenne des sphéroïdes devrait être de 175 ± 25 um. Un minimum de 50 sphéroïdes doit être utilisé lors du démarrage d'un essai de différenciation.
  2. Transfert sphéroïdes dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 5 ml. Laver le moyen bien avec 1 ml de RB pour recueillir des sphéroïdes restants et ajouter dans le même tube de 15 ml. Laissez les cellules pendant 5 min jusqu'à sphéroïdes ont sédimenté pour former une pastille lâche (NE PAS centrifuger). Aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas prendre de sphéroïdes.
  3. Ajouter 3 ml de milieu RB supplémenté avec 12 uM CHIR99021. Transférer les cellules de nouveau dans un puits d'une ultra-basse plaque de fixation 6 puits. Après 24 heures, répétez l'étape 2.2.
    Remarque: milieu de RB est sensible à la lumière. Lorsque vous travaillez avec un milieu RB, garder la lumière de BSC éteint.
  4. UNEdd 3 ml de milieu RB au culot cellulaire. Transférer les cellules de nouveau dans un puits d'une ultra-basse plaque de fixation 6 puits. Après 24 heures, répétez l'étape 2.2.
  5. Ajouter 3 ml de milieu RB supplémenté avec IWP2, purmorphamine et SB431542 (5 uM chacun). Transférer les cellules de nouveau dans un puits d'une ultra-basse plaque de fixation 6 puits. Après 2 jours répéter l'étape 2.2.
  6. Remettre en suspension les cellules dans 3 ml de milieu RB et de transfert sur une plaque de gélatine revêtues pour permettre aux cellules de se fixer.
    Remarque: A ce stade, les cellules peuvent également être maintenues en suspension. Pour continuer avec la culture de suspension statique, transférer les cellules vers une plaque de fixation ultra-faible.
  7. Changer le support avec 3 ml de milieu RB après 2 jours. Les cultures vont commencer à battre le lendemain. Changer le milieu tous les 3 - 4 jours avec un milieu RB.

3. Différenciation des hPSCs comme Spheroids dans un bioréacteur de suspension Brassé

  1. Commencez l'expérience avec la culture de sphéroïdes indifférenciéed en suspension statique pendant au moins 3 passages (voir la section 1.3.1). Ajouter inhibiteur de ROCK 10 uM Y-27632 et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
  2. Retirer les cellules de l'incubateur et de transférer tous les sphéroïdes dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 5 ml. Laver le milieu bien avec 1 ml de CSEh pour recueillir des sphéroïdes restants et ajouter dans le même tube de 15 ml. Laissez les cellules pendant 5 min jusqu'à sphéroïdes ont sédimenté pour former une pastille lâche (NE PAS centrifuger). Aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas prendre de sphéroïdes.
  3. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS. Laissez pendant 5 min jusqu'à sphéroïdes ont sédimenté pour former une pastille lâche (NE PAS centrifuger). Retirer le surnageant et ajouter 0,5 ml de 0,05% de trypsine, plus mM EDTA 0,53. Incuber les cellules pendant 4 - 5 min à 37 ° C.
  4. Retirer les cellules de l'incubateur et ajouter 1 ml de milieu de CSEh. En utilisant une pipette de p1,000, dissocier les cellules en cellules individuelles, compter les cellules en utilisant le bleu Trypan et un hémocytomètre. Remettre en suspension à 2 x 10 5 viabLe cellules / ml dans du milieu conditionné additionné de 100 ng / ml de bFGF et de 10 l'inhibiteur de ROCK iM Y-27632.
  5. Transférer 100 ml de suspension cellulaire dans le flacon de bioréacteur siliconé avec 1 pendule (voir la section 1.2.5). Commencez avec 35 rpm agitation et après augmentation de 24 h à 40 tours par minute.
  6. Après 48 h, arrêter l'agitation pendant 5 - 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes se sont installés au fond du flacon. Remplacer la moitié du milieu par du milieu conditionné additionné de 100 ng ml de bFGF /. Répétez le même processus toutes les 24 heures jusqu'à ce jour 5.
    Note: A ce stade, sphéroïdes indifférenciées avec une taille moyenne de 175 ± 25 um devraient être formés.
  7. Arrêter l'agitation pendant 5 à 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes sont installés au fond du flacon. Transférer tous les sphéroïdes dans un tube de 50 ml dans un minimum de milieu (de moins de 50 ml). Jeter tout reste fluide dans le flacon de bioréacteur, assurant soigneusement aucun sphéroïdes restent dans le vaisseau.
  8. Leave pendant 5 - 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes se sont installés au fond du tube de 50 ml puis retirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot cellulaire lâche. Laver avec 25 ml de PBS avec du calcium et du magnésium ou du milieu RB, puis laisser à nouveau pendant 5 à 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes sont installés au bas du tube de 50 ml pour former à nouveau un culot lâche.
  9. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 40 ml de milieu RB supplémenté avec 12 uM CHIR99021, inhibiteur de roche de 10 uM et 0,1% d'alcool poly vinylique (PVA). Resuspendre les sphéroïdes et de transférer toutes les cellules de retour dans le flacon de bioréacteur. Ajouter moyen pour rendre le volume total de 100 ml. Redémarrez l'agitation à 40 tours par minute pendant 24 heures.
    Remarque: milieu de RB est sensible à la lumière. Lorsque vous travaillez avec un milieu RB garder le BSC à la lumière éteinte en mode.
  10. Répétez les étapes 03.07 à 03.08.
  11. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 40 ml RB milieu additionné de 0,1% de PVA. Resuspendre les sphéroïdes et de transférer toutes les cellules retour à til bioréacteur flacon. Ajouter moyen pour rendre le volume total de 100 ml. Redémarrez l'agitation à 40 tours par minute pendant 24 heures.
  12. Répétez les étapes 03.07 à 03.08.
  13. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 40 ml de milieu RB supplémenté avec IWP2, purmorphamine et SB431542 (5 uM chacun). Resuspendre les sphéroïdes et de transférer toutes les cellules de retour dans le flacon de bioréacteur. Ajouter moyen pour rendre le volume total de 100 ml. Redémarrez l'agitation à 40 tours par minute pendant 2 jours.
  14. Répétez les étapes 3,7-3,8.
  15. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 40 ml de milieu RB seulement. Resuspendre les sphéroïdes et de transférer toutes les cellules de retour dans le flacon de bioréacteur. Ajouter moyen pour rendre le volume total de 100 ml. Redémarrez l'agitation à 40 tours par minute. sphéroïdes Beating doivent être observées 48-72 heures plus tard.
  16. Changer la moitié du milieu tous les 3 - 4 jours avec du milieu RB seulement en arrêtant l'agitation pendant 5 à 10 min jusqu'à ce que tous les sphéroïdes sont installés au fond du récipient. Retirez délicatement 50 ml de milieu sans déranger les sphéroïdes et CAREFremplacer ully avec 50 ml de milieu de RB frais.

4. Différenciation des hPSCs utilisant des cultures non Adapté à cellule unique repiquage

Remarque: Cette approche est particulièrement utile pour la différenciation rapide d'un nombre élevé de lignes HPSC sans avoir à adapter aux techniques de culture unique de cellules, un processus énormément de main-d'œuvre et de temps. Cette technique est applicable aux lignées cellulaires qui sont très sensibles à la dissociation enzymatique des cellules, telles que les lignes nouvellement créées HPSC.

  1. Commencez l'expérience avec hPSCs cultivées sur MEF (comme dans la section 1.3.2) qui sont environ 70 - 80% confluentes. Retirez toutes les colonies différenciées en utilisant le stéréomicroscope dans le BSC.
  2. Retirer moyen et ajouter 0,5 ml Dissociation Solution (DS). Incuber pendant 0,5 à 1 min jusqu'à ce que les cellules MEF ont arrondi et les bords des colonies hPSCs devenu clair. Enlever rapidement DS et ajouter 0,75 ml collagénase de type IV (1 mg / ml).
  3. Incuberles cellules pendant 5 à 15 min à 37 ° C. Vérifiez les cellules sous le microscope pendant la période d'incubation, et quand des colonies entières commencent à décoller et à se détacher, enlever collagénase et ajouter 1,5 ml de milieu de CSEh.
    Remarque: Si après 15 minutes la plupart des colonies sont encore attaché, mettre les cellules vers incubateur. Vérifiez les cellules au microscope toutes les 5 min. Veillez à ne pas laisser les cellules de collagénase pendant plus de 30 min. S'il y a beaucoup de colonies flottantes dans la solution de collagénase, ne retirez pas la collagénase; il suffit d'ajouter 1 ml de milieu CSEh.
  4. En utilisant une pipette de p1,000, pipeter doucement colonies pour détacher des colonies dans son ensemble. Ne pas casser les colonies en petits morceaux. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 5 ml. Laver le puits avec 1 ml de milieu de hESC pour recueillir toutes les cellules restantes à ajouter dans le même tube. Laissez pendant 5 min jusqu'à ce que toutes les colonies ont sédimenté (NE PAS centrifuger).
  5. Retirez délicatement le surnageant et ajouter 2 ml CSEh medium supplémenté avec 100 ng / ml de bFGF. Transférer les cellules dans une plaque de fixation ultra-faible en utilisant une pipette de 5 ml (1 ml dans chaque puits d'une plaque à 24 puits et 3 ml dans chaque puits d'une plaque à 6 puits). Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant au moins 6 heures (maximum de 12 heures).
  6. Pendant ce temps, préparer le nombre nécessaire de laminine revêtu puits / plaques pour l'étape 4.7. ratios de transfert de cellules recommandée sont 1 confluentes puits d'une plaque à 6 puits à 2 puits d'une plaque de 24 puits (ou l'équivalent par unité de surface).
  7. Après 6 heures, soigneusement transférer les agrégats de colonies dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 5 ml. Laver la plaque avec un milieu RB pour collecter les agrégats restants et ajouter dans le même tube de 15 ml (0,5 ml par puits pour 24 puits et 1 ml par puits pour les plaques à 6 puits). Attendre 5 min jusqu'à ce que le sédiment agrégats, puis aspirer soigneusement le surnageant. Veillez à ne pas perturber le culot lâche.
  8. Ajouter 2 ml de milieu RB complété avec 12 uM CHIR99021 et transvaser soigneusementavec une pipette de 5 ml pour les laminine préalablement préparé des puits revêtus (comme dans la Section 1.2.4) pour permettre aux cellules de se fixer.
  9. Après 24 heures, retirez soigneusement le milieu dans chaque puits et ajouter 1 ml de milieu RB seulement.
    Note: Certains des agrégats auront seulement attaché très faiblement à la plaque de culture; il est donc important de ne pas supprimer tous les grands agrégats qui ont pu se détacher au cours de la procédure de changement de milieu. Il est toutefois important d'éliminer autant de petits débris cellulaires que possible.
  10. Après 24 heures, retirez soigneusement le moyen et ajouter du milieu RB supplémenté avec IWP2, purmorphamine et SB431542 (5 uM chacun).
  11. Changer le milieu après 2 jours avec un milieu de RB seulement. Les cellules commencent à se battre le lendemain.
  12. Changer le milieu tous les 3 - 4 jours avec un milieu de RB seulement.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Afin d'établir une méthode simple pour la différenciation à grande échelle de cardiomyocytes de hPSCs, nous avons créé un protocole dans lequel les cellules ont été traitées d' abord avec un activateur WNT / β-caténine (CHIR99021) 16 et ensuite avec des inhibiteurs de la WNT / β- caténine et facteur de croissance transformant β de (TGF-β) des voies (16 IWP2 et SB431542 17, respectivement) et , enfin , un activateur du Sonic hedgehog (Shh) voie (pu...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Cardiomyocytes dérivés de hPSCs sont une source extrêmement attrayante pour une utilisation dans la modélisation des maladies humaines, le dépistage dépistage des drogues / toxicité et, peut-être à l'avenir, les thérapies régénératives. L'un des principaux obstacles à l'utilisation de ces cellules cependant, est la capacité de fournir suffisamment de matériaux de haute qualité pour leur utilisation efficace. En utilisant notre protocole décrit, nous proposons une méthode qui surmonte cette limitation.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Le Chang Institut de recherche cardiaque Victor ne participe pas à, ni ne tolère, la destruction d'embryons humains pour la recherche. Sa contribution à cette étude a été limitée à travailler sur les cellules souches pluripotentes humaines induites.

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Cette étude a été financée par des subventions de l’Institut Royan, du Conseil iranien de recherche et de technologie sur les cellules souches, de la Fondation nationale iranienne des sciences (INSF), du Conseil national de la santé et de la recherche médicale d’Australie (NHMRC ; 354400), de la National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629) et du New South Wales Cardiovascular Research Network. HF a été soutenu par une bourse internationale de troisième cycle de l’Université de Nouvelle-Galles du Sud, en Australie. RPH a été soutenu par une bourse du NHMRC Australie. Les auteurs expriment leur gratitude aux sujets humains qui ont participé à cette recherche.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Knockout DMEMLife Technologies10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR)Life Technologies10828028
GlutamaxLife Technologies35050061
MEM Acides aminés non essentielsLife Technologies11140-050
&beta ;-MercaptoethanolLife Technologies21985-023
Facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)Miltenyi Biotec130-093-843
RPMI1640Life Technologies11875093
DPBS, sans calcium, sans magnésiumTechnologies14190144
DPBSLife Technologies14287072
Facteur d’attachement (AF)Life TechnologiesS006100
ECM GelSigma-AldrichE1270
LamininInvitrogen23017-015
DMEMLife Technologies11965-092  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
Sérum bovin mortel (FBS)Life Technologies16140-071
B27 moins insulineGibcoA18956-01
Pénicilline/StreptomycineLife Technologies15070063
0,05 % Trypsine/EDTALife Technologies25300-054
Collagénase Type IVLife Technologies17140-019
Chlorure de calcium (CaCl2)Sigma-AldrichC7902
Mitomycine CBioaustralisBIA-M1183
CHIR99021Miltenyi Biotec130-104-172
IWP2Miltenyi Biotec130-105-335
SB431542Miltenyi Biotec130-095-561
PurmorphamineMiltenyi Biotec130-104-465
Inhibiteur de ROCK Y-27632Miltenyi Biotec130-104-169
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma-AldrichE6758
Alcool polyvinylique (PVA)Sigma-Aldrich363073
GélatineSigma-AldrichG1890
Trypan BlueBio-Rad145-0013
Accumax  ;Technologies cellulaires innovatrices inc.AM105
Sigmacote  ;Sigma-AldrichSL2  ;
CELLSPINIntegra Biosciences183 001
Fiole tournante avec 1 pendule, 100 ml  ;Integra Biosciences182 023
Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)Préparés en interne (ou disponibles dans le commerce)
Lignées de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)Préparées en interne (ou disponibles dans le commerce)
Life

Références

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
  4. Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
  5. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
  6. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  7. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
  8. Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
  9. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
  10. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577(2013).
  13. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
  14. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  15. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
  16. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
  17. Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
  18. Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
  19. Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
  20. Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
  21. Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
  22. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
  23. Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
  24. Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
  25. McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
  26. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
  27. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  28. Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
  29. Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
  30. Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
  31. Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
  32. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
  33. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
  34. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Diff renciation des cardiomyocytesculture en bior acteurprotocole base de petites mol culessignalisation WNT TGF betatroponine T cardiaquerepiquage de cellules uniquessuspension statiquesuspension agit elign es de hPSC

Articles connexes