Reconstitution de base mitotique Spindles dans Spherical Droplets Emulsion

Summary

L’assemblage et le positionnement du fuseau mitotique dépendent des forces combinées générées par la dynamique des microtubules, les protéines motrices et les réticulants. Nous présentons ici nos méthodes récemment développées dans lesquelles le confinement géométrique de gouttelettes d’émulsion sphériques est utilisé pour la reconstitution ascendante de fuseaux mitotiques basiques.

Abstract

L’assemblage, le positionnement et l’orientation du fuseau mitotique dépendent des forces combinées générées par la dynamique des microtubules, les protéines motrices des microtubules et les réticulants. La croissance des microtubules peut générer des forces de poussée, tandis que la dépolymérisation des microtubules peut convertir l’énergie du retrait des microtubules en forces de traction, lorsqu’ils sont attachés, par exemple, à la dynéine corticale ou aux chromosomes. De plus, les protéines motrices et les réticulants diffusibles à l’intérieur du fuseau contribuent à l’architecture du fuseau en connectant et en glissant des microtubules anti-parallèles. In vivo, il s’est avéré difficile de démêler la contribution relative des acteurs individuels à l’équilibre global des forces. Nous présentons ici les méthodes que nous avons récemment développées dans le cadre de nos efforts pour reconstituer des fuseaux mitotiques basiques de bas en haut in vitro. À l’aide de techniques microfluidiques, les centrosomes et la tubuline sont encapsulés dans des gouttelettes d’émulsion eau dans l’huile, conduisant à la formation d’asters de microtubules géométriquement confinés (doubles). En introduisant en outre de la dynéine à ancrage cortical, des moteurs de microtubules dirigés vers l’extrémité supérieure et des réticulants diffusibles, ce système est utilisé pour reconstituer des structures en forme de fuseau. Les méthodes présentées ici fournissent un point de départ pour la reconstitution de fuseaux mitotiques plus complets, permettant une étude détaillée de la contribution de chaque composant individuel, et pour obtenir une vue quantitative intégrée de l’équilibre des forces à l’intérieur du fuseau mitotique.

Introduction

Au cours de la mitose, les chromosomes du génome répliqué sont organisées à l'équateur de la cellule pour assurer une répartition égale des chromatides sœurs dans les cellules filles nouvellement formées. le positionnement du Chromosome et de la ségrégation est médiée par leur attachement aux microtubules broche provenant de deux centrosomes opposées. En plus d'assurer la distribution des chromosomes fidèles, l'orientation du fuseau mitotique dicte également le plan de division cellulaire ^1. Orientation coordonnée de la division cellulaire est essentielle pendant de nombreuses étapes de développement et pour les tissus homéostasie ^2. Plus précisément, le positionnement du fuseau mitotique régulée peut entraîner la distribution asymétrique des contenus cellulaires ou même de produire des cellules filles de tailles différentes ^2. L' assemblage du fuseau mitotique et l' orientation commence en prophase et est orchestré par une interaction complexe entre coopération et antagoniser forces génératrices ^3,4. Les forces engendrées sont constituées de btraction et de poussée des forces OTH. Ces forces proviennent à la fois de la broche de contacts avec le cortex cellulaire, ainsi que de l' intérieur de la broche, et peuvent être générés par la dynamique des microtubules, ainsi que par des moteurs moléculaires et les agents de réticulation (figure 1).

les forces de poussée peuvent être générés lorsque les microtubules poussent contre des structures rigides telles que le cortex cellulaire. En fonction de la force de résistance totale générée au sein du système, ce qui peut entraîner un repositionnement du fuseau mitotique (forces faibles) ou de déclencher le flambage des microtubules ou d'une catastrophe (forces élevées) ^8/5. La quantité de force qui peut être produite en poussant dépend de la longueur des microtubules, étant donné que la longueur est un facteur déterminant de microtubules flambage ^9. En outre, les microtubules qui proviennent d'une centrosome peut pousser contre l'autre centrosome, un mécanisme a été proposé pour entraîner la séparation des centrosomes dans la prophase précoce ^3,10.

En additionà condition de pousser les forces générées par les microtubules croissantes, microtubules extrémités en contact avec le cortex cellulaire peut également servir de médiateur des forces de traction ^11. Des études provenant de plusieurs laboratoires ont montré que l'activité contrôlée des générateurs de force corticaux est nécessaire pour le positionnement asymétrique des fuseaux mitotiques ¹ in vivo. Essentiel à ces forces de traction est dynein cortex localisé cytoplasmique (ci - après dénommé «dynein»), un moins-end microtubules dirigé protéine moteur ^8,12,13. Par exemple, dans une levure bourgeonnante, les interactions latérales de la dynéine corticale avec le résultat du réseau de microtubules dans le moteur dépendant microtubules coulissant le long du cortex ^14. Cependant, les forces de traction corticales peuvent également être générés par la capacité de la dynéine pour former des attaches d'extrémité sur la dépolymérisation des microtubules à ^8. L'énergie générée par microtubules retrait peut conduire à des forces qui sont généralement un ordre de grandeur plus élevé (~ 50 pN (référence ¹⁵ )) que les forces générées par les protéines motrices individuelles (7-8 ~ pn (réf. ^16)). Fixation de fin sur des dynein corticale aux microtubules dépolymérisation favorise le positionnement de la broche dans la levure bourgeonnante ¹⁷ et C. ¹³ elegans. Que ce soit à la fois dépolymérisation du moteur dépendant de glissement et microtubules entraîné des forces de traction corticales peuvent coopérer ou sont mutuellement exclusifs in vivo est actuellement inconnue.

En plus de microtubules forces de poussée et des forces de traction corticales dynéine médiée, le positionnement centrosome est contrôlé à l'intérieur du fuseau mitotique par de nombreuses autres protéines. Kinésine 5 moteurs, par exemple, existent sous forme de tétramères qui peuvent réticuler microtubules antiparallèles interpolaires, ce qui entraîne la génération de forces de glissement vers l' extérieur ^18-20. Les membres de la famille du moteur kinésine 5 sont nécessaires pour la séparation des centrosomes et l' assemblage du fuseau bipolaire dans tous les eucaryotes étudiés, à l'exception de C. elegans (revue en référence ^21).

En outre, des agents de réticulation diffusible de la famille / PRC1 ASE1 sont également connus pour localiser les régions de chevauchement des microtubules interpolaires de microtubules in vivo et in vitro ^22-27. Les forces générées par l' expansion ASE1-entraînée de la microtubules zone de chevauchement sont assez grandes pour contrebalancer kinésine-14 forces de glissement médiées in vitro ^28,29. Dans les cellules, ASE1 / PRC1 est nécessaire pour la formation stable de chevauchement des régions de microtubules dans le milieu du fuseau ^25-27,30, ce qui suggère que les forces générées par des agents de réticulation diffusibles peuvent contribuer de manière significative à l' organisation broche. Enfin, les forces de la chromatine mitotique et cinétochores influencent l' assemblage du fuseau mitotique et de positionnement par différentes voies ^3. Etant donné que ces éléments ne font pas partie des essais de reconstitution décrits ici, ils ne seront pas décrits en détail.

jove_content "> Différentes théories existent sur ​​la façon dont les différents composants moléculaires et les forces décrites ci - dessus coopèrent dans l' assemblage de broche et de positionnement, mais nous sommes encore loin d'une compréhension quantitative. En plus des expériences dans les cellules vivantes, des expériences in vitro avec des composants purifiés fournissent un puissant route pour aider à atteindre cet objectif. nous présentons ici un guide visuel pour une version adaptée et étendue des méthodes publiées récemment (Roth et al. ^31), dans lequel les broches de base sont reconstituées dans des gouttelettes d' eau dans l'huile en émulsion, en commençant par nombre minimal de composants. en utilisant des techniques microfluidiques, des gouttelettes sphériques sont générés avec des tailles qui sont comparables à des cellules mitotiques. au sein de ces gouttelettes, centrosomes purifiées et tubuline peuvent être combinés afin d'étudier la dynamique de l'aster des microtubules, la force des interactions de production et de aster-aster. par l'introduction corticales (comme dynein) et inter-polaires (tels que kinésine-5 / ASE1) force de générateurs, nousreconstituer les structures de broche comme de plus en plus complexes qui commencent à ressembler à la situation in vivo.

Protocol

1. Préparation de Chips de microfluidique

NOTE: Pour l'étude de bas en haut de l'ensemble broche, sphériques gouttelettes d'eau dans l'huile émulsion sont utilisés. Ceux-ci sont des microgouttelettes aqueuses séparées de la phase huileuse entourant par une monocouche de phospholipides et de tensio-actif. Ces émulsions-gouttelettes sont produites dans polydiméthylsiloxane microfluidique (PDMS) puces. Les changements dans la géométrie des canaux et des débits peuvent être utilisés pour la taille des gouttelettes air. Dans la conception microfluidique décrit ici, les gouttelettes sont produites avec un diamètre d'environ 15 um à imiter le confinement géométrique d'une cellule mitotique chez les mammifères.

1. Photomask Conception et Fabrication de moules
   1. Concevoir un photomasque contenant trois canaux d' entrée ^31. Inlet canal 1 se connecte à la phase aqueuse, qui contient le contenu de gouttelettes (voir la section 3 "Reconstituer asters de microtubules de base"). Inlet canal 2 se connecte à la phase huileuse (voir section 2.1 "Lipid / huile phase préparer "). Utilisez canal d' entrée 3 pour diluer l' émulsion-gouttelettes avec des lipides / phase huileuse supplémentaire avant l' observation ( en option) (Figure 2a-b).
      REMARQUE: Tous les canaux d' entrée sont suivis par un filtre à poussière (un labyrinthe de 2 um canaux) pour retenir la poussière, particules PDMS et (protéinurie) agrégats et pour les empêcher de bloquer les canaux microfluidiques (figure 2d). Les canaux sont 75 m de large et le lipide / phase huileuse et phase aqueuse se rencontrent à 12,5 m de large jonction où l' émulsion-gouttelettes se forment (figure 2c).
   2. Commander et obtenir des photomasques imprimées sur un substrat de film, avec une polarité négative (le photomasque sera sombre avec des structures conçues transparentes).
2. moule de fabrication
   1. Fabriquer des moules par spin-coating SU-8 3025 résine photosensible sur une tranche de silicium de 4 pouces en utilisant un spin-coater (500 tours par minute, 10 secondes, suivi de 1800 tours par minute, 45 secondes) dans un environnement de salle blanche.
   2. Exposer le SU-8 revêtuela plaquette de silicium à travers le masque photographique. Développer des tranches selon les instructions du fabricant pour créer des canaux de ~ épaisseur de 40 um.
3. Faire une puce microfluidique
   1. Mélanger 10 parties PDMS pré-polymère avec 1 partie durcisseur (total ~ 40 gr) dans un récipient semblable à un bateau à l'aide d'une spatule en plastique. La place PDMS contenant navire de bateau comme dans une chambre à vide pour ~ 30 min. pour éliminer les bulles d'air. Envelopper une feuille d'aluminium dans le moule pour former une coupelle avec ~ 1 cm dressées bords.
   2. Verser le PDMS (~ 75% du volume total) dans le moule, laisser dans une chambre à vide pour un autre ~ 30 min. (Pour éliminer les bulles d'air) et durcir pendant 1 heure à 100 ° C dans un four.
   3. Spin-coat les PDMS restantes sur des lames de verre (5 sec à 200 rpm puis 30 secondes à 4000 tours par minute), suivi par durcissement pendant 1 h à 100 ° C. Enlevez la poussière de diapositives de verre en utilisant de l' air comprimé / N ₂ -flow, pré-nettoyage est pas nécessaire.
      REMARQUE: Les lames de verre PDMS revêtu peut être utilisé aussi bien pour micropuce rofluidic et la production de flux cellulaire (voir aussi 2.2).
   4. dénuder délicatement les PDMS hors du moule à l'aide d'une lame de rasoir et percer des trous (0,5 mm pour les entrées, 0,75 mm pour la sortie) .Corona-traiter la puce microfluidique et une lame de verre PDMS revêtu en utilisant une surface treater laboratoire corona pendant quelques secondes .
   5. Placez la puce microfluidique sur la lame de verre (chaînes vers le bas) et faire cuire les puces o / n à 100 ° C (Figure 3a). Stockez puces microfluidiques pendant plusieurs mois dans un environnement exempt de poussière.

2. Configuration microfluidique

REMARQUE: L'eau-dans-huile, des gouttelettes d'émulsion sont générées en utilisant une configuration microfluidique et les puces microfluidiques décrits ci-dessus. La composition du lipide / phase huileuse peut varier en fonction des exigences expérimentales. lipides huile solubilisée formeront une monocouche à l'interface eau-huile avec leur tête-groupes polaires face à l'eau à l'intérieur. Afin de cibler des protéines(Par exemple dynéine) jusqu'à la limite des gouttelettes, de faibles quantités de biotinyl-phosphatidyléthanolamine (biotinyl-PE) les lipides peuvent être ajoutés. Cela permet le recrutement de dynein biotinylé (voir section 4.1 "Dynein ciblage au cortex des gouttelettes") via multimérisation streptavidine-médiée. Les gouttelettes sont stabilisées par addition d'un agent tensio-actif et stockées dans des cellules de flux revêtues PDMS.

1. Lipid / phase huileuse Préparation
   1. Mélanger le chloroforme dissous 1,2-dioleoyl- sn glycéro-3-phospho-L-sérine (DOPS) et de lipides biotinyl-PE dans un rapport de 4: 1 molaire dans un tube de verre en utilisant des pipettes de verre (abondamment rincer pipettes avec du chloroforme avant utilisation). Préparer un total de ~ 250 pg de lipides, ce qui entraîne une concentration de lipides de ~ 0,5 mg / ml.
   2. Sécher soigneusement le mélange lipidique avec _N2 -flow et ensuite dans une chambre à vide pendant environ 1 heure. Dissoudre les lipides séchés dans de l'huile minérale et de 2,5% de tensioactif à 0,5 mg / ml (faire ~ 500 pi).
   3. Placer l'échantillon de lipide / huile dans unbain à ultrasons et de traitement par ultrasons pendant 30 min. à 40 kHz, afin de dissoudre complètement les lipides.
2. Préparation Flow-cellulaire
   1. PDMS Spin-manteau (voir également la section 1.3) sur les verres de couverture (5 sec à 200 rpm puis 30 sec à 4000 rpm) et des lames de verre (5 sec à 100 rpm puis 30 sec 1500 rpm) afin de déposer la couche homogène des PDMS.
      REMARQUE: Pour optimiser la qualité d'image, assurez-vous d'utiliser des lunettes de couverture avec une épaisseur qui correspond à l'objectif du microscope. Dans ce cas: 1,5 (~ 0,17 mm).
   2. Cure PDMS revêtu des lunettes de couverture et des lames de verre pendant 1 heure à 100 ° C dans un four. Faire cellules flux en espaçant de près (~ 2 mm) de fines tranches de film de laboratoire d'étanchéité (~ 3 mm de largeur) sur le verre-slides PDMS-enduits. Lorsqu'elles sont stockées dans un environnement exempt de poussière, les canaux qui ne sont pas utilisés peuvent être utilisés à d'autres moments.
   3. Couvrir les flux des cellules avec une lamelle et joint PDMS revêtu par fusion du laboratoire d'étanchéité film de ~ 1 min. à 100 ° C, appuyez surdoucement (figure 3c). Fermez les -GLASS-limites de film laboratoire étanchéité avec valap (Figure 3c). flux de cellules magasin pendant plusieurs mois dans un environnement exempt de poussière.
3. Coupe PDMS Préparation
   1. Pour l'imagerie à long terme, faire une tasse PDMS, par poinçonnage un trou de 4 mm de diamètre dans une tranche de PDMS (~ 3 mm d'épaisseur)
   2. Corona-traiter la tranche de PDMS et un verre de couverture enduit PDMS et placez-les sur le dessus de l'autre. Cuire la coupe PDMS o / n (à 100 ° C) (figure 5a).
4. La formation de gouttelettes d'émulsion
   1. Surveiller la formation de gouttelettes sur un microscope à champ lumineux inversé. Connecter le régulateur de pression à la puce microfluidique en utilisant des tubes en PEEK (diamètres: 510 um (externe) et 125 um (intérieure)) (Figure 3a). Remplissez puces microfluidiques complètement avec des lipides / phase huileuse de l'entrée 2.
   2. Introduire phase aqueuse à base d'MRB80 (voir la section 3 "Reconstituer asters de microtubules de base4;) à partir de l' entrée 1. Le contrôle des gouttelettes de taille en changeant des lipides / phase huileuse et de phase aqueuse pression pour créer des gouttelettes de ~ 15 um de diamètre (figure 3b).
      NOTE: En utilisant cette configuration, utilisez ~ 800 mbar pour le lipide / phase huileuse et ~ 200 mbar pour la phase aqueuse pour créer des gouttelettes de la taille souhaitée.
   3. Après avoir obtenu la gouttelette taille souhaitée et la quantité requise (~ 10 pi par échantillon), recueillir des gouttelettes de canal de sortie et de la charge dans le flux de cellules (remplir le flux de cellules complètement).
   4. Fermer les extrémités de l'écoulement des cellules en utilisant soigneusement valap (incomplètement cellules fermées d'écoulement peuvent se traduire par un mouvement extensif des gouttelettes, ce qui rend difficile d'imager eux). En outre, d'éviter la formation de bulles d'air qui se traduit par le mouvement des gouttelettes.
   5. Rincer les tubes PEEK abondamment avec de l'isopropanol avant et après utilisation pour éviter la contamination croisée et de colmatage échantillon.

3. Reconstituer base Asters microtubules

REMARQUE: Le contenu Gouttelette peut être modifiée en fonction des exigences expérimentales. Tous les tampons sont basés MRB80 (80 mM de PIPES, EGTA 1 mM, 4 mM de _MgCl2 (pH 6,8)), et tous les échantillons sont préparés sur de la glace. En général, les gouttelettes contiennent toujours centrosomes, les composants requis pour la polymérisation des microtubules, un système de capteur d'oxygène et de l'agent de blocage (voir section 3.1). force générateurs microtubules et cofacteurs nécessaires et des facteurs de ciblage peut être inclus si on le souhaite (voir sections 4.1 et 4.2).

1. Configuration générale pour la formation de l' aster dans des gouttelettes d'émulsion (Figure 3d)
   1. Préparer la glucose oxydase (20 mg / ml de glucose oxydase en mM DTT 200 et 10 mg / ml de catalase) mélange à l'avance et stocker en petites aliquotes à -80 ° C.
   2. Préparer un «mélange de blocage 'contenant κ-caséine, l' albumine sérique bovine (BSA), Tween-20 et le dextran fluorescent (comme un marqueur neutre) (voir le tableau 1) à l' avance et stocker dans un petit aliquots à -80 ° C. Empêcher des cycles répétés de gel-dégel. Veiller à tous les composants sont fraîchement préparés.
   3. Purifier centrosomes à partir des lignées de cellules lymphoblastiques humaines KE37 comme décrit par Moudjou et al. , Et stocker à ³² -150 ° C en petites aliquotes.
   4. Décongeler centrosomes à température ambiante et laisser incuber à 37 ° C pendant environ 20 min. avant de l'utiliser pour assurer la nucléation des microtubules appropriée.
      NOTE: Cela favorise la nucléation des microtubules pendant l'expérience.
   5. Pendant ce temps, préparer 'essai mix', contenant la tubuline (fluorescent et «sombre»), guanosine triphosphate (GTP), un système de capteur d'oxygène (glucose, glucose-oxydase, la catalase et le 1,4-dithiothréitol (DTT)), générateurs de force moléculaire (par exemple les moteurs de microtubules / cross-linkers), adénosine triphosphate (ATP) et un système ATP-régénération (phosphoénolpyruvate (PEP), pyruvate kinase (PK) et la lactate déshydrogénase (LDH)) sur la glace (voir le tableau 2).
   6. Pré-refroidir leAirfuge rotor sur la glace. Centrifuger l'échantillon dans le rotor refroidi à Airfuge (30 psi pendant 3 min), .Add centrosomes préchauffées (optimiser la quantité de centrosomes pour viser des gouttelettes contenant 1-2 centrosomes).
   7. Utilisez le mélange combiné pour produire des gouttelettes d'émulsion en utilisant les méthodes décrites dans la section 2.3.

Composant	Concentration en Stock	Concentration finale (dans le dosage)	Le volume	Commentaire
Dextran-647nm	75 pm	3,75 yM (0,6 uM)	5 ul
κ-caséine	20 mg / ml	12,5 mg / ml (2 mg / ml)	62,5 pi
Tween-20	5%	0,375% (0,06%)	7,5 pi
BSA	200 mg / ml	12 mg / ml (1,9 mg / ml)	6 pi
MRB80			19 pi
			100 ul finale	Magasin en 2 aliquotes

Tableau 1: Constituants de 'blocage Mix' de Constituants de blocage mélange, nécessaires à la reconstitution des structures broche comme dans des gouttelettes d' eau dans l'huile émulsion.. Pour une description, voir la section de texte principal 3 "Reconstituer asters de microtubules de base". Pour plus de détails sur les matériaux, voir «Tableau Matériaux.

Composant	Stock Concentration	La concentration finale	Le volume	Commentaire
blocage mix			1,6 pi
tubuline	500 pM	30 pm	0,6 pi
Tubuline-488/561	50 pm	3uM	0,6 pi
GTP	50 mM,	5 mM	1,0 ul
Dynein-TMR	178 nM	30nM	1,7 pi
Streptavidin	5 mg / ml	200 nm	0,4 pi	Pour corticale Dynein seulement
Kinesin-5	1,6 mM	80 nM	0,5 ul
ATP	25 mM,	1 mM	0,4 pi	Pour les moteurs seulement
DYNAMISME	0,5 M	25,6 mM	0,5 ul	Pour les moteurs seulement
PK / LDH	800 U / U 1100	23 U / 32 U	0,3 pi	Pour les moteurs seulement
ASE1-GFP	400 nm	80 nM	2,0 pi
Glucose	2,5 M	50 mM,	0,3 pi	Dernière étape
Glucose-oxydase	50x	1.0x	0,3 pi	Dernière étape
MRB80			X
			9 pi finale

Tableau 2: Constituants de «Assay Mix». Constituants de dosage mélange, nécessaire à la reconstitution des structures de broche comme dans des gouttelettes d'eau dans l'huile émulsion. Pour une description, voir la section de texte principal 3 "Reconstituer asters de microtubules de base". Pour plus de détails sur les matériaux, voir le tableau des matériaux.

4. Présentation de la broche de l'Assemblée-facteurs

NOTE: Dans les essais décrits ici, une protéine fluorescente verte (GFP) -tagged version tronquée de S. cerevisiae a été utilisé dynéine qui est artificiellement dimérisée au moyen d'une glutathion S-transférase amino-terminale (TPS) -Tag ^33. Cette protéine est purifiée au moyen d'un marqueur d'affinité qui contient deux copies de la protéine A de domaine de liaison d'IgG. La variante utilisée ici est marqué avec un tétraméthylrhodamine (TMR) étiquette sur le carboxy-terminal et le SNAP-tag N-terminal est utilisé pour biotinyler les protéines purifiées. Pour plus de détails de construire, voir Roth et al ^31. pour plus de détails de purification, voir Reck-Peterson et al. ^33. GFP-biotine-dynéine-TMR peut être ciblé vers le cortex gouttelettes à travers la formation de complexes biotine-streptavidine qui relient les lipides à dynéine biotinyl-PE (figure 3e).

1. Dynein Ciblage au Droplet Cortex
   1. Inclure GFP-biotine-dynein-TMR dans le «dosage mix» (voir le tableau 2) à une gouttelette-concentration finale de 30 nM. Inclure streptavidine en «test mix» (voir le tableau 2) à une gouttelette-concentration finale de 200 nM.
      NOTE: Dynein dépend de l'ATP-hydrolyse pour le mouvement par étapes sur les microtubules. Par conséquent, comprennent l' ATP et un système ATP de régénération (contenant PEP et PK / LDH) dans le «dosage mix» (voir le tableau 2).
      NOTE: Recombinant pleine longueur S. pombe GFP-cut7 (kinésine-5) a été gracieusement fournie par le laboratoire Diez (Center for Bioengineering moléculaire, Technische Universität Dresden, Dresde, Allemagne), voir. Recombinant plein-longueur histidine-tagged S. pombe GFP-ASE1 a été aimablement fourni par le laboratoire Jansons (Université de Wageningen, Wageningen, Pays - Bas) et ajouté au «test mix» à des concentrations de 80 nM.

5. Imaging

Remarque: Au cours de l'expérience, la croissance des microtubules peut être contrôlée en changeant la température. En choisissant les conditions d'imagerie, des compromis doivent être faits entre l'imagerie de haute qualité et la capacité de surveiller l'assemblage broche pour de longues périodes de temps. Afin de comparer la cinétique de formation de la broche dans des conditions différentes, les gouttelettes ayant des teneurs peuvent être mélangées et imagées dans le même canal d'écoulement.

1. Paramètres d'imagerie de base
   1. Image dans un environnement à température contrôlée à l'aide d'une chambre fermée. Visualisez les microtubules individuels après ~ 30 min à 26 ° C. Alors que l'imagerie, favoriser la croissance des microtubules en augmentant la température jusqu'à environ 30 ° C.
      NOTE: Les settings ci-dessous sont spécifiques à notre configuration de microscope et peuvent varier avec différents systèmes et logiciels d'exploitation différent. Tous les essais décrits ici sont imagées sur un système inversé motorisé avec une tête confocale à disque tournant et exploité en utilisant un logiciel d'imagerie comme Andor iQ 3.1. Obtenir toutes les images avec un objectif à immersion d'huile 100X et la caméra EMCCD.
   2. Définir des lasers d'excitation 488, 561 et 641 nm à une intensité d'environ ~ 10%. Allez dans le panneau «d'acquisition», cliquez sur l'onglet et laser de diapositives intensités 'AOTF' à 10%. Cliquez sur 'record' pour enregistrer les réglages.
   3. Pour z -projections, prendre des piles avec 1 um intervalles (~ 20 images / gouttelettes). Allez à la main "caméra", cliquez sur "modifier z 'et réglez' étape de Z 'à 1,0. Cliquez sur" suivant "pour mémoriser les réglages.
   4. Set linéaire EM-gain maximum en cliquant sur l'onglet «caméra» dans le panneau «d'acquisition» et faites glisser la barre de gain EM 300. exposition Setfois à 200 msec dans le même onglet. Cliquez sur 'record' pour enregistrer les réglages.
2. Imagerie en direct
   1. Pour l' imagerie en direct, en utilisant les commandes de logiciels font z -projections toutes les 2 min. pendant la durée de 1-2 heures, en réduisant les temps d'exposition à environ 100 msec. (comme décrit dans 5.1.4) et augmenter z -intervals à 2 pm (comme décrit dans 5.1.3). Réglez la série temporelle dans le panneau principal 'appareil photo', cliquez sur 'répétition t' et réglé à 2 min. des intervalles pendant une durée totale de 120 min.
   2. Pour les dosages en direct, en utilisant une tasse PDMS au lieu d'un écoulement cellulaire régulier pour faire en sorte que les gouttelettes sont aussi immobile que possible.
3. Imagerie combinée de 2 Conditions
   1. Produire des gouttelettes en utilisant la microfluidique et de stocker sur une lame de verre recouverte PDMS sur la glace. Cela empêche la nucléation des microtubules jusqu'à ce que le second ensemble de gouttelettes a été formé. Avant de produire le deuxième ensemble de gouttelettes, rincer les tubes PEEK et puce microfluidique avecMRB80 et complètement recharge puce microfluidique avec le lipide / phase huileuse.
   2. Générer des gouttelettes avec et sans dextran fluorescent (ou à l'aide de dextrane avec des fluorophores différents de longueur d'onde) afin d'établir une discrimination entre les gouttelettes de couleurs différentes. Après avoir produit le deuxième lot de gouttelettes, mélanger doucement les gouttelettes par pipetage et charger dans un seul flux de cellules / PDMS-tasse.
4. L'analyse d'image.
   1. Analyser les images en utilisant Fidji (logiciel open source disponible en ligne) ^34.
   2. Pour les essais en direct, convertir des piles en utilisant hyperstacks 'image' - 'hyperstacks' - 'pile à HyperStack'. Réglez le nombre correct de z tranches et des délais.
   3. Afin de faire z-projections, choisissez 'image' - 'piles' - 'z-projet ». Choisissez projection 'intensité max'.
   4. Pour 3D-reconstructions, allez d'abord à «l'image» - «propriétés» et définir le pixel approprié avec, hauteur de pixels, la profondeur de voxel et frintervalles de TEA. Cliquez sur 'OK'. Choisissez 'image' - 'piles' - 'projet 3D', cochez la case 'interpoler' et cliquez sur 'OK'.

Results

Les méthodes présentées dans les sections précédentes permettent la reconstitution des structures de broche comme avec l'augmentation de la complexité en utilisant le confinement géométrique des gouttelettes d'eau dans l'huile émulsion. Cette section décrit les résultats représentatifs qui illustrent qualitativement la capacité de ces essais.

Au cours de la mitose, lorsque la broche bipolaire est assemblé, les cellules complètent pour former des sphères d'un diamètre d'environ 15 um, telle que mesurée pour les cellules humaines. Cette forme caractéristique de la cellule mitotique fournit une limite géométrique que les deux restreint et dirige la taille et de l' orientation ^35,36 broche. Techniques microfluidiques, offrent un niveau de confinement géométrique qui ressemble exactement la situation observée dans les cellules vivantes et donc permet la reconstruction de bas en haut des fuseaux mitotiques in vitro.

(Figure 4a, panneau de gauche). Après environ 20-30 minutes, les premiers microtubules deviennent visibles et la diffusion centrosome devient restreint comme microtubules poussent contre le cortex dans toutes les directions. Asters avec microtubules de longueur intermédiaire (environ 50% du diamètre des gouttelettes) peuvent (stérique) se repousser une autre, avec les microtubules qui poussent les uns contre les autres, les autres centrosome et le cortex. Il en résulte un arrangement de broche comme «bipolaire» typique avec les deux centrosomes opposées l' une à l' autre (figure 4a, panneau du milieu). Quand les microtubules croissent plus longue que ~ 50% des gouttelettes de diamètremètres, centrosomes sont poussés plus loin aux limites opposées de la goutte, avec les microtubules qui poussent le long du cortex de gouttelettes (figure 4a, à droite). Il est important de noter que les taux de croissance des microtubules dans ces essais sont très sensibles à la température et la tubuline-concentrations. Ces paramètres seront donc affecter fortement le moment où la nucléation est d'abord observé et lorsque les positions de l'aster l'état d'équilibre sont atteintes.

Dans les cellules, les forces de traction corticales sont générées par la formation d'attaches de support de charge entre les microtubules ainsi que les fins et dynéine cortex associée. Dans les cellules animales, cette association dépend du complexe Gai / CGL / NUMA qui est ciblé sur la membrane plasmique par l' intermédiaire d'une myristoylation N-terminale de ¹ Gai. Dans ces essais de reconstitution, l'exigence du complexe Gai / CGL / NuMA est contournée par couplage direct dynéine aux lipides biotinylés par laformation de complexes biotine-streptavidine-biotine. Ces liaisons sont relativement stables _(Kd ~ 10 ^-14 M) ³⁷ et forment rapidement (habituellement dans les 10 minutes après la formation de gouttelettes d' émulsion, avant la nucléation des microtubules devient apparent) (figure 4b). En présence d'dynéine cortical centrosomes conservent généralement une position plus centrale, alors qu'en l'absence de la dynéine, centrosomes sont poussés vers les côtés opposés du cortex de gouttelettes (figure 4c). Nous raisonnons ceci est le résultat de deux effets, prévenir et contrecarrer les forces de microtubules pousser. (1) Dynein favorise directement les catastrophes de microtubules, limitant ainsi la longueur des microtubules et la prévention excessive microtubules flambage, et (2) des forces de traction corticales conduire à des forces de centrage nettes sur les asters individuelles ^8, qui neutralisent les forces de répulsion aster-aster.

L'agent de réticulation diffusible ASE1 induit forces qui ont tendance à augmenter la zone de chevauchement des microtubules antiparallèles ^29. Conformément à cela, en présence d'ASE1 (et en l' absence de la dynéine) centrosomes se trouvent proches les uns des ASE1 localisant à empaqueté microtubules interpolaires (figure 4d). Les membres de la famille kinésine-5 voiture séparation centrosome en fournissant des forces qui poussent à partir de la broche (voir introduction). En présence d'cut7 (S. pombe kinésine-5 orthologue) centrosomes sont poussés vers les côtés opposés des gouttelettes d'émulsion, même en présence d'ASE1 (figure 4E). En combinant des générateurs de force corticale et inter-polaires, le niveau de complexité peut encore être augmentée dans ces expériences, pour aboutir finalement à une compréhension globale de l'ensemble de fuseau mitotique bipolaire. Une description quantitative détaillée de ces résultats seront disponibles à l'avenir (Roth et al., Manuscrit en préparation).

(Figure 5c). Cela facilite l'étude des deux comportements à l'état d'équilibre et de la cinétique d'assemblage broche. En combinant des gouttelettes avec des contenus différents dans le même échantillon, il est, par exemple, possible de comparer directement le positionnement et l' assemblage de broche cinétique centrosome dans des gouttelettes avec et sans générateurs de force corticale (figure 5b).

Figure 1: Les forces agissant sur ​​la broche mitotique Plusieurs molécules de génération de force agissent sur ​​les microtubules du fuseau mitotique pour favoriser la formation de la broche et de positionnement.. Les microtubules qui poussent dans le cortex cellulaire génèrent une force de poussée sur le centrosome. dynein corticale (violet) capture microtubules dépolymérisation et génère une force de traction sur les centrosomes. Dans l'axe, kinésine-5 protéines motrices / cut7 fournissent une force de glissement vers l' extérieur sur les microtubules anti-parallèles, alors que les agents de réticulation de la famille PRC1 / ASE1 génèrent un opposant à l' extérieur force de glissement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Figure 2:. Microfluidique Chip Design (A) Conception de photomasque 4 pouces contenant 4 puces microfluidiques. (B) Représentation détaillée d'une seule puce. Puces contiennent un canal de sortie et de trois canaux d'entrée suivie d'un filtre à poussière. Entrée du canal 1 contient la phase aqueuse, le canal 2 du lipide / phase huileuse et le canal 3 peut être utilisé pour diluer les gouttelettes formées avec des lipides / phase huileuse supplémentaire. (C) de la représentation détaillée de la jonction où le lipide / phase huileuse (venant du haut et en bas) se réunit avec l'eau-phase (venant de la gauche). A la jonction, des gouttelettes se forment et l'écoulement vers le canal de sortie sur la droite. (D) de la représentation détaillée d'un filtre à poussière avec 2 um canaux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3:. Méthodologie de l' eau dans huile Emulsion Droplet Formation (A) puce microfluidique et tubes microfluidique sur un microscope à champ clair. Les deux tubes d'eau et à des lipides / phase huileuse sont connectées aux entrées de la puce 1 et 2 respectivement. (B) Restriction à la microfluidique puce où l'eau et de lipides / pétrole phases se rencontrent. En changeant la pression, des gouttelettes de taille peut être contrôlée. (C) La conception des cellules flux PDMS revêtues. Après le chargement des gouttelettes dans le flux de cellules, les extrémités ouvertes sont fermées avec plus valap. (D) Schéma de la formation de gouttelettes. Gouttelettes sont utilisées pour encapsuler centrosomes, la tubuline et des composants supplémentaires nécessaires à la formation du fuseau mitotique. (E) Schéma de ciblage corticale-dynéine. Biotinylé (Bio) dynein est destiné aux lipides biotinylés par la streptavidine (GEST).

Figure 4:. Les résultats représentatifs de la broche-Reconstitutions avec la complexité croissante (A) des projections maximales d'intensité des gouttelettes contenant deux centrosomes montrant des exemples de court, moyen, et long microtubules. Centrosomes et les microtubules sont visualisés par l'addition de 10% HiLyte-488 marqué tubuline. Les barres d'échelle = 10 pm. (B) La localisation de la GFP-biotine-dynein-TMR en l'absence (-, à gauche) et en présence (+, droite) de streptavidine (GEST). (C) microtubules aster positionnement en l'absence (-, à gauche) ou en présence (+, droite) de la corticale GFP-biotine-dynein-TMR. (D) microtubules aster (panneau de gauche, green) positionnement en présence d'ASE1 (panneau du milieu, rouge). (E) microtubules aster (panneau de gauche, vert) positionnement en présence d'ASE1 et cut7 (kinésine-5) (panneau du milieu, rouge). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Imagerie Aster Positionnement Dynamique in vitro (liste a) Sous la conception d'une tasse PDMS qui permet l' imagerie des gouttelettes jusqu'à plusieurs heures.. (B) Production, stockage et imagerie de gouttelettes (transmis) contenant des contenus différents, illustrés par l' absence ( à gauche) l' inclusion ( à droite) de dextran fluorescent (Alexa 647). (C) simples images planes d'un 60 min time-lapse (intervalles de 2 min) prises à partir d' un z-stack (2 pm distances) de l' annonceroplet contenant un seul centrosome. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les méthodes décrites ici présents récents efforts pour reconstituer les broches mitotiques de base dans des gouttelettes d'eau dans l'huile émulsion. Etudier ensemble de broche dans les limites géométriques offre de nombreux avantages. des mécanismes de rétroaction importantes existent entre les microtubules du fuseau mitotique et les contraintes géométriques dans lesquelles ils sont assemblés. Les microtubules peuvent générer des forces de poussée quand ils grandissent dans les limites géométriques, ce qui peut entraîner le déplacement du fuseau mitotique. En outre, de plus en plus dans une barrière physique peut provoquer des catastrophes des microtubules. En outre, l' assemblage de la broche dans une géométrie confinée peut conduire à un épuisement progressif des composants individuels, comme la tubuline, ce qui se répercute directement sur ​​le taux de croissance des ³⁶ microtubules. Ce sont tous des facteurs essentiels de l'ensemble de broche, qui peuvent être étudiés en utilisant les dosages décrits ici.

Les essais décrits sont très sensibles à de petites différe de concentrationrences des composants de gouttelettes. Tel est le cas pour la tubuline, dans lequel les différences de concentrations mineures peuvent se traduire soit par une croissance des microtubules trop lent ou trop rapide. Dans ce cas, les taux de croissance microtubules peuvent souvent encore être corrigées en ajustant la température au cours de la ~ 30 premières minutes de l'expérience. l'assemblage du fuseau mitotique et le positionnement est également très sensible aux variations de la concentration de générateurs (corticale) de force. Ceci est susceptible de dépendre de la concentration, de la pureté et l'activité des composants purifiés et ils doivent être titrés avec soin pour chaque nouvelle protéine purifiée.

En outre, certains des compromis doivent être faits dans les paramètres d'imagerie, selon la nature de l'essai. Dans un premier temps, des niveaux élevés d'solubles dimères de tubuline fluorescentes rendent difficiles à imager microtubules individuels. Microtubules de tubuline et rallongent soluble est lentement consumée, le rapport signal à bruit devient progressivement plus élevée et permet l'imagerie de Individumicrotubules al. Contrairement aux configurations avec des systèmes ouverts, le confinement géométrique empêche l'échange des molécules fluorescentes et les composants du système d'absorbeur d'oxygène à l'intérieur d'un réservoir en vrac, ce qui entraîne le blanchiment significatif. En particulier pour la surveillance de l'assemblage de la broche et le positionnement dans le temps, il est nécessaire d'image avec des intensités lumineuses faibles, même en présence d'un système de piège à oxygène actif.

Ces méthodes permettent la reconstitution ascendante des structures de broche comme simplifiées in vitro. En plus des composants introduits ici, de nombreux autres facteurs ont été décrits pour influencer la formation bipolaire de la broche, le positionnement, l' orientation, la mise en forme, etc. ^3. Ce système peut être étendu pour étudier les effets individuels et combinés de générateurs de force supplémentaires. contributeurs importants à la formation du fuseau qui sont actuellement absents de ce système sont les chromosomes mitotiques. chromatine mitotique a été démontréformation de broche directe par (1) chromokinesins qui peut générer des soi-disant «forces polaire éjection» ^3, (2) la formation d'un gradient de RanGTP par la chromatine liée RanGEF RCC1 ^38, (3) kinétochores qui peut interagir avec (dépolymérisation microtubules) ³⁹ et (4) la chromatine lui - même, qui peut fonctionner comme un ressort mécanique entre les microtubules opposées ^40.

Enfin, le système décrit fournit actuellement le contrôle spatial et temporel limité sur l'activité et la localisation des forces génératrices introduites. Dans les cellules, de nombreux facteurs d'assemblage broche localisent à des compartiments spécifiques ou sont actifs dans une fenêtre de temps limitée. Un exemple frappant est l'activité de la dynéine, qui est spécifiquement enrichi au niveau du côté postérieur du C. elegans , une cellule d' embryon de stade pour favoriser le positionnement de la broche asymétrique et la division cellulaire. Dans ce système, nous étudions actuellement la possibilité d'imiter telle tméthodes d'activité utilisant emporal et asymétriques empruntés à des techniques opto-génétiques. En outre, comme est le cas pour le C. elegans embryon et les cellules avec une paroi cellulaire rigide, de nombreuses cellules ne complètent dans la mitose. La forme du confinement géométrique aura un impact fondamental sur les forces agissant sur ​​la broche ^41. Il sera donc important de reconstituer l' assemblage de la broche et le positionnement dans des gouttelettes non-sphériques ainsi, potentiellement en utilisant des systèmes microfluidiques plus complexes qui permettent de façonner et de stockage de l' émulsion gouttelettes ^42,43. Enfin, dans les tissus, cellule-cellule et la signalisation cellulaire substrat et d'attachement fournissent des indices externes qui peuvent être traduits en orientation de la broche dirigée, comme il est souvent observé dans les cellules épithéliales et les cellules souches. Tous ces aspects spécialisés ont pas été prises en compte dans cette étude et pourrait fournir des défis à venir pour construire vers plus in vivo -comme reconstitutions de assemb du fuseau mitotiquement et de positionnement.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Préparation de puces microfluidiques
Photomask (Photomask sur substrat de film)	Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025	MicroChem
Silicon wafer (plaquette de silicium de 4 pouces p/Boron < 1-0-0>10-20 &Omega ;-cm, 500-550 &mu ; m, SSP, avec 2 plats)	WRS Materials	4P0SSP-005
Coucheuse par centrifugation  ;	Polos	SPIN150I
PDMS pré-polymère RVT615 A+B	Lubribond	9481
Traitement corona	Produits électrotechniques	BD-20ACV
2. Configuration microfluidique
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)	Avanti Polar Lipids	840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-( biotinyl))	Avanti Polar Lipids	870285
Chloroforme	Sigma-Aldrich	650498
Pipettes
Tubes en verre Pompe
à vide	Laboport	KNF
Chambre à vide	Kartell	Polypropylène Dessiccateur
sous vide Huile minérale	Sigma-Aldrich	M5904
Tensioactif (Span80)	Sigma-Aldrich	85548
Sonicateur	Branson	M2800H
Lamelles de			24 mm x 60 mm, épaisseur 1,5
Lames de			26 mm x 76 mm
Perforateur	Harris Uni-Core	135840/135841/135843
Etanchéité de laboratoire film	Parafilm
Valap (vaseline, lanoline, cire de paraffine fondues à concentrations égales)
Microscope à fond clair	Leica	PMIRB  ;	N’importe quel fond clair inversé suffirait
Régulateur de pression	Fluigent	MFCS-FLEX-4C-1000
Tube PEEK	Cluzeau Info. Labo, France
Flacons microfluidiques (Tubes Micrew 0,5 ml et 1 ml)	VWR, Pays-Bas
3. Reconstitution de la formation et du positionnement de la broche
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10 000 MW, Anionic, Fixable)	Life Technologies
Tween-20	Sigma-Aldrich
BSA - Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich
Glucose (D-(+)-Glucose)	Sigma-Aldrich	G8270
Glucose-oxydase (Glucose oxydase d’Aspergillus niger)	Sigma-Aldrich	G6125
DTT (DL-dithioltheitol)	Sigma-Aldrich	646563
Catalase (Catalase forme foie bovin)	Sigma-Aldrich	C9322
Tubuline (tubuline du cerveau bovin)	Cytoskeleton Inc.
Tubuline-488/561 (tubuline marquée à la rhodamine HiLyte-488/Rhodamine provenant de cerveau porcin)	Cytoskeleton Inc.
GTP (guanosine-'5-triphosphate, hydrate de sel de sodium)	Sigma-Aldrich	51120
&kappa ;-caséine (&kappa ;-caséine de lait sérique de bovin)	Sigma-Aldrich	C0406
Airfuge (ultracentrifugeuse à air)	Beckman-Coulter	CLS
strong>4. Présentation des facteurs d’assemblage de la broche
Name	Company	Catalog Number	Comments
Neutravidin	Sigma-Aldrich	A2666
ATP (adénosine-'5-triphosphate, hydrate de sel disodique)	Sigma-Aldrich	A9187
PEP (Acide phospho(énol)pyruvique sel monosodique hydraté &ge ; 97 % (enzymatique))	Sigma-Aldrich	P0564
PK/LDH -(enzymes pyruvate kinase/lactique déshydrogénase du muscle de lapin)	Sigma-Aldrich	P0294