Enquête basée sur l'interférence ARN de la fonction de la protéine de choc thermique 27 pendant la cicatrisation cornéenne épithéliale Wound

Résumé

Dans la présente, nous présentons un protocole permettant d’utiliser le petit ARN interférent spécifique de la protéine de choc thermique 27 (HSP27) pour évaluer la fonction de HSP27 pendant la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes. L’interférence ARN est la meilleure méthode pour inhiber efficacement l’expression des gènes afin d’étudier la fonction des protéines dans divers types de cellules.

Résumé

Le petit ARN interférent (siRNA) est l’une des méthodes d’interférence d’ARN les plus largement utilisées pour le silençage à court terme de gènes codant pour des protéines. Le siRNA est un duplex d’ARN synthétique créé pour cibler spécifiquement un transcrit d’ARNm afin d’induire sa dégradation et il a été utilisé pour identifier de nouvelles voies dans divers processus cellulaires. Il existe peu de rapports concernant le rôle de la protéine de choc thermique phosphorylée 27 (HSP27) dans la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes. Ici, des cellules épithéliales cornéennes humaines en culture ont été divisées en un groupe témoin brouillé transfecté par siRNA et un groupe transfecté par siRNA spécifique à HSP27. Des tests de plaie directionnelle induits par le grattage, ainsi que le western blot et la cytométrie en flux ont ensuite été effectués. Nous concluons que HSP27 joue un rôle dans la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes qui peut impliquer l’apoptose et la migration des cellules épithéliales. Vous trouverez ici des descriptions étape par étape de la préparation des échantillons et du protocole d’étude.

Introduction

Les cellules épithéliales de la cornée (CECS) tombent en continu dans le film lacrymal, alors qu'ils sont simultanément remplacées par des cellules du limbe et des couches basales épithéliales de la cornée. ¹ Divers facteurs de stress extrinsèques peuvent induire l'apoptose et la desquamation de CECs. ² Les protéines de choc thermique (HSP) sont hautement conservée et peut être divisé en deux familles selon la taille moléculaire. ³ la plus grande famille HSP comprend HSP90, HSP70 et HSP60, et la plus petite famille comprend HSP27. ⁴ la phosphorylation de HSP27 est connue pour jouer un rôle important dans la survie des cellules et est nécessaire pour la migration cellulaire en raison du rôle de cette protéine dans l' actine remodelage. ^5-7 par conséquent, nous avons tenté de tester le rôle potentiel de HSP27 phosphorylation dans la migration de la CCE et de l' apoptose dans un modèle in vitro de cicatrisation épithéliale.

L'interférence ARN (ARNi) en utilisant soit des petites ou courtes ARN interférents (siRNA) a gel' intérêt à la fois la biologie également exonéré fondamentale et appliquée, car elle permet potentiellement l'expression d'un gène d'intérêt à être renversé vers le bas. ⁸ Ici, nous avons utilisé siRNA spécifiques HSP27 pour évaluer la contribution des HSP27 à la guérison de la plaie de la CCE et de l' apoptose. Les méthodes traditionnelles d'ARNi pour le gene knock-down dans les cellules utilisent des duplexes d'ARN synthétiques, comprenant deux oligonucléotides 21-mères non modifiés qui peuvent être assemblés pour créer des ARNsi. L'ARNi siRNA que nous avons utilisé dans cette étude est une méthode simple et très efficace pour transfecter des cellules, et ce réactif travaille avec diverses lignées cellulaires immortalisées. Dans la présente étude, nous démontrons les méthodes utilisées pour cette analyse, y compris un essai induit scratch-plaie directionnelle, western blot, siRNA essai de transfection, immunofluorescence et cytométrie en flux.

Protocole

1. Cell Line

1. Culture 10 ⁶ cellules télomérase immortalisées humaines de cornée épithéliale (HCECs) dans une plaque à 6 puits (densité: 1039,9 cellules / mm ²⁾ dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de _CO2 à 5% en utilisant un milieu de croissance de l' épithélium bronchique (BEGM) jusqu'à ce que ils atteignent 95% de confluence.

2. Analyse par Western Blot après Création épithéliales Wounds Scratch

1. Streak une pointe stérile de 200 pi de pipette sur la surface d'un puits d'confluentes HCECs cultivées quatre fois par boîte dans une enceinte de sécurité biologique (classe II, type A2) et incuber HCECs séparément dans un incubateur à 37 ° avec une atmosphère de CO ₂ de 5% pendant 1, 5, 10, 30, 60 et 120 min.
2. Utiliser une plaque de 6 puits pour six échantillons différents en fonction de la durée d'incubation après la lésion de l'épithélium de la cornée.
3. Laver les monocouches HCEC blessés trois fois avec PBS 1x, puis ajouter 2,0 ml BEGM à chaque puits.
4. Détachez HCECs utilisant 2ml de 0,25% de trypsine-acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA) par puits pendant 5 minutes, centrifuger à 900 g pendant 5 min dans un tube de 15 ml et aspirât de trypsine-EDTA à l'aide d'une pipette de 1 ml.
5. Suspendre HCECs avec 1 ml 1x PBS et les transférer dans un tube de 1,5 ml.
6. Centrifugeuse HCECs à 10.000 xg pendant 15 sec et aspirée 1x PBS en utilisant une pipette de 1 ml.
7. Remettre en suspension HCECs dans 100 de tampon de lyse glacé pl (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, EDTA 2 mM mM , NaF 25, 2 mM de Na ₃ VO _4, le fluorure de phénylméthanesulfonyle 1 mM [PMSF], les inhibiteurs de la protéase [1 pM de pepstatine A, 1 pM de leupeptine et 0,1 uM d'aprotinine] et 0,5% de Triton X-100 [pH 7]) et mélangez-les bien.
8. Incuber les cellules pendant 30 min sur de la glace pour induire la lyse des cellules.
9. lysats Centrifugeuse à 4 ° C à 10000 xg pendant 15 min, puis transférer surnageants frais tubes de 1,5 ml (90 aliquotes) et les stocker à -80 ° C.
10. Déterminer la concentration totale en protéines des lysats cellulaires en utilisant la pr Bradfordtest otein. ⁹
11. Charge de 30 ug de protéines cellulaires totales dans un gel d'acrylamide à 10% ou 12% pour le sodium dodécyl électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), puis par électrophorèse transfert séparés des bandes de protéines sur des filtres de nitrocellulose avec un courant de 200 mA pendant 1 heure à 4 ° C C à utiliser dans des essais western blot.
12. Bloc nitrocellulose filtres membranes avec 5% de lait écrémé dans une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST) pendant 1 heure, ajouter des anticorps polyclonaux de lapin primaire contre HSP27 non-phosphorylée (1: 1000 dilution) ou primaire d'anticorps polyclonaux de lapin contre phosphorylée HSP27 (1 : 1000 dilution) dans 5% d'albumine de sérum bovin (BSA), et on incube les membranes pendant une nuit à 4 ° C sur un agitateur.
13. Détecter les bandes immunoréactives en utilisant des anticorps de chèvre anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (dilution 1: 10000) dans 5% de BSA après lavage pendant 10 minutes, 3 fois avec du TBST.
14. Incuber la membrane dans les réactifs de luminol Western Blot (6-7 ml par 10 cm x 5 cm de la membrane) pendant 1 min à température ambiante.
15. Retirer la membrane de la solution de réactif, éliminer le liquide en excès avec une serviette absorbante, et placer dans un protecteur de feuille de plastique.
16. Travailler dans une pièce sombre avec une lumière sûre, placer la membrane recouverte d'une cassette de film avec le côté de la protéine vers le haut.
17. Placez le film X-ray sur le dessus de la membrane et exposer pendant 1 min.

3. Dosage de transfection de siRNA ¹⁰

1. HCECs de culture à 5 x 10 ⁵ cellules / puits dans une plaque à 6 puits dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de _CO2 à 5% en utilisant BEGM jusqu'à ce qu'elles atteignent 95% de confluence.
2. On dilue le réactif de transfection (2,5 ou 7,5 pi) avec 100 pi de réduction milieu sérique pour la transfection (le facteur de dilution est de 41 ou 14,3) et on dissout le HSP27 spécifique et brouillée siRNA contrôle dans 100 ul de milieu sérique réduit pour créer 10 ou 50 nM de spécifiques HSP27 et embrouillé siRNA contrôle.
3. Mélanger 100 μ; La solution de siRNA l avec 100 ul de réactif de transfection dilué (1: 1 ratio) et on incube le mélange pendant 15 min à température ambiante.
4. Ajouter les complexes ARNsi-lipide aux cellules. Puis, après 4 médias de changement h pour terminer BEGM et incuber les cellules pendant 2 jours à 37 ° C.
5. Analyser les cellules transfectées par western blot, comme décrit des sections 4.1 à 4.7.

4. Analyse par transfert de Western pour les cellules transfectées ¹¹ siARN

1. Extrait spécifiques HSP27 et brouillés HCECs siRNA-transfectées contrôle dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant 100 pi de tampon de lyse glacé (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, acide éthylènediaminetétraacétique 2 mM (EDTA), mM NaF 25, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF), les inhibiteurs de protéase, et 0,5% de Triton X-100, pH 7).
2. Incuber les cellules pendant 30 min sur de la glace pour induire la lyse des cellules.
3. lysats Pellet à 10.000 xg pendant 15 minutes, puis transférer surnageants frais 1,5 ml baignoirees (90 ul aliquotes) et les stocker à -80 ° C.
4. Déterminer les concentrations protéiques des lysats cellulaires en utilisant le dosage des protéines de Bradford. ⁹
5. Charger les échantillons avec des quantités égales de protéines cellulaires totales sur un gel d'acrylamide 10% ou 12%, sous réserve du gel à SDS-PAGE, et le transfert électrophorétique les bandes de protéines séparées à des filtres de nitrocellulose avec un courant de 200 mA pendant 1 h à 4 ° C à utiliser dans des essais western blot.
6. Bloc filtre de nitrocellulose membranes avec 5% de lait écrémé dans une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST) pendant 1 heure, ajouter des anticorps primaires contre phosphorylée et non phosphorylée HSP27 (1: 1000 dilution), phosphorylée Akt (1: 1000 dilution), non phosphorylée Akt (1: 1000 dilution, utilisée comme marqueur de la survie cellulaire), Bcl-2-protéine associée à X (1: 1000 dilution utilisée comme une protéine pro-apoptotique), et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH; 1 : 200 dilution utilisée comme témoin de charge) dans 5% d'albumine de sérum bovin (BSA), etincuber les membranes pendant une nuit à 4 ° C sur un agitateur.
7. Détecter les bandes immunoréactives en utilisant des anticorps de chèvre anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (dilution 1: 10000) dans 5% de BSA après lavage 3 fois avec du TBST, 10 min chaque lavage.
8. Incuber la membrane dans les réactifs de luminol Western Blot (6-7 ml par 10 cm x 5 cm de la membrane) pendant 1 min à température ambiante.
9. Retirer la membrane de la solution de réactif, éliminer le liquide en excès avec une serviette absorbante, et placer dans un protecteur de feuille de plastique.
10. En travaillant dans une chambre noire avec une lumière inactinique, placer la membrane recouverte d'une cassette de film avec le côté de la protéine vers le haut.
11. Placez le film X-ray sur le dessus de la membrane et exposer pendant 1 min.

5. Scratch induite Directional Blessant évaluation Dosage de migration cellulaire ¹²

1. Dans une enceinte de sécurité biologique, faire une blessure en faisant glisser une pointe de pipette stérile sur la surface d'un puits de cultures confluentes despécifiques à l'HSP27 ARNsi-transfectée ou HCECs ARNsi transfectée contrôle brouillé.
2. Immédiatement après la blessure, se laver les cellules deux fois avec du phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) et les maintenir dans les cultures BEGM dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de _CO2 à 5% pendant 24 heures après la blessure.
3. Photographie images HCEC utilisant un microscope droit à grossissement 100X 24 heures après la blessure et d'effectuer l'aplatissement de fond en utilisant le filtre commande dans le logiciel d'analyse d'image.
4. Utilisation de la commande Sélectionner des mesures, définir la zone d'intérêt (AOI) avec la même forme polygonale taille qui peut couvrir perpendiculairement de bout en bout de la blessure initiale, et de déterminer trois AOI différent dans la zone blessée de chaque échantillon.
5. compter automatiquement le nombre de cellules dans chaque champ en utilisant les Count / Taille des options de menu Mesure.

6. cytométrie de flux Analyse de l'apoptose

1. Culture siRNA-transfectées et HSP27 spécifique de contrôle sHCECs chacun contenant 10nM de siRNA ARNi transfecté à une concentration de 5 x 10 ⁵ cellules / puits dans des plaques à 6 puits jusqu'à ce que les cellules atteignent 95% de confluence dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de _CO2 à 5% dans BEGM.
2. Détacher HCECs en utilisant 2 ml de 0,25% de trypsine-EDTA par puits pendant 5 minutes, centrifuger à 900 g pendant 5 min dans un tube de 15 ml et aspirât de trypsine-EDTA à l'aide d'une pipette de 1 ml.
3. Laver les cellules deux fois avec du PBS froid puis remettre en suspension les cellules dans 1 x tampon (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M de NaCl et 25 mM de _CaCl2) se liant à une concentration de 10 ⁶ cellules / ml.
4. Transférer 100 pl de suspension de cellules (1 x 10 ⁵ cellules) dans un tube de culture de 5 ml.
5. Ajouter 5 ul d'isothiocyanate de fluorescéine conjugué à l'annexine V et 5 pi d'iodure de propidium.
6. vortexer doucement les cellules et les incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
7. Ajouter 200 pi de tampon de liaison 1x à chaque tube et on analyse les cellules par un flux cytometer à 1 h.

Résultats

L'expression de HSP27 phosphorylée significativement augmentée à 5, 10, et 30 minutes après zéro blessant comparé à HCECs ¹³ non blessés. L' analyse par transfert de Western a révélé que l'expression de HSP27 phosphorylée et la protéine Akt phosphorylée ont tous deux été significativement réduite, alors que l'expression de Bax était significativement augmentée dans HCECs d'ARNsi spécifique à une transfection HSP27 (figure 1A-E). L'expression de HSP27 phosphory...

Discussion

Dans cette étude, nous avons évalué le rôle potentiel de HSP27 dans la lésion de l’épithélium cornéen en utilisant des approches in vitro . Les étapes critiques impliquaient la transfection d’un ARNi pour l’inactivation de HSP27 afin d’observer la fonction de HSP27 dans les cellules soumises à un stress. Notamment, un rôle de HSP27 a été révélé par ces expériences dans la migration des cellules épithéliales et l’apoptose lors de la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes. Contrairement aux études précéd...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Enceinte de sécurité biologique	CHC LAB Co.Ltd,  ; Daejeon, République de Corée  ;	CHC-777A2-06	Classe II, type A2
	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		ARNi siRNA ; siRNA de contrôle brouillé et siRNA spécifique à HSP27
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Milieu de croissance de l’épithélium bronchique  ;
Inhibiteur de la protéase  ;	Sigma-Aldrich, Inc., Saint-Louis, MO	P8340 ,P7626	1 μ ; M Pepstatine A, 1 μ ; M Leupeptine, 0,1 μ ; M Dosage
la protéine Aprotinin Bradford  ;	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001	Bradford dosage des protéines  ;
Filtres à nitrocellulose	Amersham, Little Chalfont, Royaume-Uni	RPN3032D	Membrane western blot
non phosphorylée HSP27  ;	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351 Dilution	1:1 000 (HSP27 totale)
HSP27 phosphorylée (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594 Dilution	1:1 000 HSP27 a été phosphorylée au niveau de Ser85
Lipofectamine® ; RNAiMAX réactif  ;	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Réactif de transfection
Akt phosphorylé (Ser473)	Technologie de signalisation cellulaire, Danvers, MA	n° 4060	Dilution 1:1 000 Akt a été phosphorylé au niveau Ser473 (marqueur de survie cellulaire)
Akt non phosphorylé  ;	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	No. 4061	Dilution 1:1 000 (Akt totale)
Protéine X associée à Bcl-2  ;	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	n° 4062	1:1 000 (marqueur protéique anti-apoptotique)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	n° 4063	Marqueur de contrôle de charge 1:1 000 (gène de ménage)
Anticorps anti-lapin de chèvre conjugués à la peroxydase de raifort	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	dilution 1:10 000
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	Milieu sérique réduit pour la transfection
Logiciel d’analyse d’images	Olympus, Inc., Tokyo, Japon	Image-Pro Plus 5.0
Lait écrémé en poudre  ;	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Allemagne	T145.2
Tris  ;	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0497
Chlorure de sodium  ;	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Plaque de culture à six puits	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	35,00 mm de diamètre / puits
Boîte de culture à 24 puits	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Agitateur orbital	N-Bioteck, Inc., Séoul, Corée du Sud	NB1015
Albumine sérique bovine	Santa Cruz Biotechnologie, Santa Cruz, Californie	sc-2323  ;
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		cytométrie en flux
	Kodak, Rochester, NY		Cassette de radiographie médicale avec écran vert 400  ;
réactif de luminol western blot	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048  ;
FITC Annexin V Kit de détection de l’apoptose I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547