Article de méthode

Gap Junctional intercellulaire Communication: Un biomarqueur fonctionnelle pour évaluer les effets néfastes des substances toxiques et les toxines, et bienfaits pour la santé des produits naturels

DOI :

10.3791/54281

⸱

25 décembre 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit un colorant technique de transfert de chargement fluorescent scalpel qui mesure la communication intercellulaire par les canaux des jonctions lacunaires. Gap communication intercellulaire jonctionnelle est un processus cellulaire majeur par lequel l'homéostasie tissulaire est maintenue et la perturbation de cette signalisation cellulaire a des effets néfastes sur la santé.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un scalpel chargement fluorescent transfert de colorant par la technique (SL-DT) qui mesure la communication intercellulaire par des canaux de jonction d'intervalle, ce qui est un processus important intercellulaire par lequel l'homéostasie tissulaire est maintenue. Interruption de l' écart de jonction communication intercellulaire (GJIC) par des substances toxiques, des toxines, des médicaments, etc. a été liée à de nombreux effets néfastes sur la santé. De nombreuses maladies génétiques humaines basée ont été liées à des mutations dans les gènes des jonctions lacunaires. La technique SL-DT est un test fonctionnel simple pour l'évaluation simultanée de GJIC dans une grande population de cellules. L'essai comprend des cellules de pré-chargement avec un colorant fluorescent en perturbant brièvement la membrane cellulaire avec une lame de scalpel, dans une population de cellules. Le colorant fluorescent est alors autorisé à traverser à travers des canaux de jonction à fente des cellules voisines pendant un temps désigné. L'essai est ensuite terminée par l'addition de formaline aux cellules. La propagation du fluocolorant rescent par une population de cellules est évaluée avec un microscope à épifluorescence et les images sont analysées avec un certain nombre de progiciels morphométriques qui sont disponibles, y compris les logiciels libres trouvés sur le domaine public. Ce test a également été adapté pour les études in vivo en utilisant des tranches de tissu à partir de divers organes des animaux traités. Dans l' ensemble, le dosage SL-DT peut servir un large éventail de besoins pharmacologiques et toxicologiques in vitro, et peut être potentiellement adapté pour haut débit de mise en place des systèmes avec fluorescence automatisé d' imagerie et d' analyse au microscope pour élucider plusieurs échantillons dans un temps plus court.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'objectif global de cette méthode est de fournir une technique simple, complète et relativement peu coûteux pour évaluer la toxicité potentielle de composés. Ceci est une méthode in vitro qui peut être utilisé dans de multiples lignées cellulaires. Standard des laboratoires de biologie cellulaire équipés de microscopes à épifluorescence peuvent effectuer des recherches en utilisant ce test.

Notre connaissance de base des fonctions cellulaires a été très dépendante de tests biologiques in vitro, et est devenu un élément essentiel dans les évaluations toxicologiques des produits pharmaceutiques, des polluants de l' environnement, et les contaminants alimentaires nés. Malheureusement, il n'y a pas un seul système in vitro dans des essais biologiques qui peuvent globalement répondre aux demandes de toutes les évaluations toxicologiques. Beaucoup des essais in vitro sont conçus et optimisés pour évaluer ainsi que d' évaluer un critère biochimique ou moléculaire spécifique. Ceux-ci sont très souvent combinés dans un haut débit mis en place afin de refléter une perturbation d'uncertaine voie de transduction du signal, comme l' œstrogène-récepteur de signalisation 1. Cette stratégie a eu beaucoup de succès, mais le nombre étendu de voies de signalisation impliquées dans l'expression des gènes rend la tâche de choisir une voie de signalisation spécifique pour évaluer assez complexe. Hauts protocoles par-mis sont actuellement développés et utilisés pour mesurer simultanément de nombreuses voies de signalisation, qui a été une approche pour surmonter certaines des limites des analyses uniques. Cependant, toutes les voies de signalisation ont été incorporées avec succès dans des approches plus globales, ainsi que de nouvelles voies de signalisation sont constamment découvert que complique encore plus ce processus d'évaluation. Utilisation des numéros de vastes approches in vitro, particulièrement élevé par-mis des systèmes, pour les évaluations toxicologiques complètes sont également très coûteux et ne sont pas propices à la plupart enquêteur unique dirigé des projets de recherche.

GJIC est un tig de processushtly contrôlée par des changements dans la tension, la concentration de calcium, le pH, l' équilibre d'oxydoréduction, réglementées par les grandes voies de signalisation intracellulaire de transduction et les interactions avec la membrane et du cytosquelette protéines 2,3. Ainsi, l'inhibition de GJIC peut refléter différents types de stress cellulaire, la perturbation des différentes fonctions cellulaires, ou perturbations de différentes voies de transduction du signal. Une autre approche pour surmonter l'utilisation des limitées bioessais de transduction du signal est de tirer profit des phénomènes biologiques que beaucoup, sinon la plupart, les voies de transduction du signal sont en outre modulés par les systèmes coopératifs de signalisation intercellulaires par les canaux des jonctions lacunaires 4-8. Bien que les systèmes de signalisation intercellulaires sont aussi nombreux et sous contrôle des voies multiples, la signalisation intracellulaire par le biais des canaux de jonction de brèche est finalement fonction des canaux étant ouverts, partiellement fermés, ou complètement fermés. Ceci permet d'obtenir un point d'extrémité qui peut être facilement mesurée en utilisant diversesdans les systèmes d'essais biologiques in vitro 7. Considérant que le point de consigne homéostatique d'un tissu nécessite des canaux ouverts, déterminer l'effet de composés sur les jonctions lacunaires communication intercellulaire (GJIC) est une approche plus globale pour déterminer les effets toxiques potentiels de composés 4,8. En substance, ce phénomène biologique essentiel qui joue un rôle central dans la coordination de multiples événements de transduction de signaux contrôlant l'expression génique permet une évaluation générale des effets toxiques. Ainsi, des essais biologiques qui évaluent GJIC sont un excellent point de départ pour évaluer le potentiel toxique des composés.

Les techniques les plus utilisées pour évaluer les étendues GJIC sont basés sur le préchargement des cellules avec une sonde fluorescente, puis de contrôler la migration du colorant à partir de la cellule ou des cellules de charge des cellules adjacentes. Techniques de préchargement le colorant ont impliqué microinjection 9, gratter chargement 10, et les esters méthyliques des sondes 11 . Le transfert de colorant de chargement fluorescent scalpel méthode (SL-DT) est une modification de la charge scrape - dye test de transfert développé par El Fouly 10. Plutôt que de l'éraflure plus invasive, la méthode scalpel de chargement de ce rapport implique un rouleau doux d'un scalpel avec une lame ronde à travers une monocouche de cellules qui minimisent les dommages invasive (figure 1). Les avantages de cette technique sont l'évaluation toxicologique d'une population de cellules plutôt que des cellules individuelles de l'essai de micro-injection. En outre, la simplicité de ce test permet la détection rapide de multiples plaques en un temps court alors que les méthodes utilisant des techniques et des techniques qui utilisent des esters méthyliques des sondes fluorescentes microinjection sont beaucoup plus de temps et nécessite le niveau de compétence considérablement plus élevé.

Bien qu'il n'y ait pas de méthode unique pour répondre à tous les besoins de l'étude GJIC; le dosage SL-DT est un test simple, relativement peu coûteux et polyvalent qui peutrépondre à de nombreux besoins pour les évaluations initiales des toxicités des différents composés. Les principaux avantages comprennent: la simplicité, aucun besoin particulier de l'équipement ou les compétences qui sont nécessaires pour d'autres méthodes telles que la microinjection, la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) test et activation locale moléculaires essais de sonde fluorescente, une évaluation rapide et simultanée de GJIC dans un grand nombre de cellules, propice à un haut débit mis en place avec la fluorescence automatisé imagerie par microscopie et l' analyse, ainsi que sa capacité d' adaptation pour les études in vivo.

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Protocole

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Le protocole de cette étude a été approuvée par le Comité d'utilisation des National Institutes of Health Sciences du Japon, qui est l' endroit où les expériences in vivo ont été réalisées, des soins et des animaux pour assurer que les rats ont été traités avec humanité et en tenant compte de la réduction de la souffrance.

1. SL-DT bioessai

  1. Seed 3 x 10 5 cellules épithéliales de foie de rat WB-F344 SUR DES 35 diamètre des plaques de culture mm contenant Eagles modifiés moyenne plus 5% de sérum de veau fœtal, et la culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C, l' humidité relative de 100% (RH), 5% CO 2.
  2. La culture des cellules jusqu'à ce qu'elles atteignent 100% de confluence (typiquement, de 2 jours) et effectuent le traitement expérimental désiré des cellules telles que décrites ci-dessous.
    1. Mener des expériences d'intervention Dose
      1. Ajouter 10 pi et 20 pi d'une solution à 2 mM de phénanthrène dans 100% d'acétonitrile et 4 pi, 6 pi et 8 pi d'une solution à 20 mM stock de phenanthrène dans 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pour chaque volume ajouté de solution de stock.
      2. Ajouter 4 pi, 6 pi 8 pi, 10 pi et 20 pi d'une solution à 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pour chaque volume ajouté de solution d'acétonitrile pour servir de contrôle du véhicule.
      3. Incuber les plaques pendant 15 min dans un incubateur réglé à 37 ° C, 100% HR et 5% de CO 2.
      4. Passez à l'étape 1.3.
    2. Conduite Temps Expériences de réponse
      1. Ajouter 7 ul d'une mM de solution mère 20 du phénanthrène à 100% d' acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pour chaque point de temps ( à savoir, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
      2. Ajouter 7 pi de 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pour chaque point de temps pour servir de contrôle du véhicule.
      3. Incuber les plaques pour chaque fois p désignémixte dans un incubateur à 37 ° C, 100% HR et 5% de CO 2.
      4. Passez à l'étape 1.3.
    3. Mener des expériences Temps de récupération
      1. Ajouter 7 ul d'une solution 20 mM dans du phénanthrène à 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pendant 15 min.
      2. Ajouter 7 ul d'acétonitrile à 100% pour trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pendant 15 min pour servir de contrôle du véhicule.
      3. Décanter le milieu contenant soit du phénanthrène ou de l'acétonitrile et de rinçage 3 fois chacun avec 3 ml de tampon phosphate salin (PBS).
      4. Ajouter 2 ml de milieu de croissance frais à chaque plaque et on incube pendant les temps de récupération désirées ( par exemple, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) , dans un incubateur à 37 ° C, 100 % d' humidité relative et à 5% de CO 2.
      5. Passez à l'étape 1.3.
    4. Les expériences de conduite du Mécanisme
      1. Ajouter l'inhibiteur de la transduction du signal, à savoir
      2. Ajouter 5 ul d'acétonitrile à 100% pour trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance pendant 15 min pour servir de contrôle du véhicule.
      3. Ajouter 7 ul d'une solution 20 mM dans du phénanthrène à 100% d'acétonitrile à trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance ainsi que le D609 pendant 15 minutes supplémentaires.
      4. Ajouter 7 ul d'acétonitrile à 100% pour trois plaques de cellules contenant 2 ml de milieu de croissance, plus le 100% d'acétonitrile pendant 15 minutes supplémentaires pour servir de contrôle du véhicule.
      5. Passez à l'étape 1.3.
  3. Jeter le milieu de culture soit en versant doucement sur le support ou par aspiration sous vide.
    Remarque: Eliminer le milieu de culture contenant des déchets dangereux de façon appropriée.
  4. Rincer les cellules trois fois avec 3 ml de PBS et soit décanter ou aspirez between rinçages.
  5. Introduire à la pipette 1 ml de 1 mg / ml de Lucifer Yellow colorant dissous dans du PBS (LY) dans chaque plaque de cellule.
  6. Précharger le colorant dans les cellules en douceur laminer une lame chirurgicale # 20 en acier avec un bord arrondi dans une population de cellules dans trois zones différentes de la plaque.
    1. Commencez par placer le scalpel perpendiculaire (90 °) et 5 mm du bord de la plaque de culture, puis rouler le scalpel sous cet angle perpendiculaire à environ un angle de 15 ° (voir Figure 1).
      Note: Ceci est réalisé en pinçant le scalpel entre l'index et le pouce. Utiliser la gravité pour permettre au scalpel pour passer doucement des 90 ° à 15 ° positions (comme la lame arrondie roule simplement sur les cellules). Cette motion laissera une ligne d'indentation notable visuellement.
  7. Incuber les cellules avec la solution LY pendant 3 min à température ambiante.
  8. Décanter ou aspirer le LY et rincer trois fois avec 3 ml de PBS pour éliminer tous les extracellular colorant pour éliminer extracellulaire fluorescence de fond.
  9. Ajouter 0,5 ml de solution à 10% de formaline tamponnée au phosphate pour fixer les cellules.
    Remarque: Après la fixation dans le formol, sécher à l'air les cellules et les stocker dans l'obscurité pendant jusqu'à deux ans avec photoblanchiment minimum du colorant LY. Lorsque cela est nécessaire, réhydrater avec une solution de formol à 10% pour visualiser le front du colorant fluorescent.
  10. Afficher les cellules fixées à l'aide d'un microscope à épifluorescence équipé d'un cube dichroïque pour les pics d'excitation / d'émission de 428/536 nm, à un grossissement de 200X. Aligner toutes les plaques de telle sorte que la ligne d'entaille est parallèle au champ de vision horizontal.
    Remarque: Un cube FITC dichroïque fonctionne bien.
    1. Capturez l'image avec une caméra CCD et un logiciel de support.
      1. Ouvrez le logiciel de support pour la caméra CCD et d'utiliser les paramètres d'exposition automatique. Utilisez le bouton "capture" d'acquérir numériquement l'image. Enregistrez l'image sous .tif fichiers en utilisant le bouton "Enregistrer".

2. Adaptation de la SL-DT Assay au foie Tissue

  1. Retirez environ un cm tranche du lobe gauche du foie 2 x 2 à partir d' un 5 semaines, mâle Fischer 344 rats en utilisant des ciseaux de dissection et le placer sur une matière plastique pesez plaque recouverte de gaze humide 12.
  2. Introduire à la pipette 0,5 ml d'une solution de PBS contenant 1 mg / ml chacun jaune lucifer et de la rhodamine-dextrane (RD) sur la surface de la tranche de foie dans la matière plastique plateau de pesée.
    Remarque: La RD est un colorant qui ne peuvent pas traverser les canaux de jonction gap et marquera les cellules qui ont été chargés.
  3. Faire trois à cinq incisions d'environ 1 cm de long sur la surface de la tranche de foie qui a la solution de colorant dans la plaque pesez avec une lame tranchante, puis ajouter un colorant supplémentaire suffisant pour remplir les incisions.
  4. Incuber le tissu pendant 3 min à température ambiante sur le plateau de pesée en plastique.
  5. Rinçage trois fois avec 5 ml de PBS.
  6. Fixer le ove de tissurnight dans 30 ml de 10% de tampon phosphate formol dans un tube à centrifuger conique de 50 ml dans l'obscurité à la température ambiante.
  7. Le lendemain, lavez les tranches avec de l' eau, couper le tissu autour de l'incision avec la dissection des ciseaux dans 1 x 1 x 0,5 cm 3 bandes et ensuite utiliser des techniques standard pour intégrer les tranches dans de la paraffine 13.
  8. Section des tranches perpendiculaires à la ligne d'incision à l' épaisseur de 5 pm et stocker les échantillons dans l'obscurité jusqu'à ce que prêt à être visualisés en utilisant des techniques de coupes standards avec un microtome 13.
  9. Utilisez un microscope à épifluorescence équipé d'un appareil photo numérique CCD de visualiser et de capturer les images des fronts de colorant fluorescent selon l'article 1.10 7.

3. Quantifier GJIC

  1. Mesurer la propagation de colorant fluorescent en utilisant un package morphométrique de logiciel (par exemple, ImageJ).
    1. Cliquez sur l'onglet "Fichier" puis cliquez sur "ouvrir" pour ouvrir laimage enregistrée.
    2. Cliquez sur l'outil "main libre" dans la barre d'outils Tab pour tracer le contour du front de colorant.
    3. Cliquez sur l'onglet "Analyse" puis cliquez sur "Mesure".
      Remarque: Cela va générer une valeur de zone dans une feuille de calcul, qui peut être copié dans d'autres programmes de la feuille de propagation si désiré.
  2. L'utilisation d'un programme de feuille de calcul, le calcul de la fraction de la commande (FOC) en divisant le domaine de la propagation de colorant dans la plaque expérimentale par la zone le colorant a voyagé dans la plaque de commande en utilisant l'équation suivante:
    figure-protocol-1
    A e = superficie de la propagation du colorant dans les cellules exposées à une variable expérimentale, telles que les cellules traitées avec un produit chimique à la dose ou la durée spécifique
    A c = surface de la propagation de colorant dans le contrôle, qui sont des cellules traitées avec le véhicule utilisé pour dissoudre le produit chimique d'intérêt
    Remarque: Pour déterminer l'effet du véhicule,Ae serait le domaine de la diffusion du colorant dans les cellules traitées par le véhicule et A c serait le domaine de la diffusion du colorant dans les cellules non traitées par le véhicule. L'effet du véhicule doit être de préférence inférieure à 10%.

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Résultats

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Interruption de GJIC a été largement utilisé comme un biomarqueur pour identifier des composés toxiques au niveau épigénétique non génotoxique de contrôle du gène qui induit des effets néfastes sur la santé 14. Par exemple, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des contaminants omniprésents dans l'environnement , mais varient dans leurs toxicités épigénétiques en fonction de leurs structures moléculaires 15. Les HAP de faible poids moléculaire se tr...

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Discussion

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Le dosage SL-DT est une technique simple et polyvalent dans la mesure GJIC, mais il y a plusieurs problèmes critiques qui devraient être pris en compte dans la conception de protocoles expérimentaux appropriés. Pour des mesures robustes de GJIC utilisant le test SL-DT il doit y avoir une bonne répartition de colorant de LY à travers les jonctions lacunaires des cellules. Au minimum, un délai suffisant doit être choisie pour assurer que le colorant se propage par huit ou plusieurs rangées de cellules à partir des cellule...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Soutenu par les subventions NIEHS #R01 ES013268-01A2, et le contenu relève de la seule responsabilité de l’auteur et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels du NIEHS, et soutenu par le projet CETOCOEN UPgrade No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
WB-F344 Cellules épithélialesDes Drs J. W. Grisham et M. S. Tsao de l’Université de Caroline du Nord (Chapel Hill, Caroline du Nord)aucuneFourni par les Drs J. W. Grisham et M. S. Tsao Université de Caroline du Nord-Chapel Hill-NC
Plaques de culture de 35 mmCorning430165
Flacons de culture de 25 cm2Corning430639
Flacons de culture de 75 cm2Corning430641
D-medium, un milieu modifié Eagles  ;ThermoFisher/GIBCO  ;Formule n° 78-5470EF
sérum fœtal bovinThermoFisher/GIBCO  ;10437
0,25 % trypsine-EDTA  ;ThermoFisher/GIBCO  ;15050
saline tamponnée au phosphatefaite maisonvoir ci-dessous pour les ingrédients cat#137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KCl JTBaker - Mallinckrodt  ;3040-01
NaClJT Baker - Mallinckrodt  ;3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt  ;3819--01
KH2PO4JT Baker - Mallinckrodt  ;3246-01
Lucifer Yellow CH, selde lithium Sigma-Aldrich ChemicalL0259
rhodamine-dextranSigma-Aldrich ChemicalR9379
1-méthylanthracèneSigma-Aldrich Chemical
phénanthrèneSigma-Aldrich ChemicalP11409
resvératrolSigma-Aldrich ChemicalR5010
D609Tocris Bioscience  ;1437
acétonitrilEMDAX0145-1
solution à 37 % formaldéhydeJT Baker - Mallinckrodt  ;2106-01
#20 lame chirurgicaleFine Science Tools Inc.  ;10317-14
Tubes stériles coniques de 50 mlThermo scientific  ;
microscope à épifluorescence Nikon  ;Nikon -Mager ScientificEclipse TE300
Nikon FITC cube dichroïqueNikon -Mager Scientific96107
Appareil photo CCDNikon -Mager ScientificNikon Cool Snap EZ système d’imagerie CCD
Nikon -Mager ScientificNikon NIS-Elements F2.2.
ImageJInstitut national de la santéhttp://imagej.nih.gov/ij/
hépatiques de rat , 339652

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
  2. Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130(2013).
  3. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  4. Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454(2015).
  5. Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
  6. Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
  7. Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
  8. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  9. Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
  10. El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
  11. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
  12. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
  13. Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
  14. Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
  15. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
  16. Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
  17. Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
  18. Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
  19. Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
  20. Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
  21. JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
  22. Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150(2014).
  23. Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
  24. Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
  25. Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
  26. Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
  27. Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).

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Mots-clés

Transfert de colorant fluorescent par chargement au scalpeltransfert de colorant Lucifer Yellowmicroscopie pifluorescenceessai de toxicit du ph nanthr neperturbation de la membrane cellulaireanalyse de la migration du colorantvaluation des effets des toxicantstoxicologie in vitroessai de biomarqueur fonctionnel

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