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Article de méthode

Patch Clamp Recordings sur Intact ganglions rachidiens de rats adultes

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DOI :

10.3791/54287

⸱

29 septembre 2016

 ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University of California, San Francisco, 2Department of Anatomy, University of California, San Francisco

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit comment préparer des ganglions de la racine dorsale intacts pour les enregistrements par patch clamp. Cette préparation maintient le microenvironnement des neurones et des cellules gliales satellites, évitant ainsi les changements phénotypiques et fonctionnels observés à l’aide de neurones DRG dissociés.

Résumé

Des études de patch-clamp de ganglions de la racine dorsale (DRG) neurones ont accru notre compréhension du système nerveux périphérique. À l'heure actuelle, la majorité des enregistrements sont effectués sur les neurones de DRG dissociés, ce qui est une préparation standard pour la plupart des laboratoires. propriétés neuronales, cependant, peuvent être modifiés par des lésions axonales résultant de la digestion enzymatique utilisée dans l'acquisition de neurones dissociés. En outre, les préparations de neurones dissociés ne peuvent pas représenter pleinement le microenvironnement de la DRG depuis la perte de contact avec les cellules gliales par satellite qui entourent les neurones sensoriels primaires est une conséquence inévitable de cette méthode. Pour surmonter les limitations dans l' utilisation de neurones classiques DRG dissociés pour les enregistrements de patch-clamp, dans ce rapport , nous décrivons une méthode pour préparer les DRG intactes et effectuer des enregistrements de patch-clamp sur les neurones sensoriels primaires individuels ex vivo. Cette approche permet la préparation rapide et simple des DRG intactes, imitant enconditions in vivo en gardant les neurones de DRG associés à leurs cellules gliales environnantes par satellite et de la membrane basale. En outre, le procédé permet d'éviter des lésions axonales de manipulation et de digestion avec une enzyme telle que lorsque les DRG dissociant. Cette préparation ex vivo peut en outre être utilisé pour étudier l'interaction entre les neurones sensoriels primaires et les cellules gliales par satellite.

Introduction

La sensation est essentielle à la survie et le bien-être d'un organisme. La transmission des impulsions dépend des voies sensorielles à partir des terminaisons périphériques des axones des neurones sensoriels primaires. neurones sensoriels primaires, à l'exception du noyau mésencéphalique du nerf trijumeau, sont situés dans les ganglions de la racine dorsale trijumeau (DRG). Ils servent en tant que gardiens de l'information sensorielle 1. À la membrane perikarial, tout comme au niveau des bornes centrales et périphériques, les neurones DRG expriment des récepteurs et des canaux ioniques, tels que les récepteurs du glutamate, récepteurs TNF alpha, le récepteur transitoire potentiel de canal de cations sous - famille V élément 1 (TRPV1), des canaux de sodium, etc. 2 -7. Enregistrements patch-clamp de la membrane perikarial permettent de comprendre les changements fonctionnels de plusieurs de ces récepteurs et des canaux à travers le neurone.

La technique d'enregistrement patch clamp est un outil puissant pour stumourir les activités des canaux ou des récepteurs et un grand nombre d'études ont été menées en appliquant cette technique sur les neurones DRG 8-10. Dans la plupart des études, le DRG est enlevé en coupant les radicelles dorsales et nerf spinal proche du ganglion. Après hachage, le ganglion est ensuite placé dans des enzymes digestives qui conduisent à la dissociation des neurones DRG, qui peuvent ensuite être enregistrées immédiatement ou mises en culture pendant plusieurs jours avant l'enregistrement. Malheureusement, la dissociation des neurones DRG implique une axotomie nécessaire près du péricaryons. Une fois dissociées et axotomisés, les neurones DRG subissent des modifications phénotypiques ainsi que des changements dans la membrane excitabilité 11,12. La perte de contact entre le péricaryons des neurones individuels et les cellules gliales par satellite qui entourent normalement eux est susceptible de contribuer à ces changements 13. La diaphonie entre les neurones et les cellules gliales par satellite est à la fois essentiel dans des conditions physiologiques et dans l'adaptation au pathologconditions iques telles que celles conduisant à la douleur intraitable 14,15. Il serait difficile d'étudier l'interaction entre les neurones et les cellules gliales par satellite en utilisant une préparation de DRG dissociés.

DRG intact, d'autre part, fournissent plus proche des conditions in vivo. Au cours des dernières années, notre laboratoire, ainsi que d'autres groupes, a eu recours à des DRG intacts de rats adultes pour étudier les changements de neurones sensoriels primaires dans différentes conditions associées à la douleur chronique 3-5,11,15-17. Bien que les techniques utilisées dans ces études sont peu établies, une description étape par étape n'a pas encore été publiée. Dans le présent manuscrit, nous décrivons un moyen pratique et rapide pour préparer les DRG intactes et leur utilisation pour les enregistrements de patch-clamp.

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Protocole

Déclaration éthique: Toutes les procédures pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire conforme aux règlements des comités UCSF sur la recherche animale et ont été réalisées conformément aux lignes directrices de la réglementation des NIH sur l'utilisation et les soins (Publication 85 animaux - 23, révisée en 1996 ). Le Comité de protection et de l'utilisation des animaux Institutional UCSF a approuvé les protocoles utilisés dans cette étude.

1. Préparation des instruments, Solutions et Plats

  1. Préparer liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa).
    1. Préparer 500 ml de 10x faible solution de cations, et 500 ml de solution de bicarbonate 10x (voir le tableau 1 et 2 pour la préparation de la solution). Conserver à 4 o C et l' utilisation dans un mois.
    2. Préparer 600 ml de LCRa frais en mélangeant 60 ml de 10x à faible solution de cations avec 60 ml d'une solution de bicarbonate, puis ajouter 480 ml d'eau déminéralisée pour atteindre un volume final de 600 ml. La bulle LCRa carbogène(5% de O 2 et 95% de CO2) pendant au moins 10 minutes avant utilisation.
  2. Pull Patch Pipette de Capillaire en verre.
    1. Placez verre mince capillaire à paroi dans un extracteur de pipette pour préparer pipettes d'enregistrement.
      Remarque: Dans notre laboratoire, les paramètres de réglage de l'extracteur suivants sont utilisés pour obtenir la forme de pipette idéale: la chaleur (510), la vitesse (32). La forme de pipette idéal pour l'enregistrement de DRG intact devrait avoir un cône mince progressive avec un angle de cône faible, et cela peut être mieux réalisé par essais et erreurs.
    2. Assurez -vous que la résistance de la pipette est 3-5 MQ lorsqu'il est rempli avec des solutions internes (voir le tableau 3 pour la préparation de la solution). S'il vous plaît se référer au Guide Axon pour la méthode détaillée de mesure de la résistance de la pipette 18.
  3. Ajouter 1 mg de collagénase à 400 ul d'aCSF, pour donner une concentration finale de 13 unités / ml. Ensuite, remplissez chaque pipette en verre avec environ 20 pi de solution de collagénase. boutiqueles pipettes remplies dans un -20 ° C congélateur et de les utiliser dans les trois semaines.
  4. Préparer 200 ml de LCRa froid (environ 4 o C). Pour refroidir le LCRa rapidement le placer dans un bécher, sceller avec une pellicule de plastique et placer dans un -20 ° C congélateur pendant environ 20 min jusqu'à ce qu'il commence à geler. Placer le bécher dans un bain de glace et bulle avec carbogène pendant 10 min. Bubble restant 400 ml de LCRa avec carbogène à la température ambiante.
  5. Alors que le LCRa se refroidit, couper l'extrémité d'une pipette de transfert en plastique jetable pour agrandir l'ouverture d'un diamètre de 5 mm (ce qui sera utilisé pour transférer le DRG). Recueillir les instruments chirurgicaux suivants: scalpel (# 15), Mayo droites et courbes ciseaux, fin 2 mm pointe gouges, Adson (dents) pince, iris, ciseaux à ressort et deux pinces fines. Versez le LCRa froid oxygéné dans des boîtes de Pétri 3 en verre (diamètre extérieur: 10 cm).

2. DRG Dissection

  1. Anesthetize un rat (200-220 g) avec pe de sodiumntobarbital (100 mg / kg, ip) et confirmer que le niveau de l'anesthésie est adéquate en testant la pédale réflexe et oeil réflexe clignement.
  2. Après avoir vérifié que le rat est anesthésié, de se raser la région lombaire et inciser la peau et du tissu sous-cutané le long de la ligne médiane. Détachez les muscles spinaux des apophyses épineuses au niveau L1-S2 en utilisant une rugine bien.
  3. Utilisez des ciseaux courbes pour couper les processus épineux de L1 à S2. Utilisez des ciseaux Mayo droites pour faire des coupes transversales dans la colonne vertébrale exposée à environ L1 et S1 et retirer ce segment de la colonne vertébrale en bloc et rapidement plonger dans LCRa froid (préparé à l' étape 1.5) pendant 2-3 min. Après la suppression des DRG lombaires, l'euthanasie est réalisée par une thoracotomie bilatérale alors que le rat est toujours sous anesthésie profonde au pentobarbital.
  4. Rincer hors du sang de la colonne vertébrale enlevé et tissu attaché et transférer à une boîte de Pétri avec LCRa froid. USE bien gouge pour enlever les lames. Couper la dure-mère le long de la ligne médiane avec microciseaux pour exposer la moelle épinière. Soulevez doucement la moelle épinière, et couper les racines nerveuses à leur point d'entrée dans la moelle épinière en utilisant l'iris de ciseaux, puis retirer la moelle épinière.
  5. Transférer la vertèbre restante avec les DRG à la seconde boîte de Pétri remplie de LCRa froid. Identifier le L4 et L5 DRG en fonction de leur position par rapport à des processus transversaux et le nerf sciatique.
    Remarque: Le maintien du nerf sciatique intacte aidera à identifier L4 et L5 DRG (le nerf sciatique provient des nerfs spinaux L4-6).
  6. Utilisez une pince Dumont et les ciseaux Noyes pour libérer les DRG des tissus conjonctifs environnants. Gardez la racine nerveuse et nerf spinal attaché aux DRG.
  7. Utilisez la pipette de transfert pour déplacer les DRG dans la troisième boîte de Pétri pour plus dissection.
  8. Sous le microscope de dissection, enlever soigneusement autant que possible de la épinèvre ème environnantee DRG.
    1. Utilisez les ciseaux à ressort Noyes pour couper une ouverture où la dorsale et ventrale racines rejoignent le DRG et séparent la racine ventrale de la DRG. Utilisez Dumont # 5 forceps à bouts arrondis pour maintenir le épinèvre, et d'utiliser une autre pince fine pour faire rouler le DRG du épinèvre.
    2. Continuer à supprimer autant que possible de épinèvre attaché à DRG en utilisant les pince fine.
      Note: Un DRG bien disséqué est important d'obtenir une bonne digestion dans l'étape suivante.

3. DRG Digestion

  1. Transférer le DRG vers la chambre d'enregistrement. Assurez-vous que le côté de DRG où les racines nerveuses proviennent orientée vers le bas.
    Remarque: De cette façon, la plupart des neurones sont accessibles.
  2. Utilisez un point d'ancrage pour stabiliser le DRG. Perfuse DRG avec oxygénée LCRa à un débit de 0,5 ml / min à travers des tubes en plastique reliés à une pompe péristaltique, qui est placé sur une table à côté de la plate-forme d'enregistrement.
  3. Attendre 30 minutes pour permettre aux cellules de se rétablir. Évaluer la qualité de la DRG sous infrarouge contraste d'interface différentielle (IR-DIC) optique à 40X grossissement de l'objectif par le biais d'une caméra CCD.
    Remarque: Les bons DRG contient habituellement de nombreux ronds, bien contrasté, les neurones entourés par les cellules gliales par satellite sur sa surface.
  4. Digest une petite zone de la surface de la DRG.
    Remarque: Les pipettes de patch en verre sont placés dans des supports de pipette, qui sont de petits tubes accouplements qui permettent d'être fixé à la pipette en verre avec un joint étanche à l'air.
    1. connecter individuellement deux 1 ml seringues pour les porteurs de pipettes à travers deux morceaux de petit tube en caoutchouc de diamètre. Mettre une pipette en verre remplie avec de la collagénase dans l'un des porteurs de pipette et une pipette en verre vide dans l'autre.
    2. Utilisez le micromanipulateur pour positionner les pipettes juste au-dessus du DRG. Puis, sous microscope grossissement, entrer en collision les conseils de deux pipettes uns contre les autres doucement pour agrandir les ouvertures des embouts de pipette (Idéalement, un diamètre de 5-10 um).
    3. Déplacer la pipette remplie d'enzyme à proximité de la surface du DRG et brièvement appliquer une pression positive à la pipette contenant de la collagénase dans le tube reliant le support et la seringue par le déplacement du piston d'environ 0,5 ml.
      Remarque: Sous la pression, l'écoulement de l'enzyme à partir de la pipette va légèrement agrandir l'espace entre les neurones DRG, qui peuvent servir de signe pour l'application de l'enzyme.
    4. Après 10 à 15 min, lorsque des débris du épinèvre restant est observée, appliquer une pression négative douce à la pipette vide pour aspirer les débris.
      Note: De cette façon, les neurones et les cellules gliales environnantes satellites seront clairement exposés et prêt pour l'enregistrement de patch.
    5. Jeter les deux pipettes dans le conteneur pour objets tranchants.

4. patch clamp Recordings

  1. Placer la solution d'électrode (voir tableau 3) sur la glace pour empêcher la dégradation. Remplir la pipette de patch en verre avecsolution filtrée intracellulaire (filtre de seringue, la taille des pores: 0,2 um) et placez la pipette dans le support headstage de pipette. Appliquer une légère pression positive à la pipette par l'intermédiaire d'une seringue de 5 ml en déplaçant le piston d'environ 1 ml avant d'abaisser la pipette dans la solution de bain.
    Note: Ceci empêche la pipette de se bloquer.
  2. Choisissez le mode "V-clamp" en tournant le bouton de mode de l'amplificateur, puis ouvrez "test Membrane" interface dans le logiciel. Déplacer la pipette à proximité du neurone cible en cours d'inspection au microscope.
    Remarque: Dans la préparation de DRG intact, une mince couche de cellules gliales par satellite encapsule chaque neurone.
  3. Utiliser une pression positive de la pipette pour traverser la couche de cellules gliales par satellite jusqu'à ce qu'un élargissement brusque de l'espace entre le neurone et une couche périphérique de cellules gliales par le satellite est observée. Continuez à déplacer la pipette vers le neurone jusqu'à ce qu'un "fossette" est observé sur le neurone.
    Remarque: par rapport auxenregistrements de neurones dissociées, la pression positive doit être un peu plus grande, ce qui aidera à pénétrer dans la couche de cellules gliales par satellite et d'augmenter les chances de succès rapiéçage.
  4. Réduire la pression positive. Ensuite, obtenir un joint de giga ohms avec une aspiration douce.
    Remarque: Avec cette méthode, le taux d'enregistrement de réussite est d'au moins 70%.
  5. Obtenir la configuration d'enregistrement de cellules entières comme décrit précédemment 19.
    1. En bref, pénétrer dans la membrane cellulaire des neurones par l'intermédiaire d'une aspiration forte mais brève. Vous pouvez également utiliser la fonction "zapper" sur l'amplificateur tandis que l'aspiration est appliquée.
    2. Une fois qu'un mode de cellule entière est établie, compenser la capacité des cellules entières et une résistance série (Rs) en tournant la capacité du condensateur et de compensation de résistance à molettes sur l'amplificateur.
      Note: Rs est normalement 5-20 MQ.
    3. Abandonner la cellule si Rs est initialement supérieure à 30 MQ; ou Rs change de plus de 20% durant l'enregistrement. Aussimesurer le potentiel de membrane au repos; abandonner une cellule si le potentiel de membrane au repos est supérieure à -50 mV.
  6. Fermez la fenêtre "test Membrane". Choisissez le mode "I-clamp normal" en tournant le bouton de mode de l'amplificateur.
  7. Cliquez sur "protocole ouvert" dans le logiciel, sélectionner et charger le protocole de mesure de rhéobase. Cliquez sur "record" pour lancer l'enregistrement. Mesurer la résistance d'entrée et Rhéobase pour examiner l'excitabilité neuronale en injectant une série graduée de dépolarisation courants dans les étapes de 100 pA.
    1. Cliquez sur "protocole ouvert" et sélectionnez le protocole de mesure de seuil de membrane. A 500 ms dépolarisants courant de rampe (2 000 pA / s) seront injectés dans le neurone.
    2. Utilisez l' acquisition de données et de logiciels d'analyse (par exemple Clampfit) pour analyser les traces enregistrées selon les instructions du fabricant. Utilisez le logiciel pour calculer la résistance d'entrée (Rin) sur la base de l'état d'équilibre IV relationship pendant les courants hyperpolarisants livrés. Déplacer le curseur pour mesurer la valeur de rhéobase et membrane seuil.
      Remarque: L'amplitude du courant nécessaire pour induire le point d'accès est défini comme étant la rhéobase et la tension la plus basse pour induire l'AP est défini comme seuil de la membrane.
  8. Enregistrer les Ligand Induced Currents.
    1. Remplir la pipette avec les agonistes spécifiques.
      Note: Dans le présent rapport, nous avons utilisé 100 uM de glutamate et 100 uM AITC pour induire les courants induits par les récepteurs du glutamate et des récepteurs de TRPA1 respectivement.
    2. Vérifiez la pipette pour assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air à l'intérieur. Placer la pipette dans le porte-pipette. Connecter le support de pipette d'un tube relié à un système de distribution de médicament.
    3. Utilisez le manipulateur pour déplacer la pipette à moins de 50 um du neurone. Régler la pression du système médicament de distribution à 1 psi et la durée de 1 sec. Changez le mode d'enregistrement à la tension de serrage et serrer à -70 mV. appliquer brièvement via le système de distribution de médicament de la pression pour enregistrer un courant induit par un médicament.

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Résultats

La figure 1 montre le processus de préparation DRG intact pour l' enregistrement de patch. La figure 1A montre l'exposition et l' emplacement du ganglion après laminectomie. Figure1B montre L3, L4 et L5 DRG avec les racines nerveuses attachées après avoir enlevé la moelle épinière. Ensuite, L4 et 5 DRG sont soigneusement disséqués et libérés des vertèbres. Ensuite, le épinèvre, une membrane transparente qui entoure le DRG, es...

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Discussion

Nous rapportons une méthode pour préparer les DRG entiers pour les études de patch-clamp. Il y a plusieurs éléments clés pour préparer un spécimen idéal. Tout d'abord, il est important de disséquer les DRG avec des racines dorsales jointes. Après cela, le épinèvre doivent être soigneusement enlevés tout en évitant des dommages aux neurones. Enfin, afin d'exposer les neurones et les cellules gliales environnantes par satellite, il est nécessaire de digérer le tissu conjonctif restant. DRG Intact de rats adultes p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier la Fondation pour la recherche sur la douleur pour le soutien apporté au travail. Ce travail a également été soutenu par les subventions R01 NS080921-01 et R21 NS079897-01A1 des NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pentobarbital sodiumvortech Pharmaceuticals
seringueBD3096591 ml, 5 ml.
scalpelBDtaille : 15
Ciseaux droits MayoFine Science Tools14010-15
Ciseaux incurvés MayoFine Science Tools14011-15
RongeurFine Science Tools16021-14
Pince dentée AdsonFine Science Tools11027-12
Iris ScissorFine Science Tools14084-08
Ciseaux à ressort NoyesOutils de science fine15124-12
Ciseaux à osOutils de science fine16044-10Spécial pour couper les os.  ;
Pince : Dumont, Dumoxel Biologie #5Fine Science Tools11252-30 Ceux-ciont les pointes fines qui n’ont pas besoin d’être affûtées lors de l’achat initial.
élévateur périostéSklar97-0530
Microscope de dissectionWILD
Pipette de transfertmarque Fisher13-711-5AM
Boîte de Pétri (10 cm)PyrexBoîte de Pétri en verre peut éviter d’endommager les pointes des pinces fines
Collagénase (Liberase TM)Roche05-401-119-001dissoudre à la concentration de 13 U/ml, aliquote dans une pipette en verre. Évitez le gel et le dégel répétés.
filtreThermo scientific7232520Filtrez les solutions internes pour l’enregistrement par patch clamp afin d’éviter le colmatage.
Pipette en verreSutterBF150-110-7.5
AncreAppareil Havard64-0250stabiliser le DRG pour éviter la dérive.
Pompe péristaltiqueWPI
Extracteur de pipetteSutterP97
AmplificateurDispositifs moléculairesAxopatch 200B
NumériseurDispositifs moléculairesMicroscope 1440D
Micro-manipulateur NIKONFN600
SutterMPC200
micro-injection système de distributionGeneral ValvePicrospitzer IIsystème d’application rapide de médicaments
Carbogen (95 % O2, 5 % CO2)Fournisseur local de
gaz médicaux

Références

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