Article de méthode

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d'extraction de l'ADN simple et rapide

DOI :

10.3791/54289

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6 août 2016

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1Center for Innovation in Global Health Technologies (CIGHT), Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Pritzker School of Medicine, The University of Chicago

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons ici un procédé d'extraction d'ADN simple et rapide à base de papier d'ADN proviral du VIH dans le sang total détecté par PCR quantitative. Ce protocole peut être étendu pour une utilisation dans la détection d'autres marqueurs génétiques ou en utilisant des méthodes d'amplification alternatives.

Résumé

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FINA, l'isolement de filtration d'acides nucléiques, est une nouvelle méthode d'extraction qui utilise une filtration verticale par l'intermédiaire d'une membrane de séparation et un tampon absorbant pour extraire l'ADN cellulaire du sang entier en moins de 2 minutes. L'échantillon de sang est traité avec un détergent, brièvement mélangés et appliqués à la pipette sur la membrane de séparation. Le lysat en évacuant le buvard en raison de l'action capillaire, la capture de l'ADN génomique à la surface de la membrane de séparation. L'ADN extrait est retenu sur la membrane lors d'une étape de lavage simple, dans laquelle les inhibiteurs de PCR sont méchants dans le tampon buvard absorbant. La membrane contenant l'ADN piégé est ensuite ajouté à la réaction de PCR sans autre purification. Cette méthode simple ne nécessite pas d'équipement de laboratoire et peut être facilement mis en œuvre avec des fournitures de laboratoire peu coûteux. Nous décrivons ici un protocole de détection très sensible et la quantification de l'ADN du VIH-1 proviral de sang total de 100 ul en tant que modèle pour le début dele diagnostic fant du VIH qui pourraient facilement être adapté à d'autres cibles génétiques.

Introduction

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Plusieurs rapports ont discuté de l'élaboration de méthodes d'extraction de papier ou à base de membranes pour une utilisation au point-of-care (POC) dispositifs 1-5 avec le but de rendre la sensibilité exquise et la spécificité du diagnostic moléculaire disponible pour tous. L'Organisation mondiale de la santé (OMS) sur les maladies sexuellement transmissibles Initiative Diagnostics a inventé le terme ASSUREE (, sensible, spécifique, conviviale, rapide et robuste, sans équipement et livré à ceux qui en ont besoin abordables) pour décrire les caractéristiques idéales d'un POC essai 6. Parmi ces lignes directrices, la caractéristi....

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Protocole

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déclaration éthique: L'ensemble des échantillons de sang utilisés dans cette étude ne sont pas considérés comme de la recherche impliquant des sujets humains. Les échantillons ont été obtenus à des fins de diagnostic clinique, qui ont été satisfaites, et la partie restante de ces spécimens ont été fournis pour le test de recherche de la FINA. Les spécimens ont été codées de telle sorte que les enquêteurs ne sont pas en mesure de vérifier facilement l'identité des personnes.

1. Préparation du module de préparation FINA Sample

  1. Préparer pad buvard en coupant un épais tapis de coton 35 x 35 mm 2 d'un 2,6 mm à 100%. Coupez un pad ....

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Résultats

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Le flux de travail pour extraire l' ADN proviral du sang entier additionné de cellules 8E5-LAV est représenté sur la figure 1. La figure 2 montre le module d'échantillonnage FINA et préparé qPCR tube. Cette méthode permet une amplification efficace du provirus VIH-1 à partir de cellules 8E5-LAV à différents nombres de copies, comme le montre la courbe d' étalonnage des échantillons artificiels (figure 3). PCR a eu une efficacité de 103%,.......

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Discussion

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EID liée à l' accès à un traitement rapide a été démontrée pour réduire la mortalité infantile due à l' infection par le VIH 16. En raison de la persistance des anticorps maternels dans le sang d'un enfant, les tests rapides d'anticorps anti-VIH ont une utilité limitée pour déterminer le statut des nourrissons exposés au VIH. L'OMS recommande que tous les nourrissons nés de mères VIH-1 positifs devraient être testés à 4-6 semaines d'âge, à l' aide d' un test virologique 17.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Le développement de ce protocole a été soutenu par la subvention 37774 de la Fondation Bill et Melinda Gates pour les Grands Défis en Santé Mondiale. Les réactifs et les conseils de PCR en temps réel ont été fournis par Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL. Les cellules 8E5-LAV ont été fournies par le Laboratoire d’assurance de la qualité en virologie de Rush Presbyterian ; Centre médical St. Luke. Du sang séronégatif pour le VIH-1 a été fourni par Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Merci à Mark Fisher pour l’aide en photographie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fusion 5GE Healthcare Life Sciences8151-9915
707 tampon buvardVWR International28298-014
PARAFILM MVWR International52858-000
Ruban de diagnostic en polyester double face 3M  ;3M Spécialités Médicales9965
200 & micro ; l Tubes de bandelettes qPCRAgilent401428
capuchons de bandelettes optiquesAgilent401425
Mx3005p Système qPCRAgilent401456
hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich221465A.C.S.
Reagent Triton X-100Sigma-AldrichT9284BioXtra
diméthyl sulfoxydeSigma-AldrichD8418pour biologie moléculaire
sérum fœtal bovin, certifié, origine américaineThermo Fisher Scientific16000-044
Perforatrice à percussion Diamètre de petit trou de 3/16 » (5,1 mm)McMaster Carr3424A16
Perforatrice à percussion Diamètre de trou de 1/4 » (7,14 mm)McMaster Carr3424A19
Perforatrice à percussion de 5/16 » de diamètre de trou (8,35 mm)McMaster Carr3424A23

Références

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  1. Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
  2. Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem

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Mots-clés

chantillon de sangaction capillaireinhibiteurs de la PCRPCR en temps r elprovirus du VIH 1diagnostic pr coce chez le nourrissonpr paration d chantillons

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