Nous décrivons ici un procédé d'extraction d'ADN simple et rapide à base de papier d'ADN proviral du VIH dans le sang total détecté par PCR quantitative. Ce protocole peut être étendu pour une utilisation dans la détection d'autres marqueurs génétiques ou en utilisant des méthodes d'amplification alternatives.
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Article de méthode
Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d'extraction de l'ADN simple et rapide
Dans cet article
Résumé
Résumé
FINA, l'isolement de filtration d'acides nucléiques, est une nouvelle méthode d'extraction qui utilise une filtration verticale par l'intermédiaire d'une membrane de séparation et un tampon absorbant pour extraire l'ADN cellulaire du sang entier en moins de 2 minutes. L'échantillon de sang est traité avec un détergent, brièvement mélangés et appliqués à la pipette sur la membrane de séparation. Le lysat en évacuant le buvard en raison de l'action capillaire, la capture de l'ADN génomique à la surface de la membrane de séparation. L'ADN extrait est retenu sur la membrane lors d'une étape de lavage simple, dans laquelle les inhibiteurs de PCR sont méchants dans le tampon buvard absorbant. La membrane contenant l'ADN piégé est ensuite ajouté à la réaction de PCR sans autre purification. Cette méthode simple ne nécessite pas d'équipement de laboratoire et peut être facilement mis en œuvre avec des fournitures de laboratoire peu coûteux. Nous décrivons ici un protocole de détection très sensible et la quantification de l'ADN du VIH-1 proviral de sang total de 100 ul en tant que modèle pour le début dele diagnostic fant du VIH qui pourraient facilement être adapté à d'autres cibles génétiques.
Introduction
Plusieurs rapports ont discuté de l'élaboration de méthodes d'extraction de papier ou à base de membranes pour une utilisation au point-of-care (POC) dispositifs 1-5 avec le but de rendre la sensibilité exquise et la spécificité du diagnostic moléculaire disponible pour tous. L'Organisation mondiale de la santé (OMS) sur les maladies sexuellement transmissibles Initiative Diagnostics a inventé le terme ASSUREE (, sensible, spécifique, conviviale, rapide et robuste, sans équipement et livré à ceux qui en ont besoin abordables) pour décrire les caractéristiques idéales d'un POC essai 6. Parmi ces lignes directrices, la caractéristique sans équipement est particulièrement difficile à réaliser pour le diagnostic moléculaire. Cependant, toute innovation dans le domaine va avancer l'objectif d'atteindre ceux qui en ont le plus besoin, et il y a un espoir d'amélioration à court terme des performances de test en adaptant la technologie 7 existante.
Nous décrivons ici un protocole simple pour extraire l'ADN du sang totalqui ne nécessite pas la chimie complexe ou l'instrumentation de laboratoire. La FINA (Isolement de filtration d'acides nucléiques) méthode de préparation des échantillons a été initialement développé pour extraire l'ADN des leucocytes du sang entier afin de détecter le VIH-1 provirus dans le cadre d'un point-of-care (POC) échantillon à réponse PCR quantitative (qPCR) infantile diagnostic précoce plate - forme (EID) pour une utilisation dans des contextes de ressources limitées 8-11. L' extraction FINA diffère des procédés de purification classiques qui utilisent des membranes de silice ou des particules paramagnétiques enrobées de silice de se lier de façon réversible l' ADN en présence d'agents chaotropes 12. Au lieu de cela, la FINA utilise une filtration verticale par l'intermédiaire d'une membrane de séparation pour en extraire l'ADN cellulaire du sang entier directement. La membrane contenant l'ADN piégé peut être placé directement dans un tube PCR et soit immédiatement utilisée dans une réaction PCR ou séché à l' air pour une amplification ultérieure 9. Aucun des agents chaotropiques, le phénol, ou les alcools sont utilisés dans l'extraction de l'échantillon, eliminating les vastes Les étapes de lavage nécessaires pour éliminer les inhibiteurs de qPCR puissants issus du processus d'extraction 13,14.
La membrane peut capturer la FINA soit des cellules 9 ou l' ADN génomique libéré par la lyse des cellules 11 avant que l'échantillon est ajouté à la membrane. Pour la capture des cellules, du sang entier est ajouté directement à la membrane. Les cellules sont ensuite lysées dans la membrane par addition de NaOH 10 mM. L'avantage de cette méthode est qu'elle ne comporte que trois étapes: 1) addition de l'échantillon; 2) la lyse cellulaire / lavage et 3) le placement filtre à disque dans qPCR tube. L'inconvénient de cette méthode est que la membrane peut contenir uniquement un nombre défini de cellules directement proportionnelle au diamètre du disque de membrane. Pour atteindre la limite de détection requis pour EID, 100 ul de sang entier est nécessaire pour l'entrée échantillon qui comporte un filtre qui est trop grand pour être placé dans un tube qPCR. La lyse des cellules du sang avec un détergent avant d'ajouter l'échantillon à la collectionMembrane ajoute une étape de traitement, mais permet l'utilisation d'un filtre plus faible pour la même taille de l'échantillon. Nous avons été en mesure de démontrer une reproductibilité élevée, la détection de copie unique, et la quantification de aussi peu que 10 copies de VIH-1 ADN proviral de 100 pi de sang à l' aide de cette configuration de test 11.
Dans ce rapport, nous décrivons le protocole FINA initialement développé pour une utilisation en laboratoire. Le sandwich membrane / filtre connu sous le nom du module de préparation d'échantillon FINA peut être préparé en grandes séries et stocké pour une utilisation ultérieure. Quand les échantillons doivent être extraits, ce processus prend 2 minutes et peut être réalisée en faisant varier la taille des lots. Le qPCR peut être exécuté immédiatement ou les filtres contenant l'ADN intégré peut être stocké jusqu'à ce qu'il soit commode d'exécuter qPCR. Cette méthode est très pratique pour l'analyse de routine des échantillons dans les deux milieux basses et hautes ressources.
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Protocole
déclaration éthique: L'ensemble des échantillons de sang utilisés dans cette étude ne sont pas considérés comme de la recherche impliquant des sujets humains. Les échantillons ont été obtenus à des fins de diagnostic clinique, qui ont été satisfaites, et la partie restante de ces spécimens ont été fournis pour le test de recherche de la FINA. Les spécimens ont été codées de telle sorte que les enquêteurs ne sont pas en mesure de vérifier facilement l'identité des personnes.
1. Préparation du module de préparation FINA Sample
- Préparer pad buvard en coupant un épais tapis de coton 35 x 35 mm 2 d'un 2,6 mm à 100%. Coupez un pad par spécimen.
- Préparer un film de paraffine en plastique avec une bande support papier par un morceau de film de paraffine de coupe (25 mm (h) de 50 mm (w)), puis percer un trou d'un diamètre de 7,14 mm dans le centre de la bande à l'aide d'un marteau entraîné perforatrice. Préparer une bande par spécimen.
- Préparer une membrane de séparation de sang en verre lié (membrane de capture) disque en poinçonnant un cercle de 8,35 mm de diamètreà l'aide d'un marteau entraîné perforatrice. Percez un disque par spécimen. Le disque a une capacité de rétention de particules de 2,3 um.
- Assembler le module de préparation d'échantillons FINA en plaçant le disque de capture dans le centre du tampon buvard en utilisant une pince. Placer la bande de film de paraffine sur le disque de capture de telle sorte que le trou de la bande de paraffine quitte le centre du disque de capture exposée.
- Assurer un contact maximum entre le disque et le tampon buvard en étirant la bande de paraffine légèrement pour couvrir le buvard et en appuyant sur la bande de paraffine fermement pour coller au tampon buvard autour de tous les bords du disque.
- Faire autant de modules que nécessaire pour l'expérience ou des stocks pour une utilisation future.
2. Préparation de qPCR Tube
- Préparer une cassette de disque de 5,1 mm qui va mouiller la membrane de capture de cellules sur le côté du tube qPCR pour empêcher la membrane de bloquer la détection de la fluorescence en poinçonnant un cercle de polye double facester bande de diagnostic avec un marteau entraîné poinçon à partir d'une feuille de la bande. Préparer un disque de bande par spécimen.
- Retirez un côté de l'autocollant de revêtement de la bande. Placer la bande dans un tube de PCR de 200 ul, la coller sur un côté et vers le bas du tube. Retirez le second revêtement autocollant. Le tube est maintenant prêt à recevoir le disque préparé.
- Produire autant de tubes selon les besoins de l'expérience ou de réserve pour utilisation ultérieure.
3. Contrive échantillon de sang
Remarque: Si un échantillon de test véritable est en cours de préparation, passez à l'étape 4.
- Décongeler les cellules 8E5-LAV 15 hébergeant une seule copie du VIH-1 provirus obtenus à partir du laboratoire d' assurance de la qualité Virology (VQA; Rush Presbyterian / St Luke Medical Center de Chicago, IL.).
Nota: Ils sont stockés sous forme de pastilles de cellules congelées à une concentration de 4000 cellules / ul. Nombre de cellules a été vérifiée comme décrit précédemment 9. - Préparer serdilution ial dans un milieu de congélation (90% de sérum bovin fœtal, 10% de diméthylsulfoxyde) à des concentrations allant de 1 à 400 cellules / ul.
- Pipeter 10 uL des cellules provenant de chacune des dilutions en série dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 100 ul de frais VIH-1 EDTA négative traitée échantillon de sang entier dans chaque tube pour créer une courbe standard de nombres de copies 8E5-LAV 10-4,000. Mélanger doucement en tapotant le fond du tube 5 fois.
4. Effectuez FINA Extraction
- lyser les cellules sanguines en ajoutant du Triton-X100) à une concentration finale de 1% (11 pl de 10% de Triton-X100 à 110 ul de sang et des cellules de l'étape 3.3 entier).
- Mélanger doucement en tapotant le fond du tube 5 fois. Le sang devient rouge translucide.
- Pipeter tous les échantillons de sang sur le disque de capture.
Remarque: un joint étanche à l'eau entre la bande de paraffine et la membrane de capture assure que le sang coule à travers la membrane, et un bon contact entre la capture membrane et buvard assemblage de tampon assure évacuation rapide des échantillons. - Laisser l'échantillon à tremper à travers le filtre.
Remarque: Les mèches de lysat sanguin dans le buvard en raison de l'action capillaire, la capture de l'ADN génomique à la surface du disque de capture. Le lysat a trempé dans le disque quand il apparaît matte. - Ajouter 600-1000 ul de NaOH 10 mM goutte à goutte sur le disque de capture.
Note: Le tampon de lavage peut également être ajouté sous forme d'une addition en masse de 600 ul. La mémoire tampon forme une goutte sur la bande de paraffine hydrophobe et la mèche à travers le trou du disque à approximativement 20 secondes. Le filtre passe du rouge au blanc jeu indiquant l'hémoglobine. - Séparer le disque du buvard avec une pince et d'appliquer le disque à la bande dans le tube préparé PCR. S'il y a une couleur rouge à gauche sur le filtre ajouter 50-100 pi de tampon de lavage pour nettoyer le filtre avant de le placer dans le tube.
Remarque: Rarement, excès de pression appliquée lors de la préparationla FINA modules des résultats dans le partitionnement des couches de membranes pendant la séparation du tampon buvard. Jeter ces disques et de préparer un nouvel échantillon. - Après le filtre est placé dans le tube PCR, analyser les échantillons immédiatement. Alternativement, sécher pendant la nuit dans une boîte contenant du sulfate de calcium déshydratant, puis cap et placer dans un sachet en aluminium avec déshydratant de silice et de stocker jusqu'à ce prêt pour l'analyse.
5. qPCR Réaction
- Préparer 100 pl qPCR Master Mix par réaction en utilisant le VIH amorces et sondes spécifiques comme décrit précédemment 9,11. Inclure un contrôle interne d'amplification pour surveiller la présence d'inhibiteurs d'amplification et de vérifier qu'un échantillon négatif est un vrai négatif. Assurez-vous que le filtre est entièrement recouvert de mélange maître et que le filtre reste fixe à côté du tube de toute la réaction.
- Effectuer amplification à l' aide d' un dispositif de PCR en temps réel comme décrit précédemment 9.
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Résultats
Le flux de travail pour extraire l' ADN proviral du sang entier additionné de cellules 8E5-LAV est représenté sur la figure 1. La figure 2 montre le module d'échantillonnage FINA et préparé qPCR tube. Cette méthode permet une amplification efficace du provirus VIH-1 à partir de cellules 8E5-LAV à différents nombres de copies, comme le montre la courbe d' étalonnage des échantillons artificiels (figure 3). PCR a eu une efficac...
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Discussion
EID liée à l' accès à un traitement rapide a été démontrée pour réduire la mortalité infantile due à l' infection par le VIH 16. En raison de la persistance des anticorps maternels dans le sang d'un enfant, les tests rapides d'anticorps anti-VIH ont une utilité limitée pour déterminer le statut des nourrissons exposés au VIH. L'OMS recommande que tous les nourrissons nés de mères VIH-1 positifs devraient être testés à 4-6 semaines d'âge, à l' aide d' un test virologique 17...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le développement de ce protocole a été soutenu par la subvention 37774 de la Fondation Bill et Melinda Gates pour les Grands Défis en Santé Mondiale. Les réactifs et les conseils de PCR en temps réel ont été fournis par Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL. Les cellules 8E5-LAV ont été fournies par le Laboratoire d’assurance de la qualité en virologie de Rush Presbyterian ; Centre médical St. Luke. Du sang séronégatif pour le VIH-1 a été fourni par Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Merci à Mark Fisher pour l’aide en photographie.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 tampon buvard | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| Ruban de diagnostic en polyester double face 3M ; | 3M Spécialités Médicales | 9965 | |
| 200 & micro ; l Tubes de bandelettes qPCR | Agilent | 401428 | |
| capuchons de bandelettes optiques | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p Système qPCR | Agilent | 401456 | |
| hydroxyde de sodium | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. |
| Reagent Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| diméthyl sulfoxyde | Sigma-Aldrich | D8418 | pour biologie moléculaire |
| sérum fœtal bovin, certifié, origine américaine | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Perforatrice à percussion Diamètre de petit trou de 3/16 » (5,1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Perforatrice à percussion Diamètre de trou de 1/4 » (7,14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Perforatrice à percussion de 5/16 » de diamètre de trou (8,35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
Références
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
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Réimpressions et autorisations
