Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d'isolement

Résumé

Cette étude compare deux méthodes différentes d’isolement de monocytes humains pour obtenir des cellules dendritiques (DC) in vitro. Les monocytes sont sélectionnés par adhérence ou enrichis négativement par séparation magnétique. Le rendement et la viabilité des monocytes ainsi que la viabilité, la prolifération et l’expression des marqueurs de surface CD11c/CD14 seront comparés entre les deux méthodes.

Résumé

Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d’antigènes du système immunitaire qui jouent un rôle crucial dans les réponses lymphocytaires, les mécanismes de défense de l’hôte et la pathogenèse de l’inflammation. L’isolement et l’étude des CD ont été importants dans la recherche biologique en raison de leurs caractéristiques distinctives. Bien qu’ils soient des médiateurs clés essentiels du système immunitaire, les CD sont très rares dans le sang, représentant environ 0,1 à 1 % du total des cellules mononucléées sanguines. Par conséquent, les alternatives aux méthodes d’isolement reposent sur la différenciation des CD à partir de monocytes isolés à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Il est impératif d’envisager l’utilisation de techniques d’isolement appropriées qui combinent simplicité, prix abordable, grande pureté et rendement élevé des cellules. Dans la présente étude, deux méthodes distinctes de génération de CD seront comparées. Les monocytes ont été sélectionnés par adhérence ou enrichis négativement à l’aide d’une procédure de séparation magnétique suivie d’une différenciation en DC avec IL-4 et GM-CSF. La viabilité, la prolifération et le phénotype des monocytes et des MDDC ont été évalués à l’aide de colorants de viabilité, d’un test MTT et d’une analyse des marqueurs de surface CD11c/CD14 par cytométrie en flux d’imagerie. Bien que la méthode de séparation magnétique ait donné un pourcentage significativement plus élevé de monocytes ayant une capacité de prolifération plus élevée par rapport à la méthode d’adhésion, les résultats ont démontré la capacité des deux techniques à générer simultanément des monocytes capables de proliférer et de se différencier en CD11c+ MDDC viables après sept jours de culture. Les deux méthodes ont donné > 70 % de CD11c+ MDDC. Par conséquent, nos résultats fournissent des informations qui contribuent au développement de méthodes fiables pour l’isolement et la caractérisation des CD humains.

Introduction

Les cellules dendritiques (CD) sont des médiateurs essentiels des systèmes immunitaires innées et adaptatives. Ils fonctionnent à induire des réponses immunitaires primaires et faciliter le développement de la mémoire immunologique. Ces cellules sont principalement responsables de capture d' antigène, la migration et la stimulation des cellules T et sont donc appelées cellules comme professionnels présentant l'antigène (CPA) ¹ .Manipulation des PED pourraient être utilisés dans un large éventail de domaines de recherche et dans le cadre clinique pour traiter différents des maladies inflammatoires telles que le VIH ^6,7, le cancer, les maladies auto - immunes ^{8, 9} et ¹⁰ des réactions allergiques. DC sont également utilisés pour la recherche sur la toxicomanie afin de résoudre des mécanismes et des voies inconnues , tels que ceux associés à la dépendance à l'alcool ^11-14, la dépendance aux drogues ^13,15, et la combinaison de l' infection et de la substance VIH abus ^16-19. Ces études en cours et les futures études de recherche in le domaine de l' immunologie faire dans la production in vitro de DC extrêmement important pour la recherche. Cependant, il existe plusieurs difficultés associées à l' isolement DCs à partir de sang humain comme elles ne constituent que 0,1 à 1% du nombre total de cellules mononucléées du sang ^20.

À ce jour, quelques - unes des méthodes bien établies pour la production de CD in vitro consiste en plastique ou en verre adhérence des monocytes ^21,22, la densité centrifugation gradient ^23, séparation spécifique à base de marqueur tel que magnétique tri cellulaire activé ^22, fluorescent tri cellulaire activé ^24, sélection positive des monocytes CD14 + à l' aide de nanoparticules magnétiques dextran revêtues ^25, et l' isolement rapide des monocytes hautement purifiés à l' aide de la sélection de cellule négative entièrement automatisé ^26. Cependant, la meilleure méthode de choix reste controversé. Par conséquent, pour améliorer les techniques de génération de courant continu, plusieurs méthodes ont été mises au point, dans lequella pureté de ces cellules peut être fortement augmentée par la différenciation de cellules progénitrices CD34 + et les monocytes purifiés isolés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ^27. Comme mentionné avant, une méthode largement utilisée et populaire pour générer monocytes des cellules dendritiques dérivées (de MDDCs) est d'explorer la capacité des monocytes à adhérer au verre ou en plastique (méthode d'adhérence) ^21,22,27. Le procédé d'adhérence est une méthode simple et rapide qui ne nécessite pas l'utilisation d'un équipement complexe. Cependant, certains inconvénients de ce procédé comprennent la contamination des lymphocytes, une faible flexibilité et de manipulation monocyte transitoire ^28. Une méthode alternative à la méthode d'adhérence est l'isolation magnétique des monocytes à partir de PBMC totaux, en particulier avec l'utilisation d'un kit d'enrichissement de monocyte humain, qui est destinée à isoler des monocytes à partir des PBMC par sélection négative ^26. Au cours de cette procédure, les cellules indésirables sont ciblées pour l'élimination de tétramèreles complexes d'anticorps et des particules magnétiques revêtues de dextrane. L'avantage de cette méthode d'isolement est que les cellules marquées non désirées sont séparés à l'aide d'un aimant tandis que les cellules cibles peut être versé librement au loin dans un nouveau tube sans qu'il soit nécessaire pour les colonnes. A ce jour, la disponibilité d'anticorps monoclonaux spécifiques qui peuvent étiqueter des populations de cellules uniques, la technique de séparation magnétique est devenue non seulement une méthode supplémentaire, mais une nécessité pour l'isolement de cellules rares dans le domaine de l'immunologie. Par exemple, des techniques telles que la cellule magnétique de tri disponibles dans le commerce avec paramagnétiques MACS-nanoparticules ont facilité le développement de nouvelles approches pour la recherche et les applications cliniques ^22,29. En outre, des études récentes comparant génération DC à partir de méthodes monocytes d'adhérence et de la technologie MACS ont démontré une pureté et la viabilité plus élevée DC en utilisant MACS monocytes ^22,30 séparés.

Les cadeaux de l'étude en coursune comparaison entre les deux procédés pour la production de CD humaines à partir de monocytes isolés à partir de PBMC: 1) l'isolement de monocytes par adhérence et 2) l'isolement de monocytes par sélection négative en utilisant un kit commercial d'enrichissement de monocytes humains. Cette étude fournit des preuves pour montrer que la procédure de sélection de séparation magnétique négatif pour isoler les monocytes génère le plus haut rendement de monocytes avec aucune différence significative dans la viabilité des monocytes par rapport aux monocytes isolés par la méthode d'adhérence. À son tour, au bout de sept jours, les monocytes isolés par séparation magnétique différenciées en MDDCs avec une capacité proliférative significativement plus élevée et plus grande quantité de cellules exprimant positive double (CD11c + / CD14 +) phénotype sans affecter CDMD viabilité. Dans l'ensemble, l'étude actuelle diffère des études antérieures mentionnées ci-dessus car elle démontre la capacité des deux techniques pour générer simultanément des monocytes qui sont capables de proliférer et de se différencier en cd11cMDDCs (> 70%) après sept jours de culture sans compromettre leur viabilité. En outre, l'approche actuelle prévoit la première caractérisation temporelle de CD11c différents / populations CD14 MDDCs par flux d'imagerie cytométrie.

En résumé, étant donné que les PED jouent un rôle central en ce qui concerne la recherche dans le domaine de l' immunologie, des paramètres différents doivent être pris en considération lors de l' examen comment ils sont dérivés et quelles méthodes sont utilisées pour isoler et les cultiver in vitro. Par conséquent, cette étude vise à fournir des indications sur deux méthodes différentes d'isolement des monocytes et comment ces méthodes affectent différemment monocytes la viabilité et le rendement peut éventuellement affecter la viabilité des cellules dendritiques, la prolifération et le phénotype. Ces résultats contribueront grandement au domaine de l'immunologie et fournira un protocole détaillé de DC isolement, la purification et la caractérisation.

Protocole

Des études globales de sang humain ont été examinés et approuvés par le comité d'examen institutionnel (IRB) de CRF, protocole IRB approbation # IRB-13-0440. leukopaks humains ont été achetés auprès de la banque de sang de la communauté à Miami, Floride.

1. Isolement des PBMC par gradient de densité standard Technique

1. Effectuer une dilution 1: 1 de sang avec une solution saline 1x-tamponnée au phosphate dans un flacon T75.
2. Introduire à la pipette 15 ml d'une solution à gradient de densité dans 50 ml de tubes de centrifugeuse et soigneusement couche (25 - 30 ml / tube) du sang dilué sur ce gradient.
3. Centrifuger pendant 20 min à 1200 x g avec une accélération et une décélération de 1 à 0.
4. Après centrifugation, recueillir la couche d'interface (globules blancs) dans un nouveau tube centrifuge de 50 ml et laver les cellules deux fois dans du PBS (3 min à 1.080 xg). Rejeter le surnageant à chaque fois.
5. Traiter les cellules avec du chlorure d'ammonium et de potassium de lyse (ACK) du tampon (pour lyser les globules rouges). Ajouter 10 ml de tampon et encubate pendant 15 min à 4 ° C.
6. Laver les cellules deux fois avec PBS, centrifuger 3 min à 1.080 xg et jeter le surnageant à chaque fois.
7. Enregistrer le culot, qui contiendra les CMSP.
8. Procéder à la méthode de purification des monocytes de choix.

2. monocytes Purification par adhésion Méthode

1. Préparer un milieu de culture cellulaire complet contenant de la L-glutamine (300 mg / ml) et additionné de pénicilline (50 U / ml) -streptomycin (50 pg / ml) et 10% de sérum bovin foetal.
2. Permettre d'adhérer PBMC pendant environ 2 heures en les cultivant dans un flacon T75 à une concentration de 5 x 10 ⁷ cellules par 10 ml de milieu complet à 37 ° C et 5% de _CO2 dans un incubateur humidifié.
3. Après incubation, éliminer les cellules flottantes non adhérentes du flacon de culture et laver délicatement les cellules adhérentes deux fois avec PBS.
4. Incuber les cellules adhérentes dans du milieu complet de culture cellulaire supplémenté avec 2 ul / ml de granulocytes humain macr-ophage facteur de stimulation des colonies (GM-CSF) et l'interleukine 4 (IL-4) stocké à une concentration stock de 10 pg / ml.
5. Changer la moitié du milieu et de reconstituer toutes les cytokines 48 h.
6. Autoriser 5 - 7 jours pour la différenciation des monocytes en MDDCs.

3. monocytes Purification par la méthode de séparation magnétique

1. Collecter des PBMC à partir de la technique à gradient de densité standard, verser dans un tube en polystyrène de 5 ml et remettre en suspension dans du tampon PBS à une concentration de cellules / ml.
2. Ajouter un cocktail d'enrichissement de monocytes humains en utilisant des cellules de 50 ul / ml, bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 10 min.
3. Après incubation, ajouter des particules magnétiques en utilisant des cellules de 50 ul / ml, bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 5 min.
4. Apportez suspension cellulaire jusqu'à un volume total de 2,5 ml en ajoutant du tampon PBS, bien mélanger par pipetage de haut en bas 2 - 3 fois.
5. Placer le tube de polystyrène sans bouchon dans le dispositif magnétique et mettre de côté à température ambiante pendant 20,5 min.
6. Après incubation et dans un mouvement continu, ramasser l'aimant et verser la fraction purifiée souhaitée de monocytes dans un 50 ml tube de centrifugation propre.
7. Incuber les cellules adhérentes dans du milieu complet de culture cellulaire supplémenté avec 2 ul / ml de facteur de stimulation de colonies (GM-CSF), de granulocytes-macrophages humains et d'interleukine 4 (IL-4) stocké à une concentration stock de 10 pg / ml.
8. Chaque 48 heures, changer la moitié du milieu, tourner vers le bas à 1.080 xg pendant 5 min et remettre en suspension culot avec les nouveaux médias (cRPMI) et des cytokines.
9. Autoriser 5 - 7 jours pour la différenciation des monocytes en MDDCs.

4. L'exclusion au bleu Trypan dosage de viabilité

Remarque: Utilisez cette technique pour obtenir un rendement cellulaire et la viabilité des CMSP, monocytes et MDDCs.

1. la récolte des cellules à l'aide de type trypsine-EDTA et d'effectuer des lavages des flacons et le culot de cellules en utilisant du PBS. En fonction de la taille de la pastille, remettre en suspension dans 5 à 10 ml de PBS pour dissoudre la pastille.
2. Dans un tube de micro-centrifugeuse, effectuer une dilution 1: 1 de réactif bleu trypan avec culot cellulaire dilué.
3. A partir de ce mélange, aliquote de 10 ul dans une cellule de comptage diapositive et lire les résultats en utilisant un compteur de cellules automatisé selon le protocole du fabricant. Si un compteur de cellules automatisé ne sont pas disponibles, une numération cellulaire similaire est possible en utilisant un hémocytomètre ou d'un compteur manuel.

5. Dosage MTT

1. Cellules de la plaque à une concentration de 4 x 10 ^4/100 pi de milieu complet par puits dans une plaque à 96 puits. Autoriser 24 h pour les cellules de s'adapter à la culture.
2. Incuber et effectuer des lectures à 0 (jour 0), 36 (jour 3) et 84 (jour 7) h respectivement.
3. A la fin de l'incubation désiré, retirer le support et le remplacer par 100 ul de PBS seul.
4. Préparer l'acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-solution diphényl tétrazolium (MTT) (5 mg / ml) en ajoutant 10 ml d'dimethyl (DMSO) à 1 g de dodécylsulfate de sodium (SDS).
5. Ajouter 10 ul (5 mg / ml) de solution de MTT à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 2 heures supplémentaires.
6. Après incubation, retirer surnageants contenant du PBS et le mélange de MTT non converti (solution jaune-couleur).
7. Ajouter 100 pi de solution de SDS-DMSO dans chaque puits et incuber pendant une heure supplémentaire.
8. Lire l'absorbance à 540 nm en utilisant un lecteur de microplaques.

6. surface cellulaire Coloration Analyse par imagerie cytométrie de flux

1. Au bout de 7 jours de différenciation des monocytes purifiés, distribuer des aliquotes 1x10 ⁶ cellules des cellules dendritiques dérivées de monocytes dans le nombre approprié de tubes de 1,5 ml.
2. Commencer la coloration de la surface cellulaire par les cellules de blocage à l'aide de 50 pi de inactivé à la chaleur (HI) dans le sérum humain, on incube à 4 ° C pendant 10 min.
3. Après incubation, les cellules de centrifugation à 720 g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant.
4. Pour cellule pellet, ajouter des anticorps conjugués à un fluorochrome respectifs (par exemple, anti-CD11c ou anti-CD14) et incuber à 4 ° C pendant 20 minutes à l' abri de la lumière. Dans des tubes séparés, préparer un seul fluorochrome tachée échantillons / ml), car ils sont nécessaires à une indemnisation.
5. Après incubation, laver les cellules deux fois dans 1 ml de tampon PBS et centrifuger à chaque fois à 720 xg pendant 5 min.
6. Maintien de cellules protégées de la lumière, remettre en suspension dans du tampon PBS à une concentration de cellules / 100 ul pour analyse par cytométrie en flux.
7. Afin de grille sur des cellules viables, ajouter 1 pi de DAPI à chaque tube avant d'acquérir les cellules sur le seul flux d'imagerie cellulaire instrument de cytométrie en suivant les instructions du fabricant.

7. Analyse statistique

1. Entrée toutes les données dans une feuille de calcul.
2. Comparer les résultats en utilisant le test t de l'étudiant et / ou un ANOVA selon le cas.
3. Envisager des différences statistiquement significatives si p <0,05.

Résultats

Monocyte Rendement par séparation magnétique est plus élevé par rapport à monocytes Rendement par adhésion Méthode

Les données présentées sur la Figure 1 affichage CMSP et le nombre de cellules de monocytes par la méthode d'exclusion au bleu Trypan à jour de l' isolement des CMSP et la séparation des monocytes. En moyenne, les monocytes isolés par le procédé d'adhérence représ...

Discussion

Sur la base des difficultés connues d'isolement et de générer MDDCs de sang humain, la présente étude vise à fournir une comparaison détaillée des deux méthodes bien établies pour la génération de MDDCs. La première méthode comparée est une méthode traditionnelle bien établie pour générer MDDCs en exploitant la capacité des monocytes à adhérer au verre ou en plastique (méthode d'adhérence) ^21,22,27. La méthode d'adhésion est rapide et rentable, et ne nécessite pas l'utilisation d'équipemen...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	Doit être utilisé chez RT
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Life Technologies	10010-023
Tampon de lyse ACK	Qualité Biologique	118-156-101
RPMI 1640 medium	Life Technologies	22400-089
Antibiotique-Antimycosique (100x)	Life Technologies	15240-062
Sérum fœtal bovin (FBS)	Life Technologies	16000-044
Tampon RoboSep	StemCell	20104
EasySep Kit d’enrichissement en monocytes humains	StemCell	19059
TC20 Compteur de cellules automatisé	Bio-Rad	145-0101
FITC-Dextran	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Coloration au bleu de trypan (0,4 %)	Life Technologies	15250-061
Lecteur multimode Synergy 2	Biotek	7131000
XTT Bioréactif au sel de sodium (XTT)	Sigma Aldrich	X4626-100MG
Bioréactif au sulfoxyde de diméthyle (DMS)	Sigma Aldrich	D8418-500ML
Bromure de tétrazolium au bleu de thiazolyle (MTT)	Sigma Aldrich	m5655-500MG
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Bio-Rad	161-0302
Méthosulfate de phénazine (DMSO)	Sigma Aldrich	P9626-1G
Inactivé (HI) Sérum humain	Chemicon	S1-100ML
Accuri C6 Cytomètre en flux	BD Accuri	653119
FlowSight Amnis Cytomètre en flux	EMD Millipore	100300