Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

Elizabeth M. Dlugosz; Scott C. Lenaghan; C. Neal Stewart, Jr.

doi:10.3791/54300

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Article de méthode

Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

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DOI :

10.3791/54300

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27 septembre 2016

Elizabeth M. Dlugosz¹ , Scott C. Lenaghan²^,³ , C. Neal Stewart, Jr.¹

¹Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, ²Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, ³Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

Dans cet article

Résumé

Une méthode à haut débit automatisée, la production de tabac en protoplastes et la transformation est décrite. Le système robotisé permet l'expression du gène massivement parallèle et de découverte dans le système modèle BY-2 qui devrait être traduisible aux cultures non-modèle.

Résumé

Au cours de la dernière décennie, il y a eu une résurgence de l'utilisation des protoplastes végétaux qui vont des espèces modèles pour recadrer les espèces, pour l'analyse des voies de signalisation de la transduction, les réseaux de régulation transcriptionnelle, l'expression des gènes, génome d'édition, et la neutralisation des gènes. En outre, des progrès significatifs ont été réalisés dans la régénération des plantes à partir de protoplastes, qui a généré encore plus d'intérêt dans l'utilisation de ces systèmes pour la génomique végétale. Dans ce travail, un protocole a été mis au point pour l'automatisation de l'isolement de protoplastes et la transformation de 2 (PAR-2) la culture du tabac en suspension un «Bright Yellow» en utilisant une plate-forme robotique. Les procédures de transformation ont été validés à l'aide d'une protéine fluorescente orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) sous le contrôle du promoteur de chou-virus de la mosaïque 35S (35S). OFP expression dans des protoplastes a été confirmée par microscopie à épifluorescence. Les analyses comprenaient également des méthodes d'efficacité de production protoplastes utilisant propidium iodure. Enfin, les enzymes de qualité alimentaire à faible coût ont été utilisés pour la procédure d'isolement de protoplastes, de contourner la nécessité d'enzymes de laboratoire de qualité qui sont un coût prohibitif en haut débit automatisé isolement et l'analyse protoplastes. Basé sur le protocole mis au point dans ce travail, la procédure complète de l'isolement de protoplastes à la transformation peut être réalisée en moins de 4 heures, sans aucune intervention de l'opérateur. Alors que le protocole mis au point dans ce travail a été validé avec la culture cellulaire BY-2, les procédures et les méthodes doivent être traduisible à tout système de culture en suspension végétale / protoplastes, ce qui devrait permettre une accélération de la recherche en génomique des cultures.

Introduction

Ces dernières années , il y a eu une impulsion significative placé sur la conception des cultures transgéniques pour surmonter diverses maladies ^1, conférer une résistance aux herbicides ^2, confère la sécheresse ^3,4 et la tolérance au sel ^5, prévenir herbivory ^6, augmenter le rendement de la biomasse ^7, et de diminuer la paroi cellulaire récalcitrante ^8. Cette tendance a été favorisée par le développement de nouveaux outils moléculaires pour générer des plantes transgéniques, y compris le génome d'édition en utilisant CRISPR et TALENs ⁹ et silençage génique par ARNdb ^10,<....