Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

Summary

Une méthode est décrite selon laquelle les nanoparticules de points quantiques (QD) peuvent être utilisées pour des études immunocytochimiques corrélatives de tissus pathologiques humains enrobés d’époxy. Nous utilisons des QD conjugués à des fragments d’anticorps commerciaux qui sont visualisés par fluorescence à grand champ, microscopie optique et microscopie électronique à transmission.

Abstract

On décrit une méthode par laquelle quantique point (QD) nanoparticules peuvent être utilisées pour des études immunocytochimiques corrélatifs de tissu pathologie humaine à l'aide de la microscopie optique de fluorescence Widefield et la microscopie électronique à transmission (MET). Pour démontrer le protocole que nous avons immuno-sections époxy ultrafines de tumeur somatostatinome humaine en utilisant un anticorps primaire à la somatostatine, suivi d'un anticorps secondaire biotinylé et visualisation avec de la streptavidine conjuguée à 585 nm, de cadmium et de sélénium (CdSe) points quantiques (QD). Les sections sont montées sur une grille d'échantillon TEM ensuite placé sur une lame de verre pour l'observation par microscopie optique à champ large de fluorescence. La microscopie optique révèle 585 nm marquage QD comme la fluorescence orange vif formant un motif granuleux dans le cytoplasme des cellules tumorales. Au bas de milieu de gamme de grossissement par microscopie optique du motif de marquage peut être facilement reconnu et le niveau de marquage non spécifique ou de fond évaluée. Ceci est un importantl'étape d'interprétation ultérieure du motif immunomarquage par TEM et de l'évaluation du contexte morphologique. La même section est ensuite épongé sec et vu par TEM. sondes QD sont vus pour être attaché à un matériau amorphe contenue dans les granules sécrétoires individuels. Les images sont acquises de la même région d'intérêt (ROI) vu par microscopie optique pour l'analyse corrélative. Correspondant des images de chaque modalité peut ensuite être mélangés pour superposer des données de fluorescence sur TEM ultrastructure de la région correspondante.

Introduction

Éclairage corrélative et la microscopie électronique (CLEM) est une approche puissante pour l'analyse des événements dynamiques transitoires ^1, les événements rares ^{2, 3} et complexes systèmes ^4. Il existe de nombreuses permutations techniques différentes disponibles ⁵ en fonction de la question posée mais une exigence commune est que la même structure dans un seul échantillon ⁶ est imagé par de multiples modalités de microscopie. Notre approche particulière de CLEM a été développé pour l'étude des tissus d' archives de pathologie humaine et le cas utilisé ici a été bien caractérisé et publié précédemm....

Protocol

1. Tissue Dissection et fixation

1. Dissection Tissue
   1. Disséquer morceaux de tissu à partir d'un échantillon de la tumeur ou de tissu biopsie réséqué chirurgicalement.
      Remarque: Le tissu utilisé dans cette étude a été régulièrement fixé dans le formol, mais le tissu frais est également approprié. Nous avons choisi une zone confirmée et rapportée par un anatomopathologiste pour contenir somatostatinome tumeur après coloration histologique de routine et immunocoloration anti-somatostatine (non représentés).
   2. Utiliser des morceaux de tissu , ne dépassant pas environ 1,0 mm ^3.
2. Pré....

Results

Le spécimen somatostatinome tumorales utilisées dans cette étude comprenaient les cellules tumorales forment des structures canalaires mélangés avec le tissu collagénique stomie. Par microscopie optique à fluorescence, les cellules tumorales individuelles qui contiennent des granules sécrétoires abondantes ont présenté un marquage positif pour l'hormone somatostatine. Nuclei apparu trous sombres avec un minimum de marquage non spécifique détectable (Figure 1). A de faibl.......

Discussion

Cette étude a démontré l'utilité potentielle des QDs comme sondes universelles pour les études de CLEM. Les 585 nanoparticules nm QD utilisées ont montré une fluorescence brillante et stable lorsqu'elle est vue par microscopie optique à champ large et ont été facilement observés par MET. Une étude précédente par l' un des auteurs présents a montré QDs aussi être adapté à la microscopie optique super-résolution ^7. Leur photostabilité a été particulièrement utile pour des périodes d'observation .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cacodylate de sodium	Proscitech	C0205	Produit chimique nocif
Tétroxyde d’osmium	Proscitech	C010	Utilisation uniquement dans la hotte
Acétate d’uranyle	Univar-Ajax	569	Produit chimique dangereux
Éthanol 100 %	Fronine	JJ008
Acétone 100 %	Fronine	JJ006
ERL 4221	Proscitech	C056
DER 732	Proscitech	C047
NSA	Proscitech	C059
DMAE	Proscitech	C050
Métaperiodate de sodium	Analar BDH	10259
Anticorps anti-somatostatine	Dako	A0566
Anticorps diluant	Dako	S3022
Qdot 585 Conjugué de streptavidine  ;	Invitrogen	Q10113MP
Anticorps IgG anti-lapin de chèvre biotinylé	Sigma	B7389-1ML
Glutaraldéhyde 50 %	EMS	16320
Sérum de chèvre normal	Invitrogen	PCN5000
PBS « Dulbecco A"	Oxoid  ;
BSAc (10 %)	Aurion	900.022
Parafilm	Pechiney PP	M
Bandelettes indicatrices de pH (pH 2.0 - 9.0)	Merck	1.09584.0001
Micromoules	Proscitech	RL063
Couteau diamanté	Diatome	Ultra 45
Microscope électronique à transmission	FEI	Morgagni 268D
Microscope optique à fluorescence	Carl Zeiss	Axioscope A1
Grilles 300 mesh nickel (barre mince)	Agar Scientific	G2740N
Ultramicrotome	RMC	Powertome
TEM logiciel de contrôle de caméra	Soft Imaging System	AnalySIS	Version 3.0
Logiciel de traitement d’images	Adobe Systems Photoshop	CS2