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Article de méthode

Corrélative Light- et Microscopie électronique Utilisation de Quantum Dot Nanoparticules

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DOI :

10.3791/54307

⸱

7 août 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

Dans cet article

Résumé

Une méthode est décrite selon laquelle les nanoparticules de points quantiques (QD) peuvent être utilisées pour des études immunocytochimiques corrélatives de tissus pathologiques humains enrobés d’époxy. Nous utilisons des QD conjugués à des fragments d’anticorps commerciaux qui sont visualisés par fluorescence à grand champ, microscopie optique et microscopie électronique à transmission.

Résumé

On décrit une méthode par laquelle quantique point (QD) nanoparticules peuvent être utilisées pour des études immunocytochimiques corrélatifs de tissu pathologie humaine à l'aide de la microscopie optique de fluorescence Widefield et la microscopie électronique à transmission (MET). Pour démontrer le protocole que nous avons immuno-sections époxy ultrafines de tumeur somatostatinome humaine en utilisant un anticorps primaire à la somatostatine, suivi d'un anticorps secondaire biotinylé et visualisation avec de la streptavidine conjuguée à 585 nm, de cadmium et de sélénium (CdSe) points quantiques (QD). Les sections sont montées sur une grille d'échantillon TEM ensuite placé sur une lame de verre pour l'observation par microscopie optique à champ large de fluorescence. La microscopie optique révèle 585 nm marquage QD comme la fluorescence orange vif formant un motif granuleux dans le cytoplasme des cellules tumorales. Au bas de milieu de gamme de grossissement par microscopie optique du motif de marquage peut être facilement reconnu et le niveau de marquage non spécifique ou de fond évaluée. Ceci est un importantl'étape d'interprétation ultérieure du motif immunomarquage par TEM et de l'évaluation du contexte morphologique. La même section est ensuite épongé sec et vu par TEM. sondes QD sont vus pour être attaché à un matériau amorphe contenue dans les granules sécrétoires individuels. Les images sont acquises de la même région d'intérêt (ROI) vu par microscopie optique pour l'analyse corrélative. Correspondant des images de chaque modalité peut ensuite être mélangés pour superposer des données de fluorescence sur TEM ultrastructure de la région correspondante.

Introduction

Éclairage corrélative et la microscopie électronique (CLEM) est une approche puissante pour l'analyse des événements dynamiques transitoires 1, les événements rares 2, 3 et complexes systèmes 4. Il existe de nombreuses permutations techniques différentes disponibles 5 en fonction de la question posée mais une exigence commune est que la même structure dans un seul échantillon 6 est imagé par de multiples modalités de microscopie. Notre approche particulière de CLEM a été développé pour l'étude des tissus d' archives de pathologie humaine et le cas utilisé ici a été bien caractérisé et publié précédemment 7. L'objectif était d'une part, de maximiser les données analytiques à partir d'une seule biopsie ou un échantillon chirurgical et d'autre part, d'utiliser la microscopie optique de fluorescence pour aider à clarifier le contexte du modèle de marquage immunocytochimique vu au niveau ultrastructural.

nanocristaux de points quantiques (PQ) offrent la possibilité d'un système marqueur universel able à être considéré par les deux, la microscopie optique de fluorescence et microscopie électronique 8, 9, 10. Leur structure de noyau cristallin permet QDs de tailles différentes pour produire une large gamme de pics d'émission de fluorescence lorsqu'il est excité par la lumière à des longueurs d' onde loin de leurs spectres d'émission 11. Leur poids atomique est suffisante pour produire la densité électronique détectable par microscopie électronique à transmission, la microscopie électronique à balayage par transmission (STEM) ou par microscopie électronique à balayage à émission de champ. Ils sont particulièrement adaptés à des études immunocytochimiques que même BQs uniques peuvent être observées donnant une sensibilité ultime d'une QD par molécule cible 12. En outre, selon le QD utilisé, ils peuvent posséder une signature élémentaire individuelle approprié pour la cartographie.

Des échantillons de pathologie humaine offrent des avantages importants pour la recherche biomédicale translationnelle. des échantillons de tissus chirurgicaux et biopsie sont régulièrement soumis à des biobanques et appropéthique RIATE autorisations sont accessibles pour des études de recherche. Le tissu humain n'a pas les questions de pertinence ou de l' interprétation qui peuvent se produire chez l' animal ou dans des modèles in vitro de la maladie. Cependant, la préparation des échantillons d'échantillons de pathologie est souvent pas optimale. Il peut y avoir de retard dans le tissu étant placé dans un fixateur, fixateur inapproprié utilisé, tel que la formaline plutôt que glutaraldéhyde pour TEM et de l'échantillonnage inapproprié. CLEM méthodes ont la possibilité d'optimiser l'information diagnostique et pronostique disponible à partir d'un seul échantillon humain. Cependant, certaines approches corrélatives nouvellement développés tels que ceux utilisant un mini générateur d'oxygène singulet (miniSOG) ne sont pas disponibles pour une utilisation en pathologie en raison de la nécessité de la balise pour être génétiquement codée dans la cellule d'intérêt 13. Pour cette raison, nous avons exploré l'utilité de l'étiquetage QD du tissu TEM régulièrement préparé pour les études immunocytochimiques corrélatifs. QDs appliquée à l'époxy gravé ou sections de résine acrylique de lides échantillons de biopsie et de tissus ghtly aldéhyde fixes offrent la possibilité d'obtenir la microscopie optique de fluorescence corrélative et les données TEM à partir d'un seul échantillon.

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Protocole

1. Tissue Dissection et fixation

  1. Dissection Tissue
    1. Disséquer morceaux de tissu à partir d'un échantillon de la tumeur ou de tissu biopsie réséqué chirurgicalement.
      Remarque: Le tissu utilisé dans cette étude a été régulièrement fixé dans le formol, mais le tissu frais est également approprié. Nous avons choisi une zone confirmée et rapportée par un anatomopathologiste pour contenir somatostatinome tumeur après coloration histologique de routine et immunocoloration anti-somatostatine (non représentés).
    2. Utiliser des morceaux de tissu , ne dépassant pas environ 1,0 mm 3.
  2. Préparation du tampon cacodylate
    1. Préparer une solution tampon de stock (1 M) en ajoutant 21,4 g de cacodylate de sodium (voir la liste des matériaux) et 3,0 ml de solution à 1% de chlorure de calcium à 90 ml d'eau distillée, puis le remplissage de la solution à un volume final de 100 ml. Agiter la solution et laisser reposer pendant la nuit afin que le réactif cristallin se dissout complètement.
    2. Préparer un tampon de solution de travail en ajoutant 20 ml de solution mère à 170 ml d'eau, puis vérifier le pH avec les bandes indicatrices. Ajuster le pH à 7,4 par addition de 3 - 4 gouttes de HCl à 3%. Compléter la solution jusqu'à un volume final de 200 ml avec une molarité finale de 0,1 M.
  3. Préparation et utilisation fixatif
    1. Ajouter une ampoule de 10 ml de solution de glutaraldéhyde 50% à 20 ml de solution stock cacodylate de sodium (1 M). Compléter avec de l'eau distillée à 190 ml. Contrôler le pH et ajuster à 7,4 par addition de 1 - 4 gouttes de 3% d'acide chlorhydrique (HCl), si nécessaire.
    2. Compléter avec de l'eau distillée pour obtenir un volume final de 200 ml.
    3. Immerger le tissu dans un fixateur contenant 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M à pH 7,4 pendant 24 heures à 4 ° C dans un tube à essai en verre. Jeter fixateur utilisé après 1 semaine.

2. Traitement des tissus et Embedding

  1. Osmium Tetroxyde coloration
    1. Après la fixation est terminée, immerger le tissu dans un tampon de cacodylate de sodium (0,1 M) pendant 20 minutes, puis on répète pendant 20 minutes.
    2. Préparer un osmium aqueux tétroxyde 2% (OSO 4) solution de travail en ajoutant 8,0 ml d'une OsO 4 solution stock de 5% à 2,0 ml de solution de sodium cacodylate tampon de stock (1 M) et 10,0 ml d'eau distillée pour obtenir un volume final de 20,0 ml.
    3. Retirez le tampon puis immerger le tissu dans 2% OsO 4 à pH 7,4 pendant 4 heures à la température ambiante.
      ATTENTION! Soyez prudent lorsque décante et préparation OsO 4 solutions, porter un équipement de protection individuelle approprié et de travailler dans une hotte à tout moment.
  2. Uranyle Acétate Coloration
    1. Après osmication de tissu est terminée, retirez la solution OsO 4 et immerger le tissu dans de l' acétate de sodium à 2% pendant 10 min. Éliminer l'acétate de sodium à 2%, puis plonger dans 2% d'acétate d'uranyle pendant 1 heure àtempérature ambiante.
  3. déshydration
    1. Déshydrater tissulaire par des alcools gradués. En utilisant 50% d'éthanol pendant 10 minutes, 70% d'éthanol pendant 10 min, 95% d'éthanol pendant 10 minutes et deux changements d'éthanol à 100% pendant 20 minutes à chaque fois à la température ambiante.
    2. Effectuer deux changements de 100% d'acétone pendant 30 min chacun.
  4. Résine Imprégnation et Durcissement
    1. Mélanger la résine époxy à faible viscosité dans un gobelet jetable en polyéthylène. Ajouter 10,0 g de dioxyde de vinylcyclohexène (ERL 4221) un monomère époxy, 6 g d'éther diglycidylique de polypropylène glycol (DER 732) et 26,0 g d'anhydride succinique nonényle (NSA). Mélanger soigneusement à la main en utilisant des bâtons en bois pendant 2 min.
    2. Ajouter quinze gouttes de 2-diméthylaminoéthanol (DMAE) époxy accélérateur et mélanger à nouveau pendant 2 min. Prenez soin de mélanger complètement les composants ERL, DER et NSA avant d'ajouter l'accélérateur DMAE.
    3. Commencer l'imprégnation de résine du tissu en remplaçant 100% d'acétone avec 1: 1 de résineacétone pendant 1 h, puis remplacer par 6: 1 résine à l'acétone pendant 3 heures, et enfin résine 100% du jour au lendemain.
    4. Transférer le tissu dans résine fraîche en 8 mm micromoulds. Cure à 70 o C pendant la nuit. Résine devrait être difficile, mais pas fragile après durcissement.

3. Ultramicrotomie

  1. Couteau, Couper Paramètres et Section Epaisseur
    1. Placez un couteau de diamant semithin dans le ultramicrotome et couper des sections du tissu à une épaisseur de 500 nm.
    2. Faire flotter les sections sur le bain d'eau derrière l'arête du couteau. Ramassez les sections sur une lame de verre et les sécher pendant 10 à 20 secondes en utilisant une plaque de cuisson à environ 110 ° C
    3. Etch les sections avec une solution d'éthylate de sodium pendant 20 secondes, puis rincer à l'éthanol à 100% de l'eau puis distillée. Stain avec 2% de bleu de méthylène dans 1% de borax pendant 20 secondes sur la plaque de cuisson, rincer à l'eau du robinet pendant 5 sec et sec sur la plaque chauffante pendant 5 sec. Puis stain avec 1,5% de fuchsine basique sur la plaque chauffante pendant 5 secondes puis sécher sur la plaque chauffante pendant 20 secondes.
    4. Examiner par microscopie optique à champ clair et confirmer que les cellules tumorales et une région d'intérêt (ROI) sont présents dans la section.
    5. Changer le couteau de diamant semithin à un couteau de diamant ultramince et régler la vitesse d'angle de couteau et coupe correcte comme recommandé par le fabricant de couteaux.
    6. Couper les sections ultraminces à 90 nm d'épaisseur. Observer la coloration de l'or des sections lorsque flottant sur le bain d'eau.
    7. Étirez et aplatir les sections en agitant la vapeur de chloroforme d'un 1 cm 2 morceau de papier filtre à quelques millimètres des sections. Prenez soin de ne pas mettre le papier imbibé de chloroforme en contact avec la surface de l'eau.
  2. Ultrathin Section Grille de montage
    1. Soulevez les sections ultraminces de la surface de l'eau en utilisant une mince barre grille de TEM de nickel de 300 mesh qui a été trempé dans la section adhesivsolution e. Repérez les sections sur le côté mat de la grille. Les grilles ont une surface mate ou mate d'un côté et une surface polie ou brillante de l'autre côté. Aucun film de support est nécessaire. Remarque: Il est nécessaire de gérer ces grilles avec une pince anti-magnétiques pour éviter les grilles coller à la pince.
    2. Préparer la section adhésive en plaçant 20 cm de ruban adhésif transparent dans un flacon de 5 ml avec 2,0 ml d'acétone. Cap et secouer le flacon, laisser reposer pendant 10 min puis retirez la bande en laissant la solution d'adhésif.

4. immunomarquage

  1. Antigène Démasquer
    1. Préparer 1 ml de solution fraîche de gravure de métaperiodate de sodium saturée dans de l'eau distillée et de l'utiliser immédiatement. Placer des gouttelettes de la solution d'attaque chimique sur une surface labfilm propre.
    2. Placez les grilles complètement sèches avec des sections vers le bas sur les gouttelettes de solution de métaperiodate de sodium à la température ambiante pendant 30 min. Transférer les grilles à dro d'eau distilléePlets pour 60 sec de lavage.
  2. Anticorps Incubation et QD Probe Étiquetage
    1. Effectuer toutes les incubations et l'étiquetage des gouttelettes de solution placés sur une surface de Parafilm propre.
    2. Placer la grille sur une goutte de 0,05 M de glycine dans du PBS pendant 10 min pour bloquer l'aldéhyde résiduel dans la section. Retirer le bloc d'aldéhyde par buvardage brièvement le bord de la grille.
    3. Placer la grille sur une gouttelette de 1% de sérum de chèvre normal (NGS) et 1% BSAC (10%) dans du PBS pendant 10 min. Préparer la solution de blocage par addition de 10 ul de NGS et 100 ul de BSAC à 890 ul de PBS pour obtenir un volume final de 1000 ul.
    4. Conditionner les sections en plaçant une goutte de diluant d'anticorps pendant 10 minutes.
    5. Effectuer l'incubation d'immuno-marquage en utilisant un anticorps polyclonal anti-somatostatine dilué 1:10 avec du diluant d'anticorps donnant une concentration de 3,47 g / l. Remarque: l'incubation d'anticorps se fait en plaçant des grilles sur les gouttelettes pendant 1 h à la salle temperature dans une chambre humide.
    6. Retirer le réactif anticorps à partir de l'étape 4.2.5 en tamponnant le bord de la grille puis lavez sections sur diluant pour 2 x 5 min.
    7. Incuber dans un anticorps secondaire (chèvre biotinylé anti-lapin polyclonal) dilué au 1/10 pendant 1 heure à température ambiante. Retirer la solution d'anticorps secondaire. Laver à diluant pour 2 x 5 min.
    8. Incuber dans QDs conjugués streptavidine (585 nm) dilué 1:10 pendant 1 heure à température ambiante. Couvrir de papier d'aluminium pour réduire exposition à la lumière pendant l'incubation.
    9. Laver les grilles dans de l'eau distillée fraîche pendant 2 min. Éponger les bords de la grille sèche.

5. Fluorescence Microscopy Lumière

  1. Source de lumière et de filtre Cubes
    1. Utiliser 365 nm diode électroluminescente (LED) pour l'éclairage grand champ microscopie optique de fluorescence. Insérez un cube de filtre avec les caractéristiques suivantes: (Ex G 365 nm, BS FT 395 et EM LP 420 nm).
      Remarque: Ce cube de filtre will permettre les spectres d'émission de toutes les tailles de points quantiques à visualiser simultanément sous la même longueur d'onde d'excitation.
  2. Visualisation et imagerie Sections
    1. Placez la section de grille immunocolorées sur une lame de verre dans une goutte d'eau et recouvrir d'une lamelle de verre (numéro d'une épaisseur de 1,5). Utilisez la microscopie optique pour évaluer le modèle d'étiquetage, le niveau d'un marquage non spécifique et d'établir que les contrôles négatifs sont clairs de l'étiquetage.
    2. Identifier ROI par rapport aux barreaux de la grille. grilles du Finder peuvent être utiles pour établir les coordonnées des structures cibles.
    3. Acquérir les images de l'étiquetage positif sur la section à l'aide d'un appareil photo numérique de couleur avec le réglage de la caméra à "couleur automatique FL" et "Balance des blancs" fixé à 3.200K. Utilisez l'appareil photo en mode "Exposition automatique" avec un réglage "Gamma" entre 0,45 et 1,00 pour optimiser l'apparence des images et «Gain analogique» fixé à 1x.Cliquez sur l'icône de l'appareil photo dans le logiciel interface graphique Zen 2 Lite pour "Live", focaliser l'image puis cliquez sur "Snap" pour capturer l'image à l'Framestore.
    4. Enregistrer des images en fichiers .tif pour éviter la compression et la pixellisation devenir apparente.
    5. Préparer une impression montrant la position de la ROI par rapport aux barres de grille ou d'autres sites de tissus importants. Ces impressions sont utiles pour la navigation ultérieure de la section et re-trouver des régions d'intérêt par microscopie électronique à transmission (MET).
    6. Retirer la grille de la diapositive, laver à l'eau distillée et éponger délicatement les bords sec.
      Note: Ne pas utiliser un éclairage trop intense pour acquérir des images de fluorescence. La photostabilité de QDs permet des temps d'imagerie jusqu'à quelques secondes, mais prendre soin de ne pas prolonger l'exposition comme extinction du signal QD peut se produire après environ 1 min dans de l'eau. photostabilité prolongée ou permanente est seulement obtenu lorsque QD étiqueté sections sont déshydratées avec du toluène etincorporé sous lamelles selon les spécifications du fabricant. Cependant, ce processus sera alors exclure la possibilité d'un examen corrélative de la même section par TEM.

6. Transmission Electron Microscopy

  1. TEM Set Up et Affichage
    1. Transférer la grille TEM pour examen en utilisant une tension d'accélération de 100 kV. Utilisez un faible grossissement d'environ 1,400X pour naviguer autour de la grille et de trouver ROIs qui sont en corrélation avec les vues de microscopie lumineuse. Voir les clusters de QDs à grossissements autour de 50,000X.
    2. Observer QDs individuels à 70,000X grossissement ou au-dessus. Observer les QDs que les structures cristallines irrégulières avec une densité d'électrons modérée.
  2. Imaging
    1. Utilisez un appareil photo numérique pour l'imagerie TEM. A 1,392 x 1,040 capteur de pixel monochrome est adéquate.
    2. Acquérir les images en cliquant sur l'icône "Caméra" sur "On" dans le microscope interface graphique du logiciel d'imagerie, puis sur "Off" pour stocker l'image dans la mémoire d'images. Remarque: ces opérations diffèrent en fonction du système de microscope utilisé. Utilisez l'appareil photo en mode d'exposition automatique avec un réglage "Gamma" de 1,00.
    3. Enregistrer des images en fichiers .tif.

7. CLEM Imaging

  1. Localisation d' un ROI de Fluorescence par MET
    1. Utilisez une impression à partir de l'image de microscopie optique pour localiser ROIs correspondant par TEM. Tissus caractéristiques architecturales telles que les vaisseaux sanguins et les structures luminales sont utiles pour la navigation autour de la section en utilisant TEM.
    2. Capturer une image du ROI correspondant par TEM.
  2. CLEM Superposition
    1. Assurez-vous que l'image TEM est correctement orienté avec l'image de microscopie optique et de corriger l'élargissement de chacun afin que la même structure vu dans chaque modalité est la même taille.
    2. Orientmangé la microscopie optique et les images TEM et les afficher côte à côte ou en superposition pour mettre en évidence les caractéristiques ultrastructurales des immuno-ROIs.
    3. Créer une image de superposition en utilisant Photoshop CS2. Tout d'abord, agrandir l'image de fluorescence au même grossissement comme une image de faible puissance TEM. Orienter les deux images, puis de les coller côte à côte sur une toile.
    4. Aplatir l'image.
    5. Créer la superposition de fluorescence à partir de cette image composite. Cliquez sur le "Rectangle Tool", sélectionnez l'image de fluorescence et de créer une couche double de celle-ci.
    6. Réglez le "Style de calque / Options de fusion" à 30 - 40% de transparence.
    7. Cliquez sur le "Move Tool" et faites glisser la couche de fluorescence de superposition sur l'image de TEM correspondant. Alignez les images.
    8. Après la réalisation de l'alignement, "Aplatir" les couches pour produire l'image finale de recouvrement.
    9. Utilisez le "Rectangle Tool" pour sélectionner la nouvelle image de superposition d'unnd copier sur une nouvelle toile. Enregistrer en tant que fichier .tiff.

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Résultats

Le spécimen somatostatinome tumorales utilisées dans cette étude comprenaient les cellules tumorales forment des structures canalaires mélangés avec le tissu collagénique stomie. Par microscopie optique à fluorescence, les cellules tumorales individuelles qui contiennent des granules sécrétoires abondantes ont présenté un marquage positif pour l'hormone somatostatine. Nuclei apparu trous sombres avec un minimum de marquage non spécifique détectable (Figure 1). A de f...

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Discussion

Cette étude a démontré l'utilité potentielle des QDs comme sondes universelles pour les études de CLEM. Les 585 nanoparticules nm QD utilisées ont montré une fluorescence brillante et stable lorsqu'elle est vue par microscopie optique à champ large et ont été facilement observés par MET. Une étude précédente par l' un des auteurs présents a montré QDs aussi être adapté à la microscopie optique super-résolution 7. Leur photostabilité a été particulièrement utile pour des périodes d'observation ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Xiao Juan Wu (Laboratoire d’immunohistochimie) et le Département d’anatomopathologie du Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, Nouvelle-Galles du Sud, Australie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cacodylate de sodiumProscitechC0205Produit chimique nocif
Tétroxyde d’osmiumProscitechC010Utilisation uniquement dans la hotte
Acétate d’uranyleUnivar-Ajax569Produit chimique dangereux
Éthanol 100 %FronineJJ008
Acétone 100 %FronineJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
Métaperiodate de sodiumAnalar BDH10259
Anticorps anti-somatostatineDakoA0566
Anticorps diluantDakoS3022
Qdot 585 Conjugué de streptavidine  ;InvitrogenQ10113MP
Anticorps IgG anti-lapin de chèvre biotinyléSigmaB7389-1ML
Glutaraldéhyde 50 %EMS16320
Sérum de chèvre normalInvitrogenPCN5000
PBS « Dulbecco A"Oxoid  ;
BSAc (10 %)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
Bandelettes indicatrices de pH (pH 2.0 - 9.0)Merck1.09584.0001
MicromoulesProscitechRL063
Couteau diamantéDiatomeUltra 45
Microscope électronique à transmissionFEIMorgagni 268D
Microscope optique à fluorescenceCarl ZeissAxioscope A1
Grilles 300 mesh nickel (barre mince)Agar ScientificG2740N
UltramicrotomeRMCPowertome
TEM logiciel de contrôle de caméraSoft Imaging SystemAnalySISVersion 3.0
Logiciel de traitement d’imagesAdobe Systems PhotoshopCS2
BR0014G incorporé

Références

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