Imagerie de calcium dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Activation à Egg

Résumé

Cet article décrit un protocole ex vivo adaptable pour la visualisation de Ca ²⁺ lors de l' activation de l' œuf chez la drosophile.

Résumé

L’activation de l’œuf est un processus universel qui comprend une série d’événements pour permettre à l’œuf fécondé de terminer la méiose et d’initier le développement embryonnaire. L’un des aspects de l’activation de l’œuf, conservé dans tous les organismes examinés, est une modification de la concentration intracellulaire de calcium (Ca²⁺), souvent appelée « onde Ca²⁺ ». Alors que la vitesse et le nombre d’oscillations de l’onde Ca²⁺ varient d’une espèce à l’autre, la modification intracellulaire de Ca²⁺ est essentielle pour provoquer des événements essentiels au développement embryonnaire. Ces changements comprennent la reprise du cycle cellulaire, la régulation de l’ARNm, l’exocytose des granules corticaux et le réarrangement du cytosquelette.

Dans l’œuf de drosophile mature, l’activation se produit dans l’oviducte femelle avant la fécondation, initiant une série d’événements dépendants de Ca²⁺. Nous présentons ici un protocole d’imagerie de l’onde Ca²⁺ chez la drosophile. Cette approche fournit un système de modèle manipulable pour interroger le mécanisme de l’onde Ca²⁺ et les changements en aval qui lui sont associés.

Introduction

Un changement de Ca ²⁺ intracellulaire concentration à ovule (ovocyte) activation est un élément conservé de tous les organismes étudiés ^1,2. Cet événement déclenche un large éventail de processus -dépendantes ^de Ca, y compris la reprise du cycle cellulaire et la traduction des ARNm stockées. En raison de cette exigence pour Ca ^2+, de visualiser les changements transitoires de ^{Ca2 +} intracellulaire des concentrations a été d' un intérêt primordial.

Historiquement, les organismes modèles ont été choisis pour des études sur l'activation des oeufs en fonction de la taille et de la disponibilité de leurs oeufs. Diverses approches de visualisation ont été utilisées pour suivre et quantifier les changements intracellulaire de ^{Ca2 +} concentrations dans ces systèmes, y compris: la photoprotéine aequorine en medaka poissons ^3; Ca ²⁺ colorants fluorescents sensibles tels que Fura-2 dans oursin et le hamster ^4,5; et de calcium vert-1-dextran dans Xenopus ^6.

La génération et l' amélioration des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) a transformé la capacité de visualiser Ca ²⁺ dynamique in vivo ^7. Ces constructions génétiques sont exprimés dans des tissus spécifiques et de limiter le besoin de préparations tissulaires invasives ^8.

GCaMPs sont une protéine fluorescente verte (GFP) classe à base de GECIS qui ont été très efficaces en raison de leur forte affinité Ca ^2+, le rapport et la capacité signal-bruit pour être personnalisés ^9-11. En présence de Ca ^2+, le complexe GCaMP subit une série de changements conformationnels, en commençant par la liaison de ^{Ca2 +} à la calmoduline qui se traduit par une augmentation de l' intensité de fluorescence de la composante de GFP ^9.

GCaMPs ont été largement utilisés dans la recherche sur les neurones de Drosophila pour visualiser les changements de calcium intracellulaire ^12. Les applicati récentssur la technologie GCaMP pour visualiser Ca ²⁺ dans les œufs de Drosophila matures a révélé un seul transitoire Ca ²⁺ onde à l' activation de l' œuf ^13,14. La vague Ca ²⁺ peut être visualisé à faible grossissement pendant l' ovulation in vivo ¹³ ou à un grossissement plus élevé en utilisant un essai ex vivo d'activation ^13,14. Dans le dosage ex vivo, les ovocytes matures individuels sont isolés des ovaires et activés à l' aide d' une solution hypotonique, dénommé tampon d'activation, ce qui a été montré pour récapituler les événements d'activation in vivo ^15-17.

Ce test ex vivo permet facilement de haute résolution visualisation de la Ca ²⁺ onde dans différentes conditions expérimentales , y compris la perturbation pharmacologique, les manipulations physiques et mutants génétiques. Cet article montre la préparation d'œufs de Drosophila matures pour ex vivo et activation ee microscopie ultérieure utilisée pour visualiser l'onde Ca ²⁺ en utilisant GCaMP. Cette approche peut être utilisée pour tester l'initiation et le contrôle de l'onde Ca ²⁺ et de sonder les résultats en aval.

Protocole

Remarque: Effectuer toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire.

1. Préparation de Dissection

Remarque: Les étapes décrites ici sont conformes à E. Gavis, Princeton University et Weil et. al. ^18. Effectuez les étapes suivantes, deux jours avant l'imagerie.

1. Prenez un flacon de mouche contenant environ 10 ml de nourriture solide et ajouter une petite quantité de levure sèche dans un coin, à moins de 1 g est suffisante.
   Remarque: Pour des informations sur les flacons de mouches ou de la nourriture voir 'Drosophila Maintenance' ^19.
2. Ajouter 1 - 3 gouttes d'eau pour hydrater la levure.
3. Réglez le flacon de côté à un angle de 45 ° et laisser 3-5 min pour la levure de prendre l'eau.
4. Bien que la levure absorbe l'eau, sélectionnez une bouteille de mouches exprimant UASt- myr GCaMP5 ²⁰ entraînée par un bain-VP16GAL4 (dénommé GCaMP5) qui ont récemment vu le jour (un myristoyforme lated du GCaMP5 a été choisi pour fournir un signal élevé par rapport au bruit par le biais d'attacher la GECI à la membrane dans l'œuf).
5. Anesthésier les mouches dans la bouteille avec du gaz CO _2. Soyez sûr de garder la bouteille inversée afin de ne pas perdre de mouches dans la nourriture humide.
6. Astuce vol anesthésiés sur un tampon de CO ₂ et de trier 10 - 15 femelles et 5 mâles à l' aide d' un pinceau sous un microscope à dissection. Note: Il est standard pour inclure les hommes pour fournir des femelles en bonne santé pour la dissection.
7. Lorsque le flacon de l'étape 1.3 est prêt, ajouter les mouches sélectionnées dans le flacon. Prenez soin de garder l'horizontale flacon jusqu'à ce que les mouches deviennent actifs.
8. Placer le flacon à 25 ° C pendant environ 36 heures.
9. Retour à vol restants du CO ₂ pad à la bouteille ou défausse.

2. Dissecting Drosophila Ovaires

Note: Les étapes décrites ici sont conformes à Weil et al. Al. ^18.

1. Après 36 h, anesthésier les mouches du flacon yeasted avec du CO _2.
2. Une fois que les mouches à l' intérieur du flacon sont anesthésiés leur donner un pourboire sur le CO ₂ pad à trier avec une brosse de peinture sous un microscope à dissection.
3. Sélectionnez une femelle.
4. Isoler les deux ovaires de la femelle. Pour le protocole complet et détaillé voir Weil et. al. ^18. En résumé:
   1. Placer une petite goutte d'huile d'hydrocarbures halogénés oxygénés (série 95) sur un n ° 1,5, 22 x 40 mm lamelle.
   2. Attrapez la femelle avec une pince à la partie antérieure de l'abdomen.
   3. Tenir la femme sous le microscope de dissection, utiliser le second jeu de pinces pour enlever délicatement la partie postérieure de la femelle.
   4. Essuyez le tissu postérieur de la deuxième pince.
   5. Presser sur la cavité abdominale avec les secondes pinces de la partie antérieure à la partie postérieure de l'abdomen. Les deux ovaires opaques doivent coller à la pince lorsque l'extérieur de la FEMAle.
   6. Appuyez sur les ovaires dans l'huile.
   7. Retirez tout tissu de la pince en essuyant la pince.
   8. Répétez ces étapes (2.4.1 - 2.4.7) pour obtenir trois lamelles, chacun contenant des ovaires d'une mouche.

3. Isolating individuel Oeufs d'âge mûr

1. Sous un microscope à dissection standard avec le grossissement réglé à 4X, sur la première lamelle de l'étape 2.4, séparer les deux ovaires en déchirant l'oviducte.
2. Introduire une paire de pinces fermées dans le centre d'un seul ovaire, en prenant soin de ne pas percer des chambres d'œufs.
3. Insérer une sonde de dissection standard dans le centre de l'ovaire, à côté de la pince fermée.
4. faites glisser doucement la sonde de dissection à travers l'ovaire vers le pôle postérieur, où se trouvent les oeufs matures (stade 14 chambres d'oeufs).
5. Répéter les étapes 3.1 - 3.4 2 - 5 fois en fonction de la taille de l'ovaire et du nombre d'oeufs.
   Note: L' addition de CO ₂ provoque généralement le dépôt d'un seul œuf qui apparaîtra plus grande avec des appendices dorsaux soulevées que les œufs pré-déposés. Cet oeuf doit être mis au rebut pour l'imagerie, car il a déjà été activé à l'intérieur de la femelle.
   Remarque: les oeufs matures sont susceptibles de se séparer facilement du tissu conjonctif de l'ovaire.
6. Si pas d'oeufs matures sont visibles à l'extérieur de l'ovaire, continuez doucement taquiner avec la sonde de dissection.
7. Une fois les oeufs matures sont visibles sur la lamelle couvre-objet en dehors de l'ovaire, de manoeuvre 3 - 5 dans une ligne du centre de la lamelle couvre-objet.
   Note: Pour de meilleurs résultats, exécutez la sonde doucement le long du côté des œufs.
   Remarque: Évitez de tirer sur les appendices dorsaux car cela peut endommager l'œuf.
   Remarque: En fonction de l'imagerie future mise en place, aligner les oeufs environ 200 um à part perpendiculairement à la lamelle pour la zone maximale d'imagerie.
8. Une fois aligné, retirez le reste du tissu ovarien en le faisant glisser à l'écart des œufs alignés en utilisant le forceps.
9. Retirer l'excès d'huile en tamponnant avec le coin d'essuyer un examen médical. Veillez à ne pas toucher les oeufs matures avec le médical lingette oeufs matures qui sont contactés seront perdus.
10. Dessiner une croix sur la lamelle couvre-objet avec un marqueur pour faciliter la localisation de l'échantillon sous le microscope.
11. Régler la lamelle dans un endroit sûr et de laisser les chambres d'œufs préparés sur la lamelle pour se reposer pendant 5 - 10 min. Ceci permet à l'oeuf se déposer dans l'huile. Les échantillons peuvent être utilisés jusqu'à 1 h après dissection.
12. Répétez les étapes 03.01 à 03.11 pour le reste des lamelles avec des ovaires sur eux.

4. Préparation de l'imagerie

1. Amener le tampon d'activation préparé ¹⁵ à la température ambiante.
   Note: Le tampon d'activation est un tampon hypotonique: 3,3 mM , NaH ₂ PO _4, 16,6 mM de KH ₂ PO _4, NaCl 10 mM, KCl 50 mM, 5% de polyéthylèneglycol 8000, CaCl2 ₂ mM, porté à pH 6,4 avec un mélange 1: 5 rapport de NaOH: KOH.Pour plus d' informations , voir Mahowald 1983 ^15. Aliquotes de tampon d'activation peut être stocké à -20 ° C pendant des mois et à 4 ° C pendant 2 semaines.
2. transporter soigneusement préparés, des lamelles tampon d'activation et de pipettes en verre vers l'installation d'imagerie.
   Note: Un grand champ, confocal, disque tournant ou d'une feuille microscope optique peuvent être utilisés. Nous vous recommandons d'utiliser un microscope inversé. Nos résultats représentatifs ont été obtenus en utilisant un microscope confocal.
3. Un objectif approprié pour l'imagerie de l'ensemble ovule mature doit être choisi (ici: 20X 0,7 NA).
4. Monter la première lamelle préparée à l'étape de microscope. Prenez soin de ne pas briser les lamelles sur la scène.
5. sélectionnez Qualitativement un champ de vision avec une chambre d'ovule mature pour l'activation. Ne pas l'image ponctionné chambres d'œufs ou ceux avec bourgeonnement dans la membrane.
   Remarque: Pour les étapes 4.6 - 4.7, les commandes logicielles varient en fonction de microscope et le fabricant.
6. Set para d'imageriemètres pour l'excitation standard GFP (488 nm) et d'émission (500-580 nm). Également mis en place une vue à champ lumineux afin de visualiser et d'orienter l'ovule mature et huile déplacée.
7. Sélectionnez le plus bas Z-plan où les oeufs matures sont visibles et définir un Z-pile complète à prendre pour 40 um à environ 2 pm par étape. Réglez les paramètres donc il n'y a pas de délai entre l'acquisition Z-stack. Définir la série de temps pour capturer pendant environ 30 min.

5. Activation de l' imagerie ex vivo d' oeuf

1. Lancer la capture d'image.
2. Attendre 1 - 2 Z-piles complètes à acquérir. Ceci montre l'ovule mature avant l'activation.
3. Retirer environ 300 ul de tampon d'activation dans une pipette en verre.
4. Le positionnement de la pointe de la pipette en verre contenant un tampon d'activation à un angle de 45 ° au-dessus de la lamelle, déplacer lentement la pipette dans la trajectoire du faisceau jusqu'à ce qu'il soit directement au-dessus de l'œuf mûr imagée. La pipette de verre devraitêtre de 1 - 2 cm au-dessus de l'huile.
5. Ajouter 1 - 2 gouttes de tampon d'activation en moins de 5 secondes de la pipette en verre. Cela devrait déplacer l'huile. Évitez d'ajouter un tampon d'activation en excès ou en touchant l'œuf avec la pipette en verre, car il peut provoquer le déplacement de l'ovule mature. Prenez soin de ne pas toucher la lamelle avec la pipette, car cela peut provoquer un changement dans le plan ou bulles d'air focaux pour former dans l'huile d'immersion entre l'objectif et la lamelle.
6. Alors que l'ajout d'un tampon d'activation lors de l'acquisition d'image, vérifiez le canal champ lumineux pour veiller à ce que l'huile a été déplacé par le tampon d'activation.
   Note: Ceci apparaît d'abord comme une ombre due à la pipette briser la trajectoire du faisceau, mais se traduira également par l'apparition de petites gouttelettes d'huile. Quelques gouttes d'huile peuvent rester associé à l'ovule mature qui aura une incidence sur les résultats expérimentaux et la qualité de l'image.
7. Si l'huile ne soit pas déplacé à partir de la première addition de répéter les étapes d'activation du tampon de 5,4 à 5.6.
8. Lorsque l'huile est déplacée avec succès, permettre à la série temporelle de fonctionner jusqu'à son achèvement.
   Remarque: En raison de l'enflure des ovocytes à l'activation, certaines chambres d'œufs vont se déplacer de façon spectaculaire sur le plan ou le champ de vision central lors de l'addition de tampon d'activation. Dans cette situation, arrêtez l'acquisition et monter la prochaine lamelle.
9. Après la séquence d'images a complété l'acquisition, enregistrer les données.

6. Post-acquisition Traitement d'image

1. Ouvrez le jeu de données à l'aide de Fidji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), ou d'un logiciel équivalent de traitement d'image, et sélectionnez les fichiers pertinents pour l'analyse.
2. Pour construire une projection des données acquises sélectionnez: Image> Piles> Z-projet.
3. Sélectionnez un début Z-slice et un arrêt Z-slice, généralement toute la section. Sélectionnez un type de projection, généralement réglé sur 'Max Intensité. Cochez la case à cocher "All Time Frames 'pour appliquer les paramètres sélectionnés pour toute la série.
4. Siplus d'un canal fluorescent a été imagé, utilisez l'outil de canaux pour permettre le mouvement entre les couleurs, faire un composite, ou faire de l'image en niveaux de gris. Sélectionnez Image> Couleurs> Canaux outil.
5. Pour régler la luminosité de l'image et le contraste sélectionnez Image> Réglages> Luminosité / Contraste.
6. Pour exporter une seule image, déplacer curseur calendrier au cadre pertinent et sélectionnez Fichier> Enregistrer sous> Jpeg, ou tout autre format préféré.
7. Choisissez un emplacement et le titre pour le fichier exporté, puis enregistrez.
   Remarque Le taux à partir du logiciel d'imagerie de trame sera nécessaire pour donner un horodatage sur l'image.
8. Pour exporter la série chronologique comme un film sélectionnez: Fichier> Enregistrer sous> AVI, puis sélectionnez la cadence (~ 7 images par seconde).
9. Choisissez un emplacement et le titre pour le fichier exporté, puis enregistrez.
10. Pour enregistrer le fichier ajusté au format Fidji, sélectionnez Fichier> Enregistrer.

Résultats

Ici , nous avons démontré comment préparer des œufs de Drosophila matures ex vivo activation. Les œufs exprimant un GECI permettre l' imagerie de ^{Ca2 +} dynamique lors de l' activation de l' œuf et le début du développement de l' embryon (figure 1). Il convient de noter que , selon le GCaMP utilisé, en particulier la présence d'un groupe myristoyle, les résultats peuvent présenter de légères différences qualitatives ^{13 14.} Nous avons également démontré un rôle pour l' actine fonctionnelle lors de l' activation de l' œuf par l'addition d'un inhibiteur de polymérisation de l' actine, la cytochalasine D, le tampon d'activation (figure 2) ^14.

Une exigence pour le cytosquelette lors de l'activation de l'œuf est conservée. En C. elegans, après la fécondation, les composants du cytosquelette sont réorganisés pour préparer l'embryon d' une cellule pour la première division asymétrique ^21,22. En oursin de mer, la perturbation des cytoskeletal réorganisation suite à l' activation a été montré pour affecter le cycle cellulaire en empêchant contractile formation de l' anneau ^23. Le rôle de l' actine dans la médiation d' une vague Ca ²⁺ et sa fonction aval lors de l' activation de l' œuf chez la drosophile reste à élucider.

Chez la drosophile, la co-visualisation de l'onde et le cytosquelette d' actine ^{Ca2 +} peut être réalisé en utilisant ce dosage ex vivo d'activation. Les séries chronologiques de multiples canaux peut être acquis et la dynamique du ^{Ca2 *} intracellulaire peut être associé à des changements dans l' organisation de l' actine dans l'ovocyte (Figure 3).

Figure 1:. A Single Ca ²⁺ vagues à la série Drosophila Egg Activation Temps des ex vivo matures Drosophila exprimant oeuf UASt- myrGCaMP5 suivant l'uneddition de tampon d'activation (AH). L'augmentation du Ca ²⁺ cytoplasmique commençant au niveau du pôle postérieur (B) et se propage (BF) avec une vitesse moyenne d'environ 1,5 um / s. L'initiation de l'onde est typiquement observée dans les 3 minutes de l'addition d'un tampon d'activation. Après activation, les taux de calcium intracellulaire de l'ovule mature retourne à des niveaux (G, H) d'activation pré. Voir un film supplémentaire 1 (durée totale de 33 min). Barres d'échelle = 50 pm. Projection Max = 40 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Ajout de cytochalasine D Activation Buffer perturbe Ca²⁺ propagation des ondes. Série Temps d'ex vivo matures Drosophila exprimant oeuf UASt- myrGCaMP5 après addition de tampon d'activation contenant 10 pg / ml de cytochalasine D concentration finale (AH). Tandis que le ^{Ca2 +} onde est initiée au niveau du pôle postérieur (A), elle est compromise et ne parvient pas à la partie antérieure de l'œuf (F) (pointes de flèches blanches indiquent la face de la vague). Pas encore les changements de Ca ont été observés plus de 30 min). Voir un film supplémentaire 2 (durée totale de 30 min). Barres d'échelle = 50 pm. Projection Max = 40 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Co-visualisation de l' actine et de Ca ²⁺ à EActivation de gg en série Drosophila. Temps d'ex vivo matures Drosophila oeuf exprimant UASt- myrGCaMP5 (Cyan) et UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) après addition de tampon d'activation (AH). Le Ca ²⁺ vague amorce du pôle postérieur et récupère comme dans la figure 1. Actine semble changer au fil du temps, des pointes de flèches blanches (A vs H). L'absence de détection de signal ^de Ca dans le centre de l'ovule mature est due au déplacement de l'échantillon lors de la capture d' image. Barres d'échelle = 50 pm. Projection Max = 40 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

La première étape critique de ce protocole consiste à isoler les ovules matures sans les endommager. Cela peut être réalisé en manœuvrant les œufs avec la sonde de dissection. La pratique permettra d’exécuter cette manipulation sans endommager les œufs. Une deuxième étape cruciale consiste à éviter la perte de l’échantillon lors de l’application d’un tampon d’activation sur l’œuf mature dans l’huile. L’application du tampon d’activation doit se faire lentement et sans contact avec la lamelle. Cette étape peut s’avérer difficile si la configuration du microscope ne permet pas un accès facile à l’échantillon. Il est conseillé de déplacer les parties axillaires du microscope, comme un incubateur de température.

Des modifications peuvent être apportées à ce protocole afin de visualiser d’autres facteurs marqués par fluorescence, au lieu de Ca²⁺ lors de l’activation de l’œuf. Plus généralement, les différents stades de développement de la drosophile ou les résultats de l’ajout d’un tampon différent pourraient être analysés à l’aide de ce protocole.

Un dépannage peut être nécessaire si les paramètres du microscope ne sont pas optimaux pour visualiser le signal de l’échantillon. Cela peut être réalisé en augmentant ou en diminuant la puissance du laser, en modifiant la plage de capture et en ajustant les paramètres de la pile Z. Un autre problème peut être que les œufs se déplacent constamment hors du champ de vision lors de l’ajout du tampon d’activation. Si cela se produit régulièrement, laissez les œufs matures se déposer sur les lamelles pendant une période plus longue, de 15 à 20 minutes. Attention, l’utilisation d’une huile à viscosité plus élevée modifiera le déplacement de l’huile par tampon d’activation.

Cette technique présentée ici est limitée par la distance de travail de l’objectif, la déshydratation des ovules matures et la capacité de disséquer les ovules matures sans les endommager. Cependant, par rapport aux méthodes d’imagerie in vivo où l’ovocyte mature passe à travers la femelle adulte et est déposé ¹³, notre méthode permet une plus grande résolution spatiale, la possibilité de manipuler physiquement l’ovule mature avant l’activation et la possibilité de tester le rôle de l’activation de l’ovule sans fécondation.

Il existe de nombreuses applications futures potentielles de cette technique, notamment le test des constructions rapporteures pour les composants cellulaires lors de l’activation de l’œuf et la visualisation de l’onde Ca²⁺ dans les arrière-plans mutants ^14,24. Associé à des outils expérimentaux et génétiques, le test d’activation d’ovules ex vivo présenté ici permet d’étudier le déclencheur, la propagation et les effets en aval de l’onde Ca²⁺ universellement conservée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Levure sèche active	Fleischman' s	#2192
Microscope de dissection	Leica	MZ6	Divers fonctionneront
Lampe	Mircotec Fibre optique	MF0-90	Divers fonctionneront
Lingettes médicales	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020  ;
Marqueur	Stabilo	841/46	OHPen universel, noir - disponible dans la plupart des magasins de papeterie. Tampon
CO2	; Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Housse n° 1.5, 22 x 50 mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T  ;
Huile aux halocarbures, série 95	Halocarbon Products Corp.	Distributeur en Europe :
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Peut être utilisé à la place de l’huile d’halocarbure, série 95
Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Bien que ces outils doivent être propres, l’utilisation d’un autoclave n’est pas nécessaire, de l’éthanol serait suffisant.
Sonde	Fine Science Tools	10140-01
Pipette en verre	Fisherbrand,FB50251		Pasteur Pipettes, verre, débranchées, longueur 150 mm  ;
Flacon	Regina Industries	P1014	GPPS  ; 80 mm x 25 mm

de largeur superfine 0,4 mm