Article de méthode

Rapid Détection moléculaire et différenciation des virus grippaux A et B

15.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/54312

⸱

30 janvier 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un essai rapide, à base moléculaire de la grippe A et B. L'essai détecte la grippe chaque cible dans les 15 minutes en utilisant une amplification isotherme avec des amorces spécifiques de la grippe suivie par la détection de cibles avec des sondes de balises moléculaires. Le dosage et la grippe A B est convivial et nécessaire minimes mains sur le temps d'effectuer.

Résumé

La grippe est une maladie respiratoire contagieuse provoquée par un virus de la grippe A et B chez l'homme et provoque une quantité importante de morbidité et de mortalité chaque année. La grippe A et le dosage de B a été le premier test de la grippe moléculaire rapide CLIA renoncé disponible. Le test de la grippe A et B fonctionne en utilisant une amplification isotherme avec des amorces spécifiques de la grippe suivie par la détection de cibles avec des sondes de balises moléculaires. Ici, la performance de la grippe A et le dosage de B sur congelés, archivés écouvillon nasopharyngé (NPS) spécimens stockés dans un milieu de transport viral (VTM) ont été comparés à un test de panel respiratoire.

La performance de l'essai A et B de la grippe a été évaluée en comparant les résultats de la méthode de référence du panneau respiratoire. La sensibilité pour le virus de la grippe A totale était de 67,5% (IC à 95% (CI), de 56,6 à 78,5) et la spécificité était de 86,9% (IC, 71,0 à 100). Pour les tests de virus de la grippe B, la sensibilité et la spécificité étaient de 90,2% (IC, 68,5 à 100) Et 98,8% (IC à 68,5 à 100), respectivement.

Ce système a l'avantage d'un temps d'essai significativement plus courte que tout autre test moléculaire actuellement disponibles et la procédure simple et sans pipette fonctionne sur un système entièrement intégré, fermé, à faible encombrement. Dans l'ensemble, la grippe A et le dosage de B évalué dans cette étude a le potentiel de servir de test de diagnostic rapide influenza point de soins.

Introduction

Les infections virales de la grippe se traduisent par une quantité importante de morbidité et de mortalité chaque année 1, 2, 3. La grippe Uncomplicated est caractérisée par des symptômes constitutionnels et respiratoires tels que la fièvre, des myalgies, des céphalées et une toux non productive 4, 5. Les personnes âgées, les jeunes enfants, les patients immunodéprimés et les patients atteints de comorbidités sous - jacentes sont à un risque plus élevé de complications graves telles que la pneumonie, la myocardite, une maladie du système nerveux central, ou la mort 6, 7.

L' infection grippale est unique à partir d' autres virus respiratoires en ce que l' administration rapide d' un traitement antiviral dans les 48 h de l' apparition des symptômes peut réduire la gravité de la maladie et de la longueur 8. L'identification rapide de la grippe a également étémontré pour réduire l'utilisation d'antibiotiques inutiles 9, 10. En outre, les patients hospitalisés atteints d'infections de la grippe doivent être placés dans des pièces isolées avec des précautions de contrôle des infections. Cependant, les maladies respiratoires causées par des virus non grippaux peuvent être difficiles à distinguer cliniquement de la grippe. Pour cette raison, des tests de diagnostic rapide et précis de la grippe est très importante pour la prise en charge clinique du patient.

Plusieurs essais sont disponibles pour la détection et l'identification des virus grippaux. Des tests de détection de l' antigène de la grippe rapide (RIDTs) sont largement utilisés dans la pratique clinique en tant que tests de point de soins parce qu'ils sont simples à utiliser et à fournir des résultats dans les 15 à 30 min 11, 12; cependant, leurs sensibilités varient largement (10-80%) en fonction du fabricant et de la population testée, et le type de grippe et subtyEH 13, 14, 15. Essais de fluorescence directe (DFA) fournissent des sensibilités supérieures sur RIDTs, mais le temps de traitement est supérieure (~ 3 h) et doivent être remplis par des technologues qualifiés 16, 17. Culture virale a été l'étalon-or pour le diagnostic de la grippe et a amélioré la sensibilité sur les deux RIDTs et DFA 18. Cependant, la grippe culture virale peut durer de 2 à 14 d pour terminer, en diminuant son utilité en aidant la gestion des patients 19. Enfin, des tests d'amplification des acides nucléiques (TAAN) ont remplacé les techniques de culture comme la nouvelle norme d'or dans le diagnostic de la grippe. TAAN sont considérés comme ayant la plus grande sensibilité pour la détection de la grippe en quelques heures. Cependant, TAAN sont des dosages les plus chers et nécessitent des équipements et des technologues spécialisés pour effectuer 5 , 20, 21, 22, 23, 24, 25.

La grippe A et B dosage décrit ici est le premier test moléculaire rapide grippe CLIA renoncé qui est facilement disponible. Cet essai fonctionne en utilisant une réaction d'amplification endonucléase entailler (PRES), qui utilise l'amplification isotherme avec des amorces spécifiques de la grippe suivie par la détection de cibles avec des sondes de balises moléculaires. Ce test différencie la grippe A de B, nécessite 2 min à configurer et à traiter un échantillon, et nécessite un total de 15 minutes pour terminer.

Ici, nous présentons le protocole pour le test de la grippe A & B. En outre, nous fournissons un des exemples de données mis en comparant les performances de la grippe A et le dosage de B archivé écouvillon nasopharyngé (NPS) échantillons stockés dans un milieu de transport viral (VTM) à un autre test de panel d'agents pathogènes respiratoires.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

ÉTHIQUE ÉTAT: L'utilisation de la gauche sur des échantillons cliniques est approuvé et suit les lignes directrices de l'Institutional Review Board Cancer Center Memorial Sloan Kettering.

1. Avant de lancer le test

NOTE: La grippe A et le test B est approuvé pour les spécimens d'écouvillons nasopharyngés et prélèvements nasopharyngés stockés dans les supports de transport viral. Les écouvillons sont inclus dans le kit et doivent être utilisées pour des performances optimales. Cependant, la rayonne, la mousse, les écouvillons floqués ou écouvillons polyester nasales peuvent également être utilisés pour recueillir des échantillons d'écouvillons nasaux.

  1. Pour prélever un échantillon de prélèvement nasal, insérez l'écouvillon dans la narine qui a le drainage le plus visible ou qui est le plus encombré. Avec une légère rotation, pousser l'écouvillon dans la narine jusqu'au point de résistance et faire tourner plusieurs fois contre la paroi nasale avant de retirer lentement de la narine. Stocker les tampons et les transporter dans des flacons contenant 3 ml de milieu de transport viral (VTM).
    NOTE: Une attention particulière à approprla collecte des échantillons iate doit être considéré comme le prélèvement d'échantillons inadéquats peuvent donner des résultats erronés.
    NOTE: Les échantillons écouvillon doivent être testés dès que possible après la collecte. Toutefois, ils peuvent être conservés à température ambiante pendant jusqu'à 2 h ou réfrigérés à 2-8 ° C pendant jusqu'à 24 heures si les tests ne sont pas immédiatement disponibles. spécimens fraîchement recueillies sont idéales pour des performances optimales de test. Une mauvaise manipulation de l'échantillon, le stockage et / ou de transport peuvent donner des résultats erronés.
    REMARQUE: Par mesure de précaution, les personnes effectuant ce test devraient traiter tous les échantillons comme potentiellement infectieux en suivant les précautions universelles lors de la manipulation des échantillons.
  2. Amener tous les échantillons à température ambiante avant le test.
    REMARQUE: Tous les composants de test sont pour un usage unique et ne doivent pas être utilisés pour effectuer plusieurs tests. Ne pas mélanger les composants du kit de différents numéros de lot. Ne pas utiliser les réactifs du kit après leur date d'expiration.
  3. Apportez le récepteur de l'échantillon bleu ROOm Température de l'essai. La base de test orange peut être testée sans qu'il soit nécessaire de se réchauffer à la température ambiante.
  4. Laissez toutes les pièces d'essai dans l'emballage en aluminium jusqu'à immédiatement avant l'utilisation. Allumez l'instrument en appuyant sur le bouton d'alimentation sur le côté de l'instrument. Entrez l'ID utilisateur et appuyez sur "OK".

2. Exécution du test

  1. Pour commencer le processus de test, appuyez sur «Test» sur l'écran de l'instrument. Entrez l'ID patient en utilisant le clavier à l'écran ou d'un scanner de codes à barres et appuyez sur "OK". Ouvrez le couvercle et insérez la base de test orange dans le support de base de test Orange.
  2. Assurez-vous que le test correct est affiché sur l'écran et appuyez sur "OK". Insérez l'échantillon récepteur bleu dans le support de réception de l'échantillon bleu.
    REMARQUE: Ne pas ouvrir le récepteur de l'échantillon avant de le placer dans l'instrument, car cela permettra d'éviter le tampon d'élution d'atteindre la température de fonctionnement correcte et peut influer sur les performances de test.
  3. Attendez que le récepteur de l'échantillon pour se réchauffer. Lorsque vous êtes invité par l'instrument, retirez le papier d'aluminium et placer l'écouvillon patient à tester dans le récepteur de l'échantillon.
    REMARQUE: Lors du retrait de la feuille, placez deux doigts sur le bord du receveur de l'échantillon pour qu'il reste en place.
  4. Mélanger vigoureusement l'écouvillon dans le liquide pendant 10 secondes, en appuyant sur la tête de l'écouvillon contre le côté du récepteur de l'échantillon que vous mélangez pour aider à déloger l'échantillon de l'écouvillon. Appuyez sur 'OK' pour continuer. Si des tampons de test stockés dans un milieu de transport viral, vortex VTM pendant 10 secondes puis ajouter 200 pi au récepteur de l'échantillon.
  5. Appuyez sur la cartouche de transfert blanc dans le récepteur de l'échantillon bleu. Continuez à appuyer sur le récepteur de l'échantillon jusqu'à ce que le voyant orange se lève.
  6. Soulevez puis connectez la cartouche de transfert à la base de test. Observez le voyant orange descendre une fois le transfert de la cartouche est correctement fixé. Fermer le couvercle et ne pas ouvrir jusqu'à ce que le "Test Complete"un message apparaît sur l'écran.

3. Contrôle de la qualité

  1. Appuyez sur 'Run QC Test' sur l'écran d'accueil. Sélectionnez le QC test à exécuter. Confirmer le type de test pour correspondre à l'échantillon QC destiné aux essais en touchant 'OK' et suite à la sur l'écran pour terminer le test.

4. Interprétation des résultats

  1. Après la course d'essai est terminée, observer les résultats du test affiché à l'écran avec des interprétations de la présence de la grippe A, B, sous-types inconnus. Pour des résultats non valides répéter le test.

5. Entretien et nettoyage

  1. Nettoyez l'instrument et la zone du banc entourant tous les jours avec 70% d'éthanol ou d'une solution d'eau de Javel à 10%. Vaporisez la solution de nettoyage sur un chiffon humide, non pelucheux pour nettoyer. Ne pas verser les solutions directement sur l'appareil.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Dans cette étude, les échantillons NPS archivés ont été recueillies auprès des patients hospitalisés présentant des symptômes pseudo-grippaux au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) lors d'une épidémie de grippe entre le 15 Décembre 2012 et le 1er Mars 2013. Les spécimens du NPS ont été présentées dans 3 ml de VTM et testé dans le cadre de la pratique clinique de routine avec un test moléculaire qui détecte un panel de virus respiratoires (RP), y compris la grippe a, a-1, a-3, ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les virus grippaux sont des causes importantes à l'échelle mondiale de morbidité et de mortalité. Un diagnostic rapide et précis de la grippe est l'une des principales clés de la gestion des éclosions de grippe pendant la saison respiratoire. D'autres tests basés sur l'antigène sont rapides et faciles à réaliser; cependant, ils ont une faible sensibilité 13. D'autre part, les tests moléculaires traditionnels ont amélioré la sensibilité, mais exigent des technologues de laborat...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le personnel du service de microbiologie clinique du Memorial Sloan-Kettering Cancer Center pour son aide dans la collecte d’échantillons cliniques. Cette étude a été financée en partie par une entente de recherche entre le MSKCC et Alere Scarborough (SK2013-0262).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alere i InstrumentAlereNAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Test KitAlere425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Barcode ScannerAlereEQ001001
Alere Universal PrinterAlere55115 (Global), alereiprinter  ;( États-Unis)
200 et micro ; l Pipette
200 & micro ; l pointes
Milieu de transport viralRemelM4-RT
de précisionde pipette jetables

Références

  1. Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
  2. Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
  3. Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
  4. Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
  5. Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
  6. Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
  7. Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
  8. Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
  9. Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
  10. Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
  11. Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
  12. van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
  13. Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
  14. Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
  15. Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
  16. Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
  17. Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
  18. Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
  19. Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244(2010).
  20. Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
  21. Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
  22. Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
  23. Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
  24. Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
  25. Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
  26. Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
  27. Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
  28. Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Grippe A et Bamplification isothermesondes balises mol culairescouvillon nasopharyngmilieu de transport viraltest de panel respiratoiretest au point d interventiondiagnostic rapide de la grippediagnostics cliniques

Articles connexes