Ce protocole décrit l'utilisation d'une stratégie d'échange de tampon inertielle à base microfluidique pour purifier les cellules modifiées micro / nanoparticules avec l'épuisement efficace des particules non liées.
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Article de méthode
Microfluidique Buffer Exchange pour sans interférence Micro / Nanoparticules ingénierie cellulaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
cellules d'ingénierie avec micro ingrédient actif chargé / nanoparticules (IP) devient une méthode de plus en plus populaire pour améliorer les propriétés thérapeutiques indigènes, activer bio imagerie et contrôler le phénotype cellulaire. Une question cruciale encore insuffisamment abordée est le nombre important de particules qui restent non liés après marquage des cellules qui ne peuvent pas être facilement éliminé par centrifugation classique. Cela conduit à une augmentation de la bio bruit imagerie de fond et peut donner des effets transformateurs sur des cellules non-cibles voisines. Dans ce protocole, nous présentons un tampon stratégie d'échange inertiel à base microfluidique appelé comme Dean flux Fractionnement (DFF) pour séparer efficacement les cellules marquées de NPs libres d'une manière à haut débit. Le microdispositif spirale développé facilite la collecte continue (> de récupération des cellules de 90%) des cellules purifiées (THP-1 et CSM) en suspension dans une nouvelle solution tampon, tout en atteignant> 95% épuisement de colorant fluorescent non lié ou NPs colorant chargé (silique ou PLGA). Cette seule étape, la stratégie de purification de cellules basée sur la taille permet de haute cellule de traitement débit (10 6 cellules / min) et est très utile pour un grand volume de purification de cellules de micro cellules / nanoparticulaires conçue pour parvenir à une application clinique sans interférence.
Introduction
Ingénierie des cellules par l' agent chargé des micro / nanoparticules (NP) est une méthode sans intégration, et polyvalent simple, génomique pour améliorer la capacité de bioimagerie et d' augmenter / compléter ses propriétés thérapeutiques indigènes en médecine régénérative. 1-3 modifications cellulaires sont atteints par l' étiquetage de la membrane plasmique ou le cytoplasme avec une concentration supérieure à NPs __gVirt_NP_NN_NNPS<__ agents chargés pour saturer les sites de liaison. Cependant, un inconvénient majeur de cette méthode est que les quantités importantes de particules libres restant en solution après les processus d'étique....
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Protocole
1. Nanoparticules (NPs) Étiquetage des Cellules souches mésenchymateuses et monocytes
- Les cellules souches mésenchymateuses de la culture (MSC) dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et des antibiotiques à ≥80% de confluence avant l'étiquetage. De même, la culture des cellules THP-1 (ATCC) à Roswell Memorial Institute Park (RPMI) 1640 complété avec 10% de FBS à une densité de ~ 10 6 cellules / ml.
- NPs de silice de charge (~ 500 um) avec une solution de colorant calcéine (200 uM) en utilisant une nuit d'agitation. Fabriquez PLGA-calcéine AM (CAM) en utilisant un protoc....
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Résultats
Après marquage des cellules avec bio imagerie IP de l' agent chargé d'une nuit, les cellules marquées (contenant des particules libres) sont récoltées et purifiées par FFD spirale microdispositif pour éliminer les IP libres dans un processus en une seule étape (figure 1A). Le 2-entrée, microcanaux spirale 2-sortie est conçu par des logiciels d'ingénierie et de microfabriqué utilisant SU-8. La plaquette de silicium à motif est ensuite utilisé comme matrice pou.......
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Discussion
La technologie de purification des cellules DFF décrit ici permet une séparation rapide et continue de cellules marquées d'une manière à haut débit. Cette approche de séparation est idéale pour un grand volume d'échantillon élevé ou le traitement des échantillons de concentration cellulaire, et est meilleure que la filtration à membrane à base conventionnelle qui est sujette à l'encrassement, après une utilisation prolongée. De même, la séparation magnétique basée sur l'affinité nécessite des étapes d.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Le don de cellules THP-1 du Dr Mark Chong et l’aide en microfabrication du Dr Yuejun Kang et du Dr Nishanth V. Menon (École de génie chimique et biomédical, Université technologique de Nanyang) ont été grandement reconnus. Ce projet a été financé par NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. a été soutenu par la bourse postdoctorale de la Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| lignées cellulaires & Milieux | |||
| Cellules souches mésenchymateuses (CSM) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovin Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Cellules monocytaires THP-1 (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Réactifs & Matériaux | |||
| 0.01 % poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Seringue 3 ml | BD | 302113 | Seringue 3 ml Luer-Lock |
| Seringue 60 ml | BD | 309653 | Seringue 60 ml Luer-Lock |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2,5 L |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Lames de microscope ordinaire | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydiméthylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® ; 184 | |
| Scotch | tape 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (&sim ; 200 &mu ; m) | Sigma-Aldrich | 748161 | Taille des pores 4 nm |
| Pointe de seringue | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0,013 x 0,25 |
| Trypsine-EDTA (0,25 %) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0,02 x 0,06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA ; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Poinçon de biopsie | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| Caméra haute vitesse | Phantom ; | V9.1 | |
| Microscope à contraste de phase inversé ; | Nikon | Eclipse Ti | |
| Nettoyeur plasma | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Pompe à seringue | Chemyx | CX Fusion 200 |
Références
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., ....
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Réimpressions et autorisations
