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Article de méthode

In vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses

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DOI :

10.3791/54329

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20 août 2016

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1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

Dans cet article

Résumé

Une culture primaire de cellules endothéliales de cornée bovine a été utilisée pour étudier le mécanisme de transition endotheliale de la cornée mésenchymateuses. En outre, un modèle d'endothélium cornéen cryolésion de rat a été utilisé pour démontrer la transition de l' endothélium de la cornée mésenchymateuses in vivo.

Résumé

Les cellules endothéliales cornéennes (CEC) jouent un rôle crucial dans le maintien de la clarté cornéenne grâce à un pompage actif. Une réduction du nombre de CEC peut entraîner un œdème cornéen et une diminution de l’acuité visuelle. Cependant, les CEC humaines sont sujettes à un potentiel prolifératif compromis. De plus, la stimulation de la croissance cellulaire est souvent compliquée par la transition endothéliale-mésenchymateuse progressive (EnMT). Par conséquent, il est nécessaire de comprendre le mécanisme de l’EnMT pour faciliter la régénération des CEC ayant une fonction compétente. Dans cette étude, nous avons préparé une culture primaire de CEC bovines en épluchant les CEC avec la membrane de Descemet du bouton cornéen et démontré que les CEC bovines présentaient le processus EnMT, y compris le changement phénotypique, la translocation nucléaire de la β-caténine et les régulateurs EMT escargot et limace, dans la culture in vitro. De plus, nous avons utilisé un modèle de cryolésion de l’endothélium cornéen de rat pour démontrer le processus EnMT in vivo. Collectivement, la culture primaire in vitro de CEC bovines et de modèles in vivo de cryolésions de l’endothélium cornéen de rat offre des plateformes utiles pour étudier le mécanisme de l’EnMT.

Introduction

Les cellules endothéliales cornéennes (CEC) jouent un rôle essentiel dans le maintien de la clarté cornéenne et donc de l’acuité visuelle en régulant l’état d’hydratation du stroma cornéen par un pompage actif1. En raison du potentiel prolifératif limité des CEC humaines, le nombre de cellules diminue avec l’âge, et la réparation des plaies endothéliales cornéennes après une blessure est généralement réalisée par l’élargissement et la migration cellulaires, plutôt que par la mitose cellulaire2. Lorsque le nombre de CEC diminue en dessous d’un seuil d’environ 500 cellules/mm2, l’état de déshydratation du stroma cornéen ne peut pas être maintenu, entraînant une kératopathie bulleuse et une déficience visuelle3,4.

Le potentiel prolifératif limité des CEC humaines a été attribué à plusieurs facteurs, notamment l’expression réduite du facteur de croissance épidermique et de son récepteur dans les cellules vieillissantes5, l’antiprolifératif TGFβ2 dans l’humeur aqueuse6 et l’inhibition de contact2,7. Bien que certains facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF), puissent augmenter la prolifération dans un endothélium cornéen humain en culture, l’efficacité de la culture reste limitée8,9. De plus, les CEC peuvent subir un changement phénotypique au cours de l’expansion ex vivo, ressemblant à la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT)10-13. La transition endothéliale-mésenchymateuse (EnMT) est caractérisée par une déstabilisation de la jonction cellulaire, une perte de polarité apicale-basale, un réarrangement cytosquelettique, une expression de l’actine du muscle lisse alpha et une sécrétion de collagènede type I 14. Toutes ces caractéristiques peuvent abroger le fonctionnement normal des CEC, entravant l’utilisation des CEC cultivées ex vivo dans l’ingénierie tissulaire. De plus, l’EnMT a été associée à la pathogenèse de plusieurs maladies de l’endothélium cornéen, notamment la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs et la formation de la membrane rétrocornéenne15,16. Par conséquent, la compréhension du mécanisme de l’EnMT peut aider à manipuler le processus EnMT et faciliter la régénération des CEC pour permettre un fonctionnement compétent.

Dans cette étude, nous avons décrit une méthode pour isoler les CEC bovins du bouton cornéen. Dans la culture primaire in vitro, le processus EnMT, y compris un changement phénotypique, la translocation nucléaire de la β-caténine et les régulateurs EMT escargot et limace, a été observé. Nous avons également décrit une méthode de démonstration de l’EnMT in vivo en utilisant un modèle de cryolésion de l’endothélium cornéen de rat. En utilisant ces 2 modèles, nous avons démontré que la marimastat, un inhibiteur de la métalloprotéinase matricielle (MMP) à large spectre, peut supprimer le processus EnMT. Les protocoles décrits facilitent l’analyse détaillée du mécanisme EnMT et l’élaboration de stratégies pour manipuler le processus EnMT en vue d’une application clinique ultérieure.

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Protocole

Toutes les procédures suivies dans cette étude accordée à l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle du National Taiwan University Hospital.

1. Isolement, Culture Préparation primaire, et immunocoloration de Bovine CECs

  1. Acquérir les yeux frais de bovins à partir d'un abattoir local.
  2. Désinfecter les yeux d'une solution aqueuse à 10% p / v povidone-iode pendant 3 min. les laver avec une solution saline (PBS), une solution tamponnée au phosphate.
  3. Récolter le bouton cornéen avec un scalpel et les ciseaux dans des conditions stériles. la membrane de Peel Descemet avec une pince sous un microscope à dissection (à noter que dans cette étude, les yeux bovins ont été énucléés par un abattoir local et, par conséquent, la première procédure d'étude était la désinfection des yeux preenucleated dans le laboratoire).
  4. Incuber la membrane de Descemet dans 1 ml d'essayerPSIN à 37 ° C pendant 30 min. Ramassez les CECs bovine par centrifugation à 112 g pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu supplémenté épithéliale hormonale (SHEM) contenant des volumes égaux de tampon HEPES milieu Eagle modifié par Dulbecco et du milieu F12 de Ham, supplémenté avec 5% de sérum fœtal bovin, 0,5% de diméthylsulfoxyde, 2 ng / ml de l'épiderme humain facteur de croissance, 5 mg / ml d'insuline, 5 mg / ml de transferrine, 5 ng / ml de sélénium, 1 nmole / l de la toxine du choléra, 50 mg / ml de gentamicine et 1,25 mg / ml d'amphotéricine B.
  5. Ensemencer les cellules (environ 1 x 10 5 cellules par oeil) dans un plat de 6 cm. Culture eux dans la SHEM. Incuber le plat à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2 dans l' air. Changer le milieu de culture tous les 3 jours.
  6. Lorsque les cellules atteignent la confluence, lavez-les dans du PBS et incuber dans 1 ml de trypsine à 37 ° C pendant 5 min. Collectionnez-les par centrifugation à 112 g pendant 5 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de la SHEM.
    1. Compter les cellules dans un hémocytomètre. Ensemencer les cellules sur des lames de couverture à une densité de 1 x 10 4 par puits dans une plaque de 24 puits, et la culture des cellules de la SHEM. Pour étudier l'effet EnMT-suppression de marimastat, incuber les cellules dans SHEM avec 10 uM de marimastat ajouté dans le milieu de culture, et de changer le milieu de culture tous les 3 jours.
  7. Fixer les cellules à un point de temps indiqué avec 250 pi de paraformaldehyde à 4%, pH 7,4, pendant 30 min à température ambiante. Perméabiliser avec 250 ul de 0,5% de Triton X-100 pendant 5 min. Poulie à 10% de sérumalbumine bovine pendant 30 min.
  8. Incuber les cellules avec des anticorps primaires contre actifs bêta-caténine (ABC), escargot, et slug nuit à 4 ° C. La dilution des anticorps primaires utilisés est de 1: 200. Les anticorps sont dilués dans du diluant d'anticorps composée de 10 mM de PBS, 1% p / v de sérum-albumine bovine et 0,09% en poids / azoture de sodium c.
  9. Laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min, et on incube lem avec l'anticorps conjugué Alexa Fluor secondaire (1: 100 dans le diluant d'anticorps) à la température ambiante pendant 1 h.
  10. Contre-coloration dans le noyau cellulaire, en recouvrant les cellules avec 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min, et de les monter avec une solution anti-décoloration de montage.
  11. Obtenir des images d'immunofluorescence aux longueurs d'onde d'excitation de 405 et 488 nm en utilisant un microscope confocal à balayage laser, avec un grossissement de 20x objectif.

2. Modèle de rat cornéenne endothéliale cryolésion et injection intracamérulaire

  1. Anesthésier 12 semaines vieux rats mâles Sprague-Dawley par une injection intramusculaire de xylazine à 2% (5,6 mg / kg) et de la tilétamine, plus zolazepam (18 mg / kg). Pincez doucement la peau des animaux pour confirmer l'anesthésie appropriée en l'absence de contractions de la peau.
  2. Instiller une goutte de 0,5% de chlorhydrate de proparacaine à l'oeil droit de chaque rat pour réduire au minimum la douleur oculaire et le réflexe de clignement. Insufflertétracycline pommade à l'œil gauche pour prévenir la sécheresse de la cornée.
  3. Refroidir une sonde en acier inoxydable (diamètre = 3 mm) dans de l'azote liquide. Appliquer la sonde en acier inoxydable à la cornée centrale de l'oeil droit pendant 30 sec. Fréquemment instiller PBS à l'oeil droit lors de la procédure pour prévenir la sécheresse de la cornée.
  4. Instiller 0,1% atropine et 0,3% de sulfate de gentamicine immédiatement après cryolésion et une fois par jour pour soulager la douleur oculaire résultant de ciliaire spasme et pour prévenir l'infection.
    1. Après la procédure, garder les rats chaud à l'aide d'une lampe de chaleur, et d'observer leur récupération toutes les 15 min après l'anesthésie jusqu'à ce qu'ils reprennent le contrôle du moteur. En outre, appliquer la pommade tétracycline à l'oeil droit pour prévenir la sécheresse de la cornée au cours de la période de récupération.
  5. Répétez l'cryolésion cornéenne pendant 3 jours consécutifs.
  6. Pour délivrer le marimastat ou bFGF dans la chambre antérieure de l'œil de rat, anesthésier les rats comme décrit précédemment. Instiller une gouttede 0,5% de chlorhydrate de proparacaine dans l'œil droit de réduire au minimum la douleur oculaire et le réflexe de clignement.
  7. Irriguer la surface oculaire avec du PBS stérile. Effectuer la chambre antérieure paracentèse sous un microscope opératoire en insérant une aiguille 30 G attachée à une seringue de 1 ml à la cornée claire paralimbiques dans un plan au-dessus et parallèle à l'iris.
  8. Tourner l'aiguille biseau vers le haut, et légèrement appuyer sur la plaie cornéenne pour drainer une certaine humeur aqueuse et réduire la pression intra-oculaire. Injecter 0,02 ml du médicament intracamérulaire. comprimer doucement le tube de l'aiguille avec une pointe de coton pendant le retrait de l'aiguille.
  9. Photographie de l'œil externe à un point de temps indiqué sous le microscope opératoire.

3. La récolte du Rat Bouton cornéenne et immunocoloration

  1. Pour euthanasier les rats, les placer dans une chambre de l' euthanasie et laisser infuser 100% de CO 2 à un taux de 10-30% du volume de la chambre par minute de remplissage. Maintenir le CO 2 pour une perfusionminute supplémentaire suite à l'absence de la respiration et la couleur des yeux fané.
  2. Pénétrer l'œil de rat au limbe avec une lame tranchante. Couper les cornées avec des ciseaux cornéens le long du limbe. Aplatir les cornées sur une diapositive. Faire des incisions radiales supplémentaires si les cornées se recroquevillent.
  3. Fixer les cornées avec 250 pi de paraformaldehyde à 4%, pH 7,4, pendant 30 min à température ambiante. Perméabiliser avec 250 ul de 0,5% de Triton X-100 pendant 5 min, et de bloquer 10% de sérumalbumine bovine pendant 30 min.
  4. Incuber les cornées avec des anticorps primaires contre ABC pendant une nuit à 4 ° C avec une dilution de 1: 200 dans le diluant d'anticorps. Laver les cornées fois avec du PBS pendant 15 min, et de les laisser incuber avec l'anticorps secondaire (1: 100 dans le diluant d'anticorps) à la température ambiante pendant 1 h. Contre-coloration dans le noyau cellulaire, en recouvrant les cellules avec 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, et laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min.
  5. Monter les cornées en anti-fading solution de montage. Obnir les images d'immunofluorescence aux longueurs d'onde d'excitation de 405 et 561 nm avec un microscope confocal à balayage laser à un grossissement de 20x objectif.

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Résultats

Après l'isolement du PEC bovine, les cellules ont été cultivées in vitro. La figure 1 présente les images de contraste de phase de la CEC bovine. La forme hexagonale des cellules à confluence indiqué que les cellules ne sont pas contaminés par la cornée fibroblaste stromale lors de l' isolement cellulaire. La figure 2 représente la immunocoloration qui a été effectuée en utilisant des anticorps contre ABC, escargot, et slug à un point de...

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Discussion

CECs sont connus pour leur propension à subir des EnMT pendant la prolifération cellulaire. Pour élaborer des stratégies pour supprimer le processus EnMT à des fins thérapeutiques, une compréhension approfondie du mécanisme EnMT est nécessaire. Nous avons décrit 2 modèles pour étudier EnMT, à savoir la CCE bovine dans le modèle de culture in vitro et le rat endothélium cornéen modèle cryolésion. Nos résultats ont démontré le processus EnMT dans les deux modèles. En outre, l'effet de suppression de ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à déclarer.

Remerciements

Nous remercions le personnel du deuxième laboratoire de base, Département de la recherche médicale, Hôpital universitaire national de Taïwan pour leur soutien technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
trypsineThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco' milieu Eagle modifié et milieu F12 de HamThermoFisher Scientific11330
sérum fœtal bovinThermoFisher Scientific26140-079
diméthylsulfoxydeSigmaD2650
facteur de croissance épidermique humainThermoFisher ScientificPHG0311
insuline, transferrine, sélénium  ;ThermoFisher Scientific41400-045
toxine cholériqueSigmaC8052-1MG
gentamicineThermoFisher Scientific15750-060
amphotéricine BThermoFisher Scientific15290-026
paraformaldéhydeMicroscopie électroniqueSciences 111219
Triton X-100SigmaT8787  ;
albumine sérique bovineSigmaA7906
marimastatSigmaM2699-25MG
anticorps anti-bêta-caténine anti-actifMillpore05-665
anticorps anti-escargotSanta cruzsc28199
anticorps anti-limaceSanta cruzsc15391
chèvre anti-souris IgG (H+L) secondaire anticorpsThermoFisher ScientificA-11001pour la coloration de l’ABC des CEC bovins
Anticorps secondaires IgG (H+L) anti-sourisThermoFisher ScientificA-11003pour la coloration de l’ABC de l’endothélium cornéen du rat
Anticorps IgG (H+L) secondaire anti-lapinThermoFisher ScientificA-11008pour la coloration de l’escargot et de la limace des CEC bovins
Diluant d’anticorpsGenemed Biotechnologies10-0001
4',6-diamidino-2-phénylindoleThermoFisher ScientificD1306
support de montageVector LaboratoriesH-1000
microscope confocal à balayage laserZEISSLSM510
xylazine  ;BayerN/A
tilétamine plus zolazépamVirbacN/Amédicament vétérinaire
chlorhydrate de proparacaïne solution ophtalmiqueAlconN/Amédicament vétérinaire
0,1 % atropineWu-Fu Laboratories Co., LtdN/Amédicament clinique  ;
Sulfate de gentamicine à 0,3 %Sinphar GroupeN/Amédicament clinique  ;
facteur de croissance des fibroblastes de baseThermoFisher ScientificPHG0024médicament clinique  ;

Références

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