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Article de méthode

Préparation et caractérisation des lipophile doxorubicine micelles Pro-drogue

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DOI :

10.3791/54338

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2 août 2016

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1School of Pharmacy, Hampton University

Dans cet article

Résumé

Un protocole pour la préparation et la caractérisation de la doxorubicine lipophile pro-médicament chargé 1,2-distéaroyl sn - glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polyéthylène glycol) -2000] (DSPE-PEG) micelles est décrite.

Résumé

Les micelles ont été utilisées avec succès pour l’administration de médicaments anticancéreux. Les polymères amphiphiles forment des micelles structurées cœur-coquille dans un environnement aqueux par auto-assemblage. Le noyau hydrophobe des micelles fonctionne comme un réservoir de médicament et encapsule les médicaments hydrophobes. La coquille hydrophile empêche l’agrégation des micelles et prolonge également leur circulation systémique in vivo. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de synthèse d’un pro-médicament lipophile de doxorubicine, l’acide doxorubicine-palmitique (DOX-PA), qui augmentera la charge du médicament dans les micelles. Un agent de liaison hydrazone sensible au pH a été utilisé pour conjuguer la doxorubicine avec le lipide, ce qui facilite la libération de doxorubicine libre à l’intérieur des cellules cancéreuses. Le DOX-PA synthétisé a été purifié à l’aide d’une colonne de gel de silice en utilisant du dichlorométhane/méthanol comme éluant. Le DOX-PA purifié a été analysé par chromatographie sur couche mince (CCM) et spectroscopie par résonance magnétique nucléaire 1H (RMN 1H). Une méthode de dispersion de film a été utilisée pour préparer des micelles DSPE-PEG chargées de DOX-PA. De plus, plusieurs méthodes de caractérisation des formulations micellaires sont décrites, notamment la détermination de la concentration et de l’efficacité d’encapsulation de DOX-PA, la mesure de la taille et de la distribution des particules et l’évaluation des activités anticancéreuses in vitro. Ce protocole fournit des informations utiles concernant la préparation et la caractérisation des micelles chargées de médicaments et facilitera ainsi la recherche et le développement de nouveaux nanomédicaments anticancéreux à base de micelles.

Introduction

La chimiothérapie est couramment utilisé pour traiter diverses formes de cancers. La plupart, sinon la totalité, des médicaments de chimiothérapie ont des effets secondaires toxiques qui peuvent varier selon les conditions mineures administrable, tels que la nausée et de diarrhée, à des conditions plus menaçant la vie. Parce que la plupart des médicaments anticancéreux sont toxiques, l'exposition non sélective de ces médicaments à des tissus normaux provoque inévitablement la toxicité. Par conséquent, il y a un grand besoin d'une approche thérapeutique qui peut sélectivement délivrer des médicaments dans les cellules cancéreuses. Un autre défi à l'administration de médicaments anticancéreux est leur solubilité dans l'eau pauvre. Habituellement, des agents de solubilisation sont nécessaires pour formuler ces médicaments peu solubles. Cependant, la plupart des agents solubilisants, tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO), le Cremophor EL, et le polysorbate 80 (Tween 80) peut provoquer une toxicité hépatique et rénale, une hémolyse, des réactions d'hypersensibilité aiguë et des neuropathies périphériques. 1 Par conséquent, les formulations sûres et biocompatibles sont nécessaires pour l'utilisation clinique des pauvresmédicaments anticancéreux ly solubles. Nanocarriers sont prometteurs systèmes de délivrance de médicaments pour relever les défis ci-dessus. Ces nanocarriers comprennent des liposomes, 2 nanoparticules, 3 micelles, 4-7 conjugués polymère-médicament, 8 et des matériaux inorganiques. 9 Plusieurs produits de la nanomédecine (par exemple, Doxil, Abraxane, et Genexol) ont été approuvés par les organismes de réglementation pour traiter les patients atteints de cancer. dix

Les micelles polymériques sont prometteurs transporteurs de délivrance de médicaments à l' échelle nanométrique, qui ont été utilisés avec succès pour l'administration de médicaments anticancéreux. 4-7,11,12 micelles polymères typiques sont préparés à partir de polymères amphiphiles à travers un processus d' auto-assemblage. Les micelles polymères structurés à noyau-enveloppe comprennent une enveloppe hydrophile et un noyau hydrophobe. La coquille hydrophile peut stériquement stabiliser micelles et prolonger leur circulation dans le flux sanguin. Le noyau hydrophobe peut effectivement encapsuler d hydrophobetapis. En raison de la petite taille de micelles (typiquement inférieure à 200 nm) et des propriétés de longue circulation, les micelles polymères sont censés atteindre le ciblage tumoral grâce à une meilleure perméabilité et de rétention (EPR) effets (tumeur passive ciblage).

la stabilité de chargement de la drogue est critique pour la capacité de ciblage tumoral de micelles. Pour parvenir à un ciblage optimal des tumeurs, les micelles doivent avoir une fuite minimale de médicament avant d'atteindre le site de la tumeur, mais libérer rapidement le médicament après être entré dans les cellules cancéreuses. En outre, la stabilité de la formulation est également une condition essentielle pour le développement de produits, parce que la stabilité de la formulation détermine la faisabilité du développement des produits, ainsi que la durée de vie des produits développés. Récemment, beaucoup d'efforts ont été faits pour améliorer le chargement de la drogue dans les transporteurs de livraison. L'approche pro-médicament lipophile est une stratégie qui a été explorée pour améliorer la charge de médicament dans des nanoparticules lipidiques et émulsions. 13,14 Le conjugation de lipides avec des médicaments peut améliorer de manière significative leur lipophilie et améliorer le chargement et la rétention dans les composants lipophiles de nanocarriers.

Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation de la doxorubicine lipophile pro-drogue micelles chargées. Tout d'abord, la procédure de synthèse pour la doxorubicine pro-médicament lipophile est décrit. Puis, un protocole pour générer des micelles avec un procédé de film de dispersion est introduite. Cette méthode a été utilisée avec succès dans les études précédentes. 5 DSPE-PEG a été choisi en tant que matériau de support pour préparer des micelles parce qu'il a été utilisé avec succès pour la livraison micelle de médicaments. 15,16 Enfin, nous décrivons plusieurs essais in vitro utilisées pour caractériser micellaire Les formulations et d'évaluer l'activité anti-cancéreuse.

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Protocole

1. Synthèse de la DOX-PA

  1. Peser 390 mg de doxorubicine et 243 mg d'hydrazide d'acide palmitique, et les transférer dans un ballon à fond rond.
  2. Ajouter 150 ml de methanol anhydre dans le flacon avec une seringue en verre. Ajouter 39 ul d'acide trifluoroacétique (TFA) avec une pipette. L'utilisation d'un agitateur magnétique, agiter le mélange de réaction pendant 18 heures à la température ambiante dans l'obscurité.
    REMARQUE: Les quantités de matériaux de réaction peuvent être mis à l' échelle vers le haut ou vers le bas pour obtenir des quantités différentes de DOX-PA. Le rapport des réactifs doit être maintenue dans les mêmes proportions. Les réactions en utilisant des quantités DOX dans l'intervalle de 78 mg à 1 170 mg peut être effectuée dans un laboratoire de chimie régulière.
  3. La purification de la DOX-PA en utilisant une colonne de gel de silice. 17
    1. Retirer le solvant du mélange réactionnel avec un évaporateur rotatif. Ajouter 3 g de gel de silice après que le volume du mélange est réduit à environ 20 ml. Poursuivre l'évaporation rotative pour donner des poudres sèches et permettre til l'adsorption des produits sur le gel de silice. Maintenir l'échantillon sous vide pendant 30 minutes supplémentaires après que les poudres sèches sont formées.
    2. Empaqueter 50 g de gel de silice dans une colonne en utilisant du dichlorométhane comme solvant. Ajouter avec précaution l'échantillon de gel de silice contenant le produit adsorbé à la colonne.
    3. Éluer la colonne avec un mélange de dichlorométhane et de methanol, tout en augmentant progressivement le pourcentage de methanol, ce qui augmente la polarité du solvant (tableau 1).
    4. Collecter des fractions d'éluant dans des tubes à essai (25 ml / tube) et suivre les progrès par chromatographie sur couche mince (CCM).
    5. Combinez toutes les fractions contenant pur DOX-PA et éliminer le solvant en utilisant un évaporateur rotatif jusqu'à la poudre sèche est formée. En outre sécher le produit sous vide O / N.
  4. Analyse des DOX-PA par CCM.
    1. Coupez un 4 cm section de la plaque TLC x 8 cm. solutions d'échantillons ponctuels de 0,5 cm à partir du bas de la plaque de TLC en utilisant des capillaires de détachage sont réunisHanol comme solvant.
    2. Placer la plaque de CCM dans une chambre de développement contenant un mélange de dichlorométhane et de méthanol (3/1, v / v). La profondeur du solvant doit être un peu moins de 0,5 cm.
    3. Retirer la plaque de la chambre de développement lorsque le front de solvant atteint le sommet de la plaque. Marquer l'emplacement du front du solvant avec un crayon et laisser sécher la plaque. Placer la plaque de CCM dans une chambre de coloration contenant de la vapeur d'iode saturée dans le but de visualiser les échantillons.
  5. Analyse de la DOX-PA avec 1 H-résonance magnétique nucléaire de spectroscopie (RMN-1H). 18
    1. Dissoudre 15 mg de DOX-PA dans 1 ml de sulfoxyde de méthyle-d6 (DMSO) et transférer l'échantillon dans un tube RMN.
    2. Insérer le tube RMN dans l'aimant de l'instrument RMN. Mesurer le spectre de proton, avec du DMSO comme solvant. Retirer le tube RMN de l'aimant. Analyser le résultat RMN 18.

2. Préparation de DOX-PA micelles par la méthode du film de dispersion

  1. Dissoudre DSPE-PEG (40 mg) et de la DOX-PA (4 mg) avec 2 ml de methanol dans un flacon de 10 ml en verre.
  2. Retirer le solvant organique sous vide en utilisant un évaporateur rotatif jusqu'à un mince film se forme dans le flacon.
    REMARQUE: Vous pouvez également évaporer les solvants organiques sous gaz inerte (par exemple, l' argon ou de l' azote gazeux) pour former un film et de garder le flacon dans un dessiccateur sous vide pour éliminer davantage de solvant résiduel.
  3. Transfert 2 ml de sérum physiologique tamponnée au phosphate de Dulbecco (pH 7,4, DPBS) dans le flacon de verre.
  4. Placer le flacon dans un bain à ultrasons pendant 3 minutes à température ambiante pour générer des micelles.
    NOTE: Puissance ultrasonique varie selon les différents modèles de bains à ultrasons. Sélectionnez une unité qui peut générer assez de puissance à ultrasons pour disperser le film polymère / médicament mince. La puissance de sortie du bain à ultrasons utilisé dans ce protocole est de 110 W.
  5. Gardez micelles à 4 ° C pour le stockage à court terme et -20 ° C pour longtempsstockage -terme.
    NOTE: Alternativement, les micelles peuvent aussi être lyophilisé et reconstitué avec de l'eau avant utilisation. Normalement, il ne cryoprotecteur ou lyoprotecteur est nécessaire pour cette formulation.

3. Caractérisation de DOX-PA micelles

  1. Détermination de la concentration de DOX-PA dans les micelles et l' efficacité de la drogue encapsulation
    1. Dissoudre DOX-PA synthétisé dans les étapes précédentes dans du DMSO pour préparer des solutions de DOX-PA de cinq concentrations différentes: 1 ug / ml, 5 pg / ml, 20 pg / ml, 50 pg / ml et 100 pg / ml. Mesurer l'absorption de la solution de DOX-PA avec un spectromètre UV-VIS à 490 nm. Générer une courbe standard basé sur les concentrations de médicament DOX-PA et leur absorption correspondant à 490 nm.
    2. Diluer 25 ul d'une micelle de médicament chargé avec 500 ul de DMSO. Mesurer l'absorption à 490 nm avec un spectromètre UV-VIS. Calculer les concentrations de médicament avec la courbe standard générée en 3.1.1.
    3. Calculer l'efficacité d'encapsulation en utilisant l'équation suivante:
      L'encapsulation des médicaments Rendement (%) = (quantité de drogue dans les micelles) / (quantité de médicament ajoutée) x 100%
  2. Caractérisation de la taille des particules par diffusion de lumière dynamique (DLS) ,
    1. Diluer micelles avec du DPBS (pH 7,4) à une concentration finale de DSPE-PEG de 1 mg / ml. Analyser un échantillon de 2 ml avec un analyseur de taille de particules pour obtenir la taille et indice de polydispersité de la moyenne Z (PDI).
  3. L' évaluation in vitro de l' activité anti - cancéreuse
    REMARQUE: Utiliser une technique stérile appropriée et fonctionner à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique.
    1. Éliminer le milieu de culture cellulaire à partir d' un flacon de culture cellulaire (par exemple, T25) contenant des cellules DU-145 du cancer de la prostate humain et rincer les cellules avec 2 ml de DPBS (pH 7,4).
    2. Aspirer DPBS, ajouter 1 ml de solution de trypsine (0,25%), et incuber pendant 2 minutes à 37 ° C pour détacher les cellules.
    3. Ajouter 10 ml de milieu de culture cellulaire (RPMI 1640 + 10% de sérum bovin fœtal + 1% d'antibiotique-antimycotique), lorsque la plupart des cellules sont détachées du flacon. Transfert des cellules dans un tube centrifuge de 15 ml et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min.
    4. Remettre en suspension le culot de cellules avec 5 ml de milieu de culture cellulaire et de prélever un échantillon pour le comptage du nombre de cellules avec un hémocytomètre. Diluer les cellules avec un milieu de culture de cellules à une densité de 50.000 cellules / ml. Ajouter la suspension de cellules diluée dans une plaque de culture cellulaire à 96 puits (100 pl / puits). Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO2) pendant 18 heures pour permettre la fixation des cellules.
    5. Diluer DOX diméthylsulfoxyde (DMSO), la solution et la solution de DOX-PA DMSO avec un milieu de culture cellulaire pour obtenir une concentration finale de médicament de 0,1 pM, 0,5 pM, 2 pM, 5 pM et 10 pM, respectivement. Maintenir la concentration finale de DMSO dans tous les échantillons ci-dessus à 0,5%. Diluer micellaire DOX-PA avec un milieu de culture cellulaire pour obtenir finale du médicament concentrations de 0,1 pM, 0,5 pM, 2 pM, 5 pM et 10 pM, respectivement. Utiliser le milieu de culture cellulaire en blanc un contrôle.
    6. Retirer la plaque de culture cellulaire à 96 puits de l'incubateur et remplacer le milieu de culture cellulaire avec 100 ul de milieu contenant différents agents de traitement préparées dans l'étape 3.3.5 (n = 4 pour chaque groupe). Incuber les cellules dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO 2) pendant un temps supplémentaire de 72 heures.
    7. Aspirer le milieu et ajouter 100 ul de milieu contenant 0,5 mg / ml d'acide 3- (4,5-diméthyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphényl tétrazolium (MTT).
    8. Incuber les cellules dans l'incubateur de culture cellulaire pendant encore 2 heures. Retirez délicatement le moyen et ajouter 100 pi de DMSO pour dissoudre les cristaux de formazan.
    9. Mesurer l'absorbance au spectrophotomètre pour microplaques à une longueur d'onde de 570 nm et une longueur d'onde de 670 nm de référence.
    10. Calculer la viabilité cellulaire en utilisant l'équation suivante:
      Viabilité de cellule (%) = (A Test / Un contrôle) × 100%
      REMARQUE: Comparer la viabilité cellulaire entre les différents groupes en utilisant une analyse de variance (Anova) test statistique. Calculer la CI50 sur la base de la viabilité cellulaire par rapport à des données de concentration de médicament.

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Résultats

La figure 1 montre le schéma de synthèse de la DOX-PA. DOX-PA a été synthétisé par la conjugaison de l'acide palmitique avec de la doxorubicine à travers une liaison hydrazone sensible au pH. Un léger excès de l'hydrazide de l'acide palmitique a été utilisé pour faciliter l'achèvement de la réaction. Cette méthode de réaction a une efficacité très élevée et seulement une petite quantité de doxorubicine restant après une réaction de 18 h (Figure 2)...

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Discussion

Dans ce travail, nous décrivons une méthode film dispersion simple, rapide pour la préparation de micelles. Cette méthode utilise les propriétés d' auto-assemblage d'un polymère amphiphile (par exemple, DSPE-PEG) pour former des micelles structuré noyau-enveloppe dans un environnement aqueux. Cette méthode de préparation micellaire présente plusieurs avantages. 1. Il comprend un processus de formulation simple, ce qui évite l'utilisation de mesures de réduction de taille complexes (telles que l'...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes : subvention NIH-SC3, subvention NSF-PREM, bourse de recherche de la faculté de l’Université Hampton. Nous tenons à remercier Mme Michele A. Cochran du Virginia Institute of Marine Science (VIMS) pour l’utilisation de l’analyseur de taille de particules. Nous tenons également à remercier Mme Corinne R. Ramaley pour la révision du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DSPE-PEG2KCordenpharmLP-R4-039>95 %
DoxorubicineLC LaboratoriesD-4000>99 %
Hydrazide d’acide palmitiqueTCI AMERICA  ;   ;P000425G>98,0 %
MéthanolACROS Organics610981000anhydre
  ;PÊCHEUR ;D151-499,90 %
Méthylsulfoxyde-d6ACROS OrganicsAC320760075solvant RMN
Acide trifluoroacétique  ;ACROS OrganicsAC29381100099,50
Gel de siliceFISHER  ;L-7446230-400 maille
Baker Flex Plaques TLCFISHER  ;
DPBSSigma-AldrichD8537
DU 145  ; Cellules cancéreuses de la prostateATCCHTB-81
MTTACROS Organics15899005098 %
RPMI 1640 MediumMEDIATECH INC  ;10041CV
Antibiotique-Antimycosique  ;TECHNOLOGIES DE LA VIE  ;15240062100x solution mère
Sérum fœtal bovinLIFE TECHNOLOGIES  ;
Spectroscopie par résonance magnétique nucléaireVarian, Inc300 RMN  ;
Bü ; chi R-3 RotavaporBuchi1103022V1  ;Évaporateur rotatif
Bain à ultrasonsBRANSON ULTRASONICS CORPORATION  ;
spectromètre UV-VIS Biomate 3Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  ;Malvern Instruments Analysede la taille des particules
Spectrophotomètre de microplaques  ;Rio-RadBenchmark Plus  ;
Incubateur de culture cellulaireNapcoCO2 6000
Enceinte de sécurité biologiqueNuaire
SigmaPlot  ;Systat Software, Inc.Logiciel analytique
Plaque de culture cellulaire à 96 puitsBecton Dickinson353072
Trypsine  ; 0,25Corning Cellgro25-053-CI
chlorure de méthylène  %NC999012910437077CPX952318R %

Références

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