Comparaison de trois différentes méthodes pour la détermination de la prolifération cellulaire dans des lignées cellulaires de cancer du sein

Summary

Ce protocole décrit l’utilisation de trois méthodes différentes pour analyser la prolifération cellulaire dans les lignées cellulaires du cancer du sein. Cela comprend l’utilisation du comptage cellulaire conventionnel, de la viabilité cellulaire basée sur la luminescence et du comptage cellulaire à l’aide d’un imageur cellulaire. Chacun offre des avantages pour la mesure reproductible de la prolifération cellulaire.

Abstract

La mesure de la prolifération cellulaire peut être effectuée par un certain nombre de méthodes différentes, chacune ayant des niveaux variables de sensibilité, de reproductibilité et de compatibilité avec le formatage à haut débit. Ce protocole décrit l’utilisation de trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire in vitro, y compris une chambre de comptage d’hémocytomètre conventionnelle, un test basé sur la luminescence qui utilise la modification de l’activité métabolique des cellules viables comme mesure du nombre relatif de cellules, et un imageur cellulaire multimode qui mesure le nombre de cellules à l’aide d’un algorithme de comptage. Chaque méthode présente ses propres avantages et inconvénients pour la mesure de la prolifération cellulaire, notamment le temps, le coût et la compatibilité à haut débit. Ce protocole démontre que chaque méthode pouvait mesurer avec précision la prolifération cellulaire au fil du temps et qu’elle était sensible pour détecter la croissance à différentes densités cellulaires. De plus, la mesure de la prolifération cellulaire à l’aide d’un imageur cellulaire a permis de fournir des informations supplémentaires telles que la morphologie, la confluence et a permis un suivi continu de la prolifération cellulaire au fil du temps. En conclusion, chaque méthode est capable de mesurer la prolifération cellulaire, mais la méthode choisie dépend de l’utilisateur.

Introduction

Le gène suppresseur de tumeur, p53, est un régulateur essentiel d'un certain nombre de processus cellulaires, y compris l' arrêt du cycle cellulaire, l' apoptose et la sénescence ^1. Il est responsable du maintien de la stabilité génomique et il est donc essentiel pour le maintien de l'équilibre de la mort cellulaire et la croissance cellulaire. Des mutations dans p53 sont fréquents dans le cancer et sont la principale cause de l' inactivation de p53 menant au cancer de la prolifération cellulaire incontrôlée ^2. Fait intéressant, les mutations dans p53 ne comptent pour environ 25% des cancers du sein ^3, ce qui suggè....

Protocol

1. Les cellules Préparation pour la prolifération Assays

Note: Préparer les deux lignées cellulaires de la même manière et de la graine dans le même format pour chaque méthode à analyser.

1. Cultivez MCF-7-lego et MCF-7-Δ40p53 ⁷ cellules à 75-80% de confluence dans T 75 cm ² flacons de culture tissulaire en utilisant du phénol rouge libre milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) , 200 mM de L-glutamine, 2 pg / ml d' insuline et 1 pg / ml de puromycine à 37 ° C avec 5% de CO _2. Manipuler les cellules dans une biosécurité stérile classe armoire II. <....

Results

Pour étudier les différentes méthodes de mesure de la prolifération des cellules mises en culture, la prolifération cellulaire des cellules MCF-7-Δ40p53 cellules transduites a été comparée à la MCF-7-lego non transduites lignée cellulaire de cancer du sein. Les trois méthodes qui ont été comparés - la méthode d'imagerie hémocytomètre classique, le dosage de luminescence de la viabilité des cellules et la cellule analyse- sont décrites dans le schéma (Figure 1). Chaque mé.......

Discussion

Dans ce protocole trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire dans les cellules cultivées ont été examinées. Chaque procédé est capable de mesures reproductibles et précis de la prolifération cellulaire pendant 96 heures, et les résultats étaient comparables entre chacune des méthodes testées (figure 2 et 3). À la fois le dosage à base de luminescence et un procédé d'imagerie de cellules ont produit des résultats les plus robustes, montrant une augmentation linéaire de la pro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Milieu Eagle modifié de Dulbecco, sans rouge de phénol	ThermoFisher Scientific	21063-045	Complété par 10 % de FBS, 200 mM de L-glutamine, 2 et micro ; g/ml d’insuline et 1 & micro ; g/ml puromycine
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Solution d’insuline humaine	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Sérum fœtal bovin (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Dichlorhydrate de puromycine	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
solution de trypsine-EDTA à 0,5 % (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Diluer à 2x dans DPBS
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Fiole de culture tissulaire, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Compteur de cellules	Merck Millipore		Compteur de cellules automatisé
96 puits plaque multipuits,		Nunc
Improved	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 Microscope inversé Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Dosage par luminescence
Cytation 3 Cell Imaging Lecteur multimode	BioTek		Lecteur de plaques pour luminescence, fluorescence et imagerie cellulaire en fond clair
Gen5 Logiciel d’analyse de données	BioTek	GEN5