Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice

Résumé

Nous décrivons la préparation de tranches thymiques qui, en combinaison avec la cytométrie de flux, peuvent être utilisés pour modéliser la sélection positive et négative de développer des cellules T. Tranches thymiques peuvent également être adaptées pour l'analyse in situ de la migration des thymocytes, la localisation et la signalisation via immunofluorescence et la microscopie à deux photons.

Résumé

Thymiques produit de sélection dans un microenvironnement thymique unique et hautement organisée aboutissant à la génération d'un répertoire des cellules T auto-tolérance fonctionnelle. Dans les modèles in vitro pour étudier l' engagement de la lignée de T et de développement ont permis de mieux comprendre ce processus. Cependant, ces systèmes manquent de milieu thymique complet en trois dimensions nécessaires pour le développement des lymphocytes T et, par conséquent, sont des approximations incomplètes de sélection thymique in vivo. Certains des défis liés au développement de la cellule de modélisation de T peuvent être surmontés en utilisant des modèles in situ qui fournissent un microenvironnement thymique intact qui soutient pleinement la sélection thymique de développer des cellules T. Cultures tranche organotypiques thymiques complètent existant techniques in situ. tranches thymiques préserver l'intégrité des régions corticales et médullaires thymiques et fournissent une plate-forme pour étudier le développement des thymocytes superposées d'un stade de développement défini ou de endogène T caunes dans un microenvironnement thymique matures. Compte tenu de la capacité de générer ~ 20 tranches par souris, des tranches thymiques présentent un avantage unique en termes d'évolutivité pour des expériences à haut débit. En outre, la relative facilité à générer des tranches et le potentiel thymiques de superposer différents sous-ensembles de thymiques ou d'autres populations de cellules issues de milieux divers génétiques renforce la polyvalence de cette méthode. Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de tranches thymique, l'isolement et la superposition des thymocytes et la dissociation des tranches thymiques pour l'analyse cytométrique de flux. Ce système peut également être adapté pour étudier le développement des cellules T non conventionnelles, ainsi que de visualiser la migration des thymocytes, des interactions de cellules stromales thymocytes et des signaux associés à la sélection de TCR thymique par microscopie biphotonique.

Introduction

Les cellules T se différencient par une série d'intermédiaires du développement dans le thymus au cours de laquelle ils rencontrent plusieurs postes de contrôle qui assurent la génération d'une fonction auto-tolérance de répertoire des cellules T ^03/01. La sélection positive favorise la survie des thymocytes avec des récepteurs de cellules T (TCR) capables de reconnaître, avec une faible affinité à modérée, peptide présenté par les grandes molécules complexes d'histocompatibilité (CMH) sur les cellules corticales thymiques épithéliales (cTEC) ^2,3. La sélection négative et T régulatrices (T _reg) le développement des cellule....

Protocole

Protocoles pour toutes les études animales ont été approuvées par le Comité de protection des animaux au Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. La récolte de la souris Thymus pour la préparation des tranches thymiques et seule cellule Suspensions

1. Euthanize la souris avec du CO ₂ suivie d' une dislocation cervicale.
2. Dans une hotte à flux laminaire, la broche de la face ventrale de la souris jusqu'à une planche de dissection. Pulvériser la souris avec 70% d'éthanol. Retirez tout excès d'alcool en tamponnant avec de la gaze pour empêcher l'éthanol de pénétrer dans la cavité thoracique et endomma....

Résultats

Thymique analyse de soutien des tranches de différents aspects du développement des cellules T telles que la sélection positive et négative. Pour les expériences réussies, la qualité de la tranche thymique est primordiale. Ainsi, les tranches thymiques devraient être examinés pour assurer l'intégrité du tissu thymique et que l'agarose entourant la tranche thymique est intacte (figure 1A). La tension superficielle peut être compromise lorsque l&.......

Discussion

Nous décrivons ici un protocole pour la préparation des tranches thymiques et des résultats représentatifs de la sélection positive et négative efficace de superposition de pré-sélection du CMH de classe I restreints TCR thymocytes transgéniques par cytométrie en flux. Ce système a été utilisé avec un succès similaire pour soutenir la sélection positive des cellules T CD4 ⁺ CMH de classe II restriction de la pré-sélection thymocytes DP ^32, et, en présence de l' antigène de l' agoniste, la s.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S  ;
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50080	Moule d’enrobage d’agarose à basse température de fusion
(tronqué - T12)	Polyciences	18986	22 mm x 22 mm carré, tronqué à 12 mm x 12 mm
Lames de préparation à double tranchant	Personna	74-0002
Adhésif pour tissus	3M  ;	1469SB
0,4 et micro ; m Inserts de culture cellulaire  ;	BD Falcon	353090	De plusieurs marques testées, celles-ci ont maintenu les cellules au sommet des tranches le meilleur
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 avec L-glutamine	Wisent	350-000-CL
Sérum de bovin fœtal	Wisent	080-110	L-Glutamine inactivée par la chaleur
, 200	mM Wisent	609-065-EL
Pénicilline/Streptomycine, 100x	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoéthanol	Alfa Aesar	A15890
15 ml Tenbroeck Broyeurs de tissus	Wheaton	357426
Nylon Mesh Filter Component	Supply	U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Échantillon Pilon	Bel-Art	F19922-0000
40 et micro ; m Nylon Cell Strainer	BD Falcon	352340
Pince Inox Tip	Dumont  ;	RS-5047	Pince incurvée à pointe fine, taille .17 x .10 mm
Micro Pince	Dumont  ;	RS-5090  ;