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Article de méthode

Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice

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DOI :

10.3791/54355

⸱

6 août 2016

 ,  , 
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons la préparation de tranches thymiques qui, en combinaison avec la cytométrie de flux, peuvent être utilisés pour modéliser la sélection positive et négative de développer des cellules T. Tranches thymiques peuvent également être adaptées pour l'analyse in situ de la migration des thymocytes, la localisation et la signalisation via immunofluorescence et la microscopie à deux photons.

Résumé

Thymiques produit de sélection dans un microenvironnement thymique unique et hautement organisée aboutissant à la génération d'un répertoire des cellules T auto-tolérance fonctionnelle. Dans les modèles in vitro pour étudier l' engagement de la lignée de T et de développement ont permis de mieux comprendre ce processus. Cependant, ces systèmes manquent de milieu thymique complet en trois dimensions nécessaires pour le développement des lymphocytes T et, par conséquent, sont des approximations incomplètes de sélection thymique in vivo. Certains des défis liés au développement de la cellule de modélisation de T peuvent être surmontés en utilisant des modèles in situ qui fournissent un microenvironnement thymique intact qui soutient pleinement la sélection thymique de développer des cellules T. Cultures tranche organotypiques thymiques complètent existant techniques in situ. tranches thymiques préserver l'intégrité des régions corticales et médullaires thymiques et fournissent une plate-forme pour étudier le développement des thymocytes superposées d'un stade de développement défini ou de endogène T caunes dans un microenvironnement thymique matures. Compte tenu de la capacité de générer ~ 20 tranches par souris, des tranches thymiques présentent un avantage unique en termes d'évolutivité pour des expériences à haut débit. En outre, la relative facilité à générer des tranches et le potentiel thymiques de superposer différents sous-ensembles de thymiques ou d'autres populations de cellules issues de milieux divers génétiques renforce la polyvalence de cette méthode. Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de tranches thymique, l'isolement et la superposition des thymocytes et la dissociation des tranches thymiques pour l'analyse cytométrique de flux. Ce système peut également être adapté pour étudier le développement des cellules T non conventionnelles, ainsi que de visualiser la migration des thymocytes, des interactions de cellules stromales thymocytes et des signaux associés à la sélection de TCR thymique par microscopie biphotonique.

Introduction

Les cellules T se différencient par une série d'intermédiaires du développement dans le thymus au cours de laquelle ils rencontrent plusieurs postes de contrôle qui assurent la génération d'une fonction auto-tolérance de répertoire des cellules T 03/01. La sélection positive favorise la survie des thymocytes avec des récepteurs de cellules T (TCR) capables de reconnaître, avec une faible affinité à modérée, peptide présenté par les grandes molécules complexes d'histocompatibilité (CMH) sur les cellules corticales thymiques épithéliales (cTEC) 2,3. La sélection négative et T régulatrices (T reg) le développement des cellules contribuent à la mise en place d' une auto-tolérance par l'élimination ou le détournement de thymocytes qui répondent fortement à l' auto-peptide présenté par le CMH 2,4. Immature CD4 + CD8 + double positive (DP) thymocytes exprimant des TCR qui passent le processus de sélection se différencient en sous - populations de cellules T matures, dont la majorité sont CMH de classe I restreints cytotoxiques CD8 +ou du CMH de classe II restreint (SP) des cellules T CD4 + auxiliaires simples positifs, avant de quitter le thymus pour exécuter des fonctions effectrices dans les organes lymphoïdes secondaires 1-3.

Ajoutant à la complexité du développement des cellules T est la migration dynamique et rencontres cellulaires de développement thymocytes à travers le réseau de cellules stromales 5-9. Ces cellules stromales jouent des rôles distincts dans le développement des thymocytes et sont différentiellement répartis entre les régions corticales et médullaires thymiques où positive et la sélection négative se produisent 10. Bien que la sélection positive se déroule principalement dans le cortex, il y a accumulation de preuves que thymocytes DP migrent vers la moelle et continuent d'exiger des signaux TCR avant qu'ils ne se différencient en cellules T matures suggérant que la moelle peut fournir des signaux supplémentaires nécessaires à l'achèvement de la sélection positive et de la lignée différenciation 11,12. Plus loin,malgré la présence de cellules spécialisées médullaires thymiques épithéliales (MTEC) qui expriment et présentent des antigènes tissulaires restriction facilitant la suppression des thymocytes autoréactifs 13,14, une grande partie de la sélection négative se produit dans le cortex en réponse à ubiquitaire exprimé auto-peptide présenté par dendritique cellules 15,16. Ainsi, des modèles précis de développement des cellules T doivent fournir un microenvironnement thymique très organisée, avec corticale intacte et les régions médullaires, qui facilite l'interaction entre les thymocytes et les cellules stromales, et prend en charge la migration des thymocytes que ces cellules subissent une sélection positive et négative.

Afin de compléter l' analyse ex vivo de thymocytes comme moyen d'étude de sélection positive et négative, un certain nombre d'in vitro, in situ et in vivo dans des modèles de développement des cellules T ont été développés 17-22. Il a été notoirement difficile de récapitulersélection positif in vitro, mais coculture des populations de cellules souches ou de précurseurs de cellules T avec des cellules stromales exprimant ligand Notch, notamment OP9-DL1 / 4 cellules, a la capacité de soutenir l' engagement de la lignée T et une sélection positive limitée qui en fait un précieux modèle in vitro pour étude T développement des cellules 23-25. Limitations de ce système, cependant, comprennent le fait que ces cellules manquent de machines de traitement du peptide unique qui se trouve dans les cellules stromales thymiques et le microenvironnement thymique en trois dimensions.

Bien que techniquement plus lourd, in situ et in vivo dans des modèles de sélection thymique peut surmonter certains obstacles liés aux systèmes in vitro. Cultures d'organes thymiques réagréger (RTOC) contiennent des mélanges de thymocytes et les cellules stromales thymiques 18,26,27 définies. Ces reaggregates de cellules épithéliales thymiques maintenir la classe I et II l'expression du CMH et peuvent soutenir development des deux sous-ensembles classiques de cellules T, mais manquent encore défini les structures corticales et médullaires. Culture d'organes thymique fœtal (FTOC) est un modèle populaire du développement des cellules T qui peuvent être ensemencé avec thymocytes par culture goutte pendante de lobes thymiques lymphodepleted ou par injection de thymocytes en lymphoreplete lobes thymiques et soutenir le développement efficace des CD4 + et CD8 + T cellules au fil du temps dans la culture 18,28-31. Au début de la culture des lobes thymiques fœtaux il y a un manque de mTECs, mais les structures corticales et médullaires définies peut se développer au fil du temps en fonction des conditions. Une considération importante est que ce modèle peut préférentiellement soutenir foetal contre le développement des cellules T de l'adulte. Enfin, l'injection intrathymique des précurseurs thymiques définis chez la souris adulte est techniquement difficile, mais prévoit clairement un environnement pour soutenir Développement des cellules T in vivo. Ceux - ci in situ et des modèles in vivo sont d' excellents outils de to le développement étude des lymphocytes T et leur utilisation doivent être considérés sur une base expérience par expérience.

Tranches thymiques, cependant, ont récemment émergé comme un modèle complémentaire polyvalent pour étudier la sélection thymique in situ avec la possibilité d'accueillir unique, complexe, et les expériences de débit généralement plus élevés. Tranches thymiques maintenir l'intégrité des régions corticales et médullaires et fournissent un cadre de cellules stromales qui prend en charge la migration des thymocytes au cours du développement ainsi que l' efficacité de sélection positive et négative 11,32-39. Sous - ensembles ajoutés au - dessus des tranches thymiques thymocytes migrent dans les tissus et à leur microenvironnement créneau approprié 34,37. Thymocytes superposées peuvent être distinguées des cellules endogènes de tranche thymique par des marqueurs ou des marqueurs fluorescents congéniques et peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs jours. cultures thymique tranche organotypiques peuvent être utilisés pour étudier divers aspectsdu développement des cellules T y compris la sélection thymique, le comportement des thymocytes (migration et interactions cellulaires), et thymocytes localisation, entre autres. Etant donné la possibilité de générer ~ 20 tranches thymiques par souris, l'évolutivité des expériences est généralement supérieure à l' autre dans des modèles in situ de sélection thymique. Bien que la préparation de tranches thymiques nécessite un équipement spécialisé, comme le vibratome, et la durée de vie des tranches thymiques dans la culture est limitée en raison de la perte de cellules dans le temps par l'intermédiaire de la mort cellulaire et l'absence d'une membrane d'encapsulation, des tranches thymiques fournissent un excellent modèle pour l'analyse de la sélection thymique des populations synchronisées de thymocytes dans un microenvironnement thymique mature. Ici, nous décrivons la préparation de tranches thymiques (y compris la récolte du thymus, de l'agarose plongement de lobes du thymus et vibratome sectionnement du tissu incorporé), l'isolement et la superposition des thymocytes et la dissociation des tranches thymiques pour l'analyse cytométrique de flux.

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Protocole

Protocoles pour toutes les études animales ont été approuvées par le Comité de protection des animaux au Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. La récolte de la souris Thymus pour la préparation des tranches thymiques et seule cellule Suspensions

  1. Euthanize la souris avec du CO 2 suivie d' une dislocation cervicale.
  2. Dans une hotte à flux laminaire, la broche de la face ventrale de la souris jusqu'à une planche de dissection. Pulvériser la souris avec 70% d'éthanol. Retirez tout excès d'alcool en tamponnant avec de la gaze pour empêcher l'éthanol de pénétrer dans la cavité thoracique et endommager les tissus.
  3. Soulevez la peau à la base du sternum avec une paire de pinces et de faire une coupe à travers la peau. Prolonger la coupe de la peau vers le haut à chaque forelimb.
  4. Faire une coupe supplémentaire à la base du sternum pour séparer la membrane de la cage thoracique. Puis coupez chaque côté de la cage thoracique vers la clavicule. Retournez la cage thoracique plus vers la tête d'exposer la cavité thoracique. Les deux lobesles thymus se situent au-dessus du cœur.
  5. Retirer le tissu conjonctif autour des lobes thymiques en utilisant des pinces, des ciseaux de microdissection, et / ou des ciseaux courbes tranchantes. Utilisez une paire de fines pointes incurvées pince pour soulever les lobes individuels de dessous ou par l'intermédiaire du tissu conjonctif restant.
    Note: Ne pas saisir le thymus directement.
  6. Placez les lobes thymiques dans un tube conique de 15 ml contenant du PBS et mis de côté sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.

2. Agarose Embedding et Vibratome tranchage de thymiques Lobes

  1. Préparer une solution à 4% d'agarose pour l'enrobage en dissolvant 2 g bas point de fusion d'agarose dans 50 ml de PBS stérile et micro-ondes sur un réglage bas jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissous. Couvrir flacon de papier d'aluminium et placer dans un bain-marie à 55 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Dans une culture tissulaire capot, de préparer un milieu complet RPMI 1640 qui contient 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 4 mM de L- glutamine, 1 x pénicilline / streptomycine, et 10 pM2-mercaptoéthanol.
  3. Ajouter 1,5 ml de milieu RPMI complet 1640 par puits dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits et placer un insert de culture cellulaire dans chaque puits. Placer la plaque de côté dans un incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  4. Préparer un bain slushy d'eau glacée avec de l'eau et de la glace dans un seau à glace.
  5. Retirez délicatement tout le reste du tissu conjonctif entourant chaque lobe thymique utilisant pince fine pointe. Pour ce faire, tandis que le lobe thymique est immergé dans du PBS dans une boîte de culture de tissu, après le transfert sur un tissu lingette imbibé de PBS, ou sous un microscope à dissection.
  6. Laisser l'agarose refroidir en dessous de 40 ° C, lorsque le ballon est juste tiède au toucher, pour éviter la surchauffe du tissu. Verser le refroidissement 4% d'agarose dans un moule de tissu à une hauteur d'environ 1 cm.
  7. Utilisez une paire de pinces pour transférer soigneusement le lobe thymique à un tissu essuyez et rouler doucement pour sécher sans endommager les tissus. Assurez-vous que le tissu sèche complètement ou il glissera hors de l'agarose pendant le tranchage.
  8. Insérez délicatement le lobe dans l'agarose et le positionner horizontalement (pour augmenter la surface de chaque tranche) ou verticalement (pour augmenter le nombre de tranches) au fond du moule. Placer le moule dans de l'eau glacée pendant 5-10 min pour permettre la gélose se solidifier.
  9. Pendant ce temps, préparer le vibratome à trancher par le montage du bac tampon, l'assemblage du disque de spécimen, et en insérant la lame vibratome. Placez un morceau de ruban de laboratoire sur le disque de spécimen. Stériliser le nettoyage, l'espace de travail assemblé avec 70% d'éthanol.
  10. Une fois la solidification d'agarose, inverser le moule et appuyez doucement au centre pour libérer le lobe de l'agarose intégré.
  11. Utilisez une lame tranchante pour couper l'excès d'agarose entourant le lobe laissant ~ 2 mm d'agarose de chaque côté et ~ 0,5 cm en bas.
  12. Fixer chaque bloc d'agarose avec une goutte de colle de tissu à la pièce de ruban adhésif sur le disque de spécimen. Plusieurs blocs peuvent être collés sur la bande.
  13. Aligner la lame vibratome wiième sommet du bloc d'agarose. Remplissez le bac tampon avec du PBS stérile jusqu'à ce que le bloc (s) lame et agarose sont complètement immergé.
  14. Section du tissu d'agarose intégré pour obtenir des tranches d'une épaisseur de 400 à 500 um. Réglez le vibratome à 0,225 mm / sec vitesse de 100 Hz de fréquence, et 5 °.
  15. Utiliser une spatule recourbée pour recueillir les tranches thymiques dans une plaque de culture tissulaire contenant du PBS stérile car elles sont coupées. Jeter la première et la dernière tranche.
  16. Examiner les tranches sous un microscope optique à grossissement 4X. Choisissez les tranches avec le tissu thymique intact et entourant agarose (figure 1A).
  17. Transférer les tranches sur la plaque préparée à l'étape 2.3 en utilisant une pointe de pipette pour glisser doucement la tranche thymique de la spatule coudée sur l'insert de culture cellulaire. Chaque insert peut accueillir ~ 3 tranches. Assurez-vous que les tranches ne se touchent pas les uns les autres ou la culture cellulaire murs d'insertion.
  18. Maintenir la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. Préparation de thymocytes pour Superposition

  1. Isoler lobes thymiques comme décrit dans la section 1. Dissocier les lobes manuellement pour faire une seule suspension cellulaire en utilisant un broyeur 15 ml de tissu stérilisée rempli avec 5 ml de PBS stérile contenant 2% de FBS. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml.
  2. Centrifuger les cellules à 545 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse ACK 1x (0,15 M de NH4CI, 10 mM de KHCO 3, 0,1 mM de Na2EDTA) à la température ambiante pendant 3 minutes pour lyser les globules rouges.
  3. Remplir le tube à 15 ml avec du PBS contenant 2% de FBS. Centrifuger les cellules à 545 g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS contenant 2% de FBS et les cellules passent à travers un filtre à mailles de 255 um.
  5. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Centrifuger les cellules à 545 xg pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS contenant 2% de FBS à une concentrtion de 1 x 10 7 cellules par ml.
  6. Marquer les cellules avec des colorants cellulaires tels que l'ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE des) selon les protocoles du fabricant, sinon en utilisant des thymocytes de souris exprimant les marqueurs congéniques ou rapporteurs fluorescents codés génétiquement pour distinguer des cellules endogènes de tranche.
  7. Après le lavage final des cellules marquées, resuspendre le culot cellulaire dans un milieu RPMI-1640 complet à 1-3 x 10 6 cellules par 15 pi.

4. Superposition thymocytes sur le thymus Slices

  1. Utiliser une pipette pour aspirer tout liquide entourant les tranches thymiques sur l'insert.
    Remarque: Prenez soin de ne pas endommager l'agarose. Si l'agarose est endommagé, les thymocytes superposées ne seront pas fixer à la surface de la tranche en raison de la perte de tension de surface.
  2. Sans toucher la tranche avec la pointe de la pipette, overlay 15 pi de thymocytes préparées dans la section 3 sur chaque tranche thymique.
  3. Incuber les plate à 37 ° C pendant 2 heures pour permettre aux cellules de migrer dans les tranches thymiques.
  4. Après 2 heures, rincer les tranches thymiques 3 fois avec 1 ml de PBS pour éliminer l'excès thymocytes superposées qui n'ont pas encore migré dans le tissu.
  5. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les tranches thymiques sont prêtes à être récoltées, typiquement de 1 à 72 h en fonction de l'expérience.

5. Dissociation des thymiques tranches pour la cytométrie de flux

  1. Préparer un microtube pour chaque tranche en y ajoutant 150 ul de PBS contenant 2% de FBS.
  2. Ajouter 1 ml de PBS contenant 2% de FBS à l'insert de culture de tissu avec les tranches thymiques et on agite délicatement avec une spatule recourbée pour détacher les tranches de la surface de la pièce rapportée de culture cellulaire.
  3. Transférer la tranche de l'insert dans le tube à centrifuger à l'aide d'une spatule coudée.
  4. perturber manuellement la tranche en utilisant un échantillon de tube centrifuger pilon. Ajouter 150 ul de PBS contenant 2% de FBS jusqu'à un volume final de 300ul.
  5. Filtrez le tissu dissocié à travers un filtre de 40 um dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Les cellules filtrées sont prêtes à être colorées pour l' analyse cytométrique d'écoulement 40.
  6. Filtrez les cellules une seconde fois avant de les transmettre sur un cytomètre de flux pour assurer que tous les agarose est éliminé et ne pas obstruer l'écoulement cytomètre.
  7. Acquérir les cellules sur un cytomètre de flux et analyser les données comme il a été décrit précédemment 40.

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Résultats

Thymique analyse de soutien des tranches de différents aspects du développement des cellules T telles que la sélection positive et négative. Pour les expériences réussies, la qualité de la tranche thymique est primordiale. Ainsi, les tranches thymiques devraient être examinés pour assurer l'intégrité du tissu thymique et que l'agarose entourant la tranche thymique est intacte (figure 1A). La tension superficielle peut être compromise lorsque l&...

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole pour la préparation des tranches thymiques et des résultats représentatifs de la sélection positive et négative efficace de superposition de pré-sélection du CMH de classe I restreints TCR thymocytes transgéniques par cytométrie en flux. Ce système a été utilisé avec un succès similaire pour soutenir la sélection positive des cellules T CD4 + CMH de classe II restriction de la pré-sélection thymocytes DP 32, et, en présence de l' antigène de l' agoniste, la s...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous tenons à remercier Marilaine Fournier pour ses commentaires sur le manuscrit et Josée Tessier pour son assistance technique. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1 #4175 ont été obtenus par le biais du programme d’échange NIAID, NIH. Cette recherche est financée par une subvention de la Fondation SickKids et de l’IDSEAJN des IRSC (NI15-002), une subvention de fonctionnement de l’IMII des IRSC (MOP-142254) et des fonds de démarrage de l’Établissement de jeunes chercheurs (FRQS) et de la Fondation de l’Hôpital Maisonneuve-Rosemont à HJM. HJM est un boursier junior 1 du FRQS, un nouveau chercheur des IRSC (MSH-141967) et un récipiendaire d’une bourse de transition de carrière en début de carrière de la Fondation Cole.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
VibratomeLeica BiosystemsVT1000S  ;
NuSieve GTG AgaroseLonza50080Moule d’enrobage d’agarose à basse température de fusion
(tronqué - T12)Polyciences1898622 mm x 22 mm carré, tronqué à 12 mm x 12 mm
Lames de préparation à double tranchantPersonna74-0002
Adhésif pour tissus3M  ;1469SB
0,4 et micro ; m Inserts de culture cellulaire  ;BD Falcon353090De plusieurs marques testées, celles-ci ont maintenu les cellules au sommet des tranches le meilleur
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SalineThermoFisher21600-010
RPMI-1640 avec L-glutamineWisent350-000-CL
Sérum de bovin fœtalWisent080-110L-Glutamine inactivée par la chaleur
, 200mM Wisent609-065-EL
Pénicilline/Streptomycine, 100xWisent450-201-EL
2-MercaptoéthanolAlfa AesarA15890
15 ml Tenbroeck Broyeurs de tissusWheaton357426
Nylon Mesh Filter ComponentSupplyU-CMN-255
Microcentrifuge Tube Échantillon PilonBel-ArtF19922-0000
40 et micro ; m Nylon Cell StrainerBD Falcon352340
Pince Inox TipDumont  ;RS-5047Pince incurvée à pointe fine, taille .17 x .10 mm
Micro PinceDumont  ;RS-5090  ;

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