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Article de méthode

Extraction d'efficacité fiable et haute du rein cellules immunitaires

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DOI :

10.3791/54368

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19 août 2016

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1Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 2Division of Biomedical Sciences, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 3Division of Endocrinology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital

Dans cet article

Résumé

Des techniques fiables et efficaces pour l’isolement des cellules immunitaires rénales sont nécessaires pour les applications en aval. Cela nécessite le marquage par anticorps de surface d’un petit nombre de cellules immunitaires rénales. Nous décrivons ici une méthode concise d’isolement des cellules immunitaires rénales qui semble atteindre cet objectif.

Résumé

L’activation du système immunitaire se produit dans de multiples maladies rénales et processus physiopathologiques. Le système immunitaire se compose de composants adaptatifs et innés et de plusieurs types de cellules. Parfois, le type de cellule d’intérêt est présent en très faible nombre parmi le grand nombre de cellules totales isolées du rein. Par conséquent, l’isolement fiable et efficace des populations de cellules mononucléées rénales est important afin d’étudier les problèmes immunologiques associés aux maladies rénales. Traditionnellement, l’isolement tissulaire des cellules mononucléées rénales a été effectué par digestion enzymatique en utilisant différentes variétés et forces de collagénases/ADN produisant un nombre variable de cellules immunitaires viables. Récemment, avec le développement des perturbateurs tissulaires mécaniques pour l’isolement de cellules uniques, l’étape de digestion de la collagénase est évitée et remplacée par une simple perturbation mécanique des reins après extraction de la souris. Dans cet article, nous démontrons une méthode simple mais efficace pour l’isolement des cellules mononucléées rénales pour les extractions quotidiennes de cellules immunitaires. Nous démontrons en outre un exemple d’analyse de sous-ensembles de cellules immunitaires dans le rein. Il est important de noter que cette technique peut être adaptée à d’autres tissus mous et non fibreux tels que le foie et le cerveau.

Introduction

L' activation du système immunitaire se produit dans les maladies rénales et les multiples processus physiopathologiques 6,10,11,13. Les domaines potentiels de recherche active englobent les différents déclencheurs pour l'activation du système immunitaire, divers types de cellules impliquées, le motif cytokine / chimiokine dans un cadre particulier de la maladie, la modulation de tous les processus mentionnés ci-dessus par un médicament en particulier, etc. Pour illustrer, dans l'ischémie-reperfusion blessure (un modèle pour lésions rénales aiguës), il y a une augmentation dans les cellules immunitaires ou de moelle osseuse provenant des cellules hématopoïétiques ou CD45 + cellules en quelques heures, qui est soutenue par la période de réparation ou de fibrose (6 semaines plus tard) 5, 12. Ces cellules immunitaires sécrètent les cytokines et les chimiokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires pour orchestrer le processus de réparation 5,12. Actuellement, la possibilité d'utiliser simultanément plusieurs fluorophores pour étiqueter des populations de cellules dans une suspension cellulaire unique a augmenté avec l'annoncevent d'écoulement moderne cytométrie machines avec quatre à cinq lasers. Ceci a ajouté sensiblement à la capacité de distinguer les populations de cellules en fonction de leur état ​​de fonctionnement 3,7-. Par exemple, pour marquer avec précision un macrophage comme F4 / 80 basses CD11b haute Ly6b haute CD206 bas, au moins 3 autres fluorophores serait nécessaire dans le même volume d'échantillon à la porte pour les cellules vivantes, CD45 + (leucocytes) et Ly6G- (neutrophiles) et cela est tout à fait possible avec la nouvelle débit Cytometers 3. Cependant, les dosages en aval pour la sécrétion de cytokines, la prolifération cellulaire, la cytotoxicité, l'activation des macrophages et la quantification du nombre de différents sous-ensembles de lymphocytes et de monocytes n'a besoin pas de bonne qualité (cellules vivantes, singulets), mais un nombre suffisant de cellules.

Le système immunitaire dans le rein est constitué de deux composantes adaptatives et innée et plusieurs types de cellules 1,7,13. Par exemple, chez la souris les deux enfantsNeys sont ensemble rapporté pour contenir 2-17% (28,000-266,000) CD45 + cellules du rein totale des cellules immunitaires isolées (1,4 x 10 6 cellules) et environ 5-15% (1,400-4,200) de ceux - ci sont des cellules CD4 + 1 , 5,12. Un faible pourcentage (5-15%, 70-630) de ces cellules CD4 + sont FoxP3 + cellules (Figure 1) 1. En raison de ces réductions de pas sages en pourcentage de cellules, parfois la population cellulaire d'intérêt (dans ce cas CD45 + CD4 + Foxp3 + cellules) est représenté par un simple ~ 100 cellules. Le petit nombre de CD45 + CD4 + FoxP3 cellules +, il est impératif qu'un grand nombre de cellules totales sont isolées et les cellules sont de bonne qualité pour des études en aval, tels que des dosages de cytokines de sécrétion. En outre, il peut être nécessaire de combiner les reins 2-3 souris étant donné que les sous-populations ne sont pas représentés en nombre suffisamment élevé pour effectuer des dosages quantifiables. Par conséquent, l'isolement fiable et efficace des populations de cellules rénales mononucléaires est souhaitable afin de goujony le spectre immunologique associé à des maladies du rein.

Traditionnellement, pour l' isolement des cellules rénales mononucléaires, les chercheurs ont utilisé une variété de digestions enzymatiques telles que la collagénase 1A ou II y compris DNase 1 1,5,12. Il est bien connu que les collagénases ont une activité enzymatique qui varie en fonction des numéros de lot et par la société de fabrication, ce qui nécessite un titrage de la concentration optimale et la durée d'incubation 4,14,15. En outre, la digestion avec de la collagénase ajoute du temps pour hacher le rein en petits morceaux, nécessite l'incubation des morceaux de rein dans un (37 ° C), un bain chauffé et du temps supplémentaire pour l'incubation dans de l'EDTA pour arrêter la réaction. En outre, moins la stérilité peut être obtenue par certaines procédures en aval nécessitant une culture cellulaire. Plus important encore, selon l'enquêteur et toutes les variables impliquées, elle conduit à la variabilité des données et l'interprétation dans les laboratoires. Récemment, avec ledéveloppement de tissus mécaniques Perturbateurs / Homogéniéisateurs 16, l'étape de digestion de la collagénase est complètement évitée et remplacée par une rupture mécanique simple des reins 2. Ici, nous démontrons une méthode simple et efficace pour l'isolement des cellules immunitaires rénales pour les extractions de cellules immunitaires de tous les jours. Surtout, cette technique peut être adaptée à d' autres tissus mous et non fibreux tels que le foie et le cerveau 16.

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Protocole

Toutes les étapes du protocole effectuées ont été examinées et approuvées par l'Université du Missouri Animal Care et utilisation Comité (ACUC). Pour ce protocole, mâle C57BL / 6 souris âgées de 15 semaines ont été utilisées bien que théoriquement tout rongeur à tout âge peut être utilisé pour des expériences. Depuis, c'est une chirurgie non-survie, l'euthanasie est atteint par exsanguination et pneumothorax bilatéral.

1. Perfusion des Reins

Note: Perfusion des organes tels que le cœur, le foie et le rein élimine le sang qui peut interférer avec l'interprétation des données. Par conséquent, si possible, nous perfuser toujours les organes.

  1. Placer la souris dans un isoflurane (3 ml / min), chambre d'induction jusqu'à ce qu'elle soit immobile. Ensuite, retirez la souris hors de la chambre, posez-dorsalement sur la table de dissection et placez le cône isoflurane sur le nez de la souris et pousser isoflurane au taux de 1,5 ml / min à travers le régulateur.
  2. Vérifiez les responsab toe de pincemente avec des pincettes pour évaluer si l'animal a atteint un plan chirurgical de l'anesthésie. Nettoyez l'abdomen ventral avec une solution saline et couper ouvrir l'abdomen avec des ciseaux et pousser les organes abdominaux (hors du champ opératoire) sur le côté gauche de la souris.
  3. Prélever le sang de la veine cave inférieure avec un calibre 25 aiguille fixée à une seringue de 1 cc et l'ajouter à un tube de 1,5 ml contenant 10 pi de 0,5M EDTA.
    Remarque: Collection de sang est facultative. Le plasma peut être utilisé pour des mesures biochimiques. Les leucocytes peuvent être utilisées pour des analyses de cytométrie de flux.
  4. Avec des ciseaux, faire une petite incision dans l'oreillette droite pour laisser le mélange de sang et PBS de la prochaine étape.
  5. Prenez une seringue de 50 cc et remplir avec du PBS glacé (20-30 cc). Ensuite, fixer une aiguille 21-25 G à la seringue, la perforation du ventricule gauche à son sommet (tout en maintenant le cœur doucement entre forceps) et perfuser lentement le ventricule gauche avec un tampon phosphate salin pH 7,4 (PBS) au cours1-2 min.
    Remarque: Le cœur pâlit dès les premiers millilitres de perfusion. Observer le foie pour blanchir, comme cela indique que la perfusion est drainant du sang hors du foie, par le retour veineux par la veine cave. En outre, assurez-vous que les poumons ne sont pas en expansion pendant la perfusion car cela indique la ponction du ventricule droit. Si les poumons étaient à se développer, retirer l'aiguille légèrement en arrière dans le ventricule gauche et continuer la perfusion. Le temps écoulé entre la première incision jusqu'à ce que soit atteint l'euthanasie est inférieur à 2 min

2. Dissection de Reins

  1. Après la perfusion est terminée, utiliser des ciseaux et des pinces à disséquer le rein droit de ses attaches (vaisseaux sanguins, graisse et glandes surrénales) et accises.
  2. Retirez délicatement la capsule couvrant le rein en coupant et en disséquant avec une pince. Peser le rein.
    Remarque: Pesée du rein est facultative. Cependant, certaines expériencespeut entraîner une modification de la taille du rein / poids qui peut être utilisé pour normaliser la production de cellules par gramme de tissu.
  3. Après avoir pesé le rein, le placer dans 1 ml de RPMI-1640 contenant 0,5% de FBS ou de cytométrie en flux de solution tampon de coloration (50 ml vis conique tube de bouchon) et placer le tube sur la glace jusqu'à utilisation ultérieure.
    Remarque: Pour faciliter la description, on décrira le reste de l'isolement des cellules immunitaires dans le cytométrie en flux solution tampon de coloration. En outre, nous allons décrire l' isolement des cellules immunitaires à partir d' un seul rein, bien que les deux reins ou 1 + 1/3 e des reins peuvent être utilisés en fonction des expériences en aval ( en option). 1/3 ème du rein pourrait être congelé pour une protéine / ARN , et des expériences de 1/3 peut être placé dans des tampons pour la microscopie électronique à transmission ou immunohistochimie.

3. Homogénéisation de Reins

  1. Etiqueter un 5-80 ml Capacité du sac d'homogénéisation avec des informations d'identification de l'échantillon,retirer le filtre intérieur (STR) et le jeter. Remplissez le sac avec 5 ml de glace froide solution cytométrie de flux Coloration Buffer et transférer les reins à la mémoire tampon. Répétez ce processus pour un second échantillon ou plusieurs échantillons qui ont besoin de traitement.
  2. Plier le sac d'homogénéisation en deux, de telle sorte qu'une moitié a le rein immergé dans la solution tampon de marquage cytométrie en flux et l'autre moitié est simplement repliée sur elle.
  3. Allumez le homogénéisateur de tissu et réglez-le rapide (réglage) rpm. Placez le sac d'homogénéisation plié avec le rein face à la palette, à proximité du bord inférieur, mais assurez-vous que l'extrémité inférieure des sacs ne sont pas glisser en dessous de la limite inférieure des palettes.
    1. Traiter le second échantillon simultanément comme il y a 2 pagaies. Sélectionnez le temps que 120 secondes. Observer les palettes se déplacent en arrière pour homogénéiser les reins.
      Remarque: Pendant ce temps, ce temps d'arrêt peut être utilisé pour préparer les deux plus rein (ou d'autres tissus), les échantillons pendant les deux premières sont en train de traiter.
  4. Après avoir terminé avec le premier ensemble d'homogénéisation, transférer les sacs à glace et recharger le homogénéisateur de tissu avec la prochaine série d'échantillons et ainsi de suite. assurer visuellement que les reins sont suffisamment homogénéisé et pas de gros morceaux sont visibles.
    Remarque: En règle générale, 2 min dans l'homogénéisateur de tissu à un régime rapide est suffisant pour le rein.
  5. Placez une cellule crépine 100 um dans le 50 ml tube conique sur la glace. Ensuite, la pipette le broyat complètement sur le tamis cellulaire. Définir une centrifugeuse de plancher à 50 g pendant 1 min à 4 ° C et charger les échantillons dans la centrifugeuse.
    Remarque: Centrifugation veillera à ce que tous les homogénats de cellules (contenant) a passé à travers le tamis cellulaire.
  6. Retirer les tubes de la centrifugeuse et placez-les sur la glace. Jeter les crépines de cellules et de garder le broyat. Ajouter un volume égal (~ 6 ml), de 1 x tampon de lyse RBC au culot cellulaire / surnageant et on pipette de haut en bas plusieurs fois pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. Visually, observer une partie de la couleur rouge dans la diminution de la suspension immédiatement. Laissez les tubes sur la glace pendant 5 min pour atteindre la lyse maximale RBC.
    Remarque: l'étape de lyse RBC peut être ignorée si l'enquêteur est confiant de la perfusion rénale et moins de manipulation cellulaire est souhaitée. Nous avons observé une augmentation significative du rendement de cellules de rein de ne pas soumettre la suspension de cellules à une lyse RBC.
  7. Faire tourner les tubes dans la centrifugeuse qui a été réglée à 500 x g, 4 ° C pendant 5 min pour former un culot cellulaire.
    Remarque: Au cours des étapes 3.6 et 3.7, pour préparer la silice colloïdale (Percoll) sur la base d'une centrifugation à gradient de densité.
    1. Prendre 10 ml tubes ronds en polypropylène fond et les étiqueter avec des numéros d'échantillons correspondants et les placer dans un rack de tube.
      Remarque: Ce qui suit décrit comment faire assez de réactifs de gradient de densité pour 4 échantillons de rein.
    2. Prenez 7 ml de solution cytométrie de flux Coloration Buffer et la pipette dans un tube de 15 ml conique. Ajouter 1 ml de 2 M de saccharose àpréparer 0,25 M de saccharose.
    3. Ensuite, prenez 7,2 ml de réactif de gradient de densité et la pipette dans un autre 15 ml tube conique. Ajouter 1,55 ml d'une solution tampon de marquage cytométrie en flux et de 1,25 ml de 2 M de saccharose pour préparer 72% de réactif de gradient de densité et 0,25 M de saccharose.
    4. Introduire à la pipette 1 ml de 72% de réactif de gradient de densité dans un tube rond en polypropylene de fond pour chaque échantillon.

4. Centrifugation Gradient

  1. Après l'étape 3.7, prendre les tubes sur et doucement décanter le surnageant dans un mouvement lisse et transvaser également la prochaine goutte de liquide qui se forme alors que le tube est maintenu à l'envers.
    Remarque: Cette étape est importante, car en laissant l'excès de liquide peut changer le gradient suffisant pour créer une variation des rendements de densité. Lorsque le tube est remis en position verticale, ~ 200-300 pi de liquide reste avec le culot cellulaire.
  2. Introduire à la pipette 1 ml de 0,25 M de saccharose sur le culot cellulaire et lentement mais vigoureusement pipeter vers le haut et vers le bas pour brineg les cellules à une suspension uniforme. Ensuite, ajouter la suspension cellulaire à un réactif de gradient de densité de 1 ml de 72% (3.7.4) et à nouveau la pipette vigoureusement pour mélanger les cellules pour former un réactif de gradient de densité de 36%.
  3. Prélever 1 ml de réactif de 72% en gradient de densité en un polypropylène Pasteur (transfert) pipette. Avec une pression uniforme sur l'ampoule (maintient la colonne de liquide dans la pointe et empêche la formation de bulles), insérer la pipette Pasteur au fond de la suspension cellulaire (36% de réactif de gradient de densité) doucement et décharger le réactif de gradient de densité de 72% pour former un couche distincte plus lourd.
  4. Choisissez les tubes échantillons doucement et la placer dans la centrifugeuse, qui est à la température ambiante pendant cette étape. Spin pendant 20-30 min à 500 x g.
  5. Pendant ce temps, préparer deux autres ensembles de polypropylène ronde des tubes de centrifugeuse de fond avec les identifiants d'échantillons correspondants.
  6. Après l'étape 4.4 est terminée, retirez l'échantillon contenant des tubes en polypropylène en douceur, avec agitation minimale et posezsur le porte-tube.
  7. Décrochez le premier tube de l'échantillon et son tube vide correspondant. Avec une pipette de Pasteur polypropylène, doucement mais à fond avec aspiration mesurée, retirer la «couche d'ordure" supérieure ou "matériau gluant" et le mettre dans le tube rond fond de centrifugeuse vide.
    1. Continuez de retirer la partie supérieure du gradient jusqu'à ce que le "buffy coat" est atteint (peut apparaître blanc cassé avec une teinte rougeâtre [globules rouges]). Arrêter l'aspiration si une hauteur de ~ 3 mm est atteint du "buffy coat".
      Remarque: Assurez-vous que ce genre de choses est complètement disparu de la partie supérieure de la pente avant de continuer à aspiration.
  8. Prenez une pipette Pasteur fraîche et un tube de fond de centrifugeuse ronde fraîche et retirez délicatement la couche leucocytaire. Continuer à aspirer 3 - 5 mm en dessous de la couche leucocytaire, afin d' assurer que la plupart des cellules sont recueillies et ajoutées au tube à fond rond de 2 ème nouveau avec l' identificateur d'échantillon approprié.
  9. Ajouter 1-2 ml osolution f cytométrie de flux tampon de marquage au tube 2 ème et bien mélanger par pipetage de haut en bas.
  10. Isoler les cellules à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Une étape de lavage 2 e avec une solution cytométrie de flux Coloration Buffer est facultative. Remettre en suspension dans 500 pi de solution cytométrie de flux Coloration Buffer et passez à compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.

5. Facultatif (Cell Étiquetage)

  1. Aliquote de chaque échantillon pour le même nombre de cellules. Ajouter l'anticorps bloquant à une dilution de 0,5 ug par 10 6 cellules (CD16 anti / CD32 FcR) et laisser incuber sur de la glace pendant 15 min.
  2. Ajouter le cocktail souhaité d'anticorps primaires (conjugués à des fluorophores appropriés) qui sont déterminés à bien travailler avec l'autre par l'enquêteur, avant les expériences réelles. Incuber sur la glace pendant 30 min. Laver les cellules avec du PBS.
    Note: Pour la démonstration du rein immunitaire marquage cellulaire pour ce manuscrit, nous avons utilisé un T-lymphocyte et un panneau de cellules macrophage / dendritique. Le panneau des lymphocytes T est composée de Fixable Viabilité Stain FVS510, anti-CD45 (clone: ​​30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16s) APC, Anti-CD127 (Clone: ​​A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (Clone: ​​IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (Clone: ​​RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Clone: ​​53 à 6,7) BV785. Le panneau de macrophage est composée de Fixable Viabilité Stain FVS510, anti-CD45 (clone: ​​30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clone: ​​1A8) FITC, anti-CD11b (Clone: ​​M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Clone: ​​BM8) APC, Anti-CD11c (Clone: ​​N418) BV785.
  3. Ajouter la Fixable Viabilité Stain et laisser paillasse pendant 5 min. Laver les cellules avec une solution cytométrie de flux Coloration tampon pour éliminer l'excès de l'Fixable Viabilité Stain.
  4. Ajouter Fixation / réactif de perméabilisation et incuber une nuit à 4 ° C. Laver dans une solution de perméabilisation.
  5. Pour tache intracellulaire, bloquer à nouveau avec anti-CD16 / 32 FcR pendant 10min. Ajouter les taches intracellulaires et incuber pendant 20-30 min. Laver 2x en pesolution rmeabilization.
  6. Resuspendre en cytométrie en flux Coloration Buffer échantillons de solution et exécuter par la machine FACS 3,9.

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Résultats

Le nombre de panneaux qui peuvent être exécutées en fonction du nombre de cellules immunitaires qui peuvent être extraits de manière fiable sur les reins. Ici, nous démontrons la capacité d'exécuter 2 panneaux, un pour les lymphocytes T et un pour les macrophages / cellules dendritiques. Sur le panneau des lymphocytes T, nous examinons d' abord la diffusion vers l' avant (FSC) et de diffusion latérale (SSC) motif et délimiter la population d'intérêt comme le montre la

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Discussion

Nous avons présenté ici une méthodologie pour obtenir des cellules immunitaires du rein d'une manière fiable et efficace. La principale modification à l'étape de digestion par la collagénase largement utilisée (rupture mécanique du tissu) permet d'économiser environ 30 minutes et l'isolement d'un grand nombre de cellules immunitaires viables prend moins de deux heures pour les 4 échantillons de rein. En outre, en fonction de notre question de recherche, nous avons maintenant seulement utiliser un seu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail est soutenu par une subvention de recherche de Dialysis Clinics Inc. et de la subvention du Conseil de recherche de l’Université du Missouri.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Stomacher 80 Biomaster système de laboratoireSeward
Stomacher 80 Sacs ClassicSewardBA6040/STR
Sorvall Legend XFR CentrifugeuseThermo ScientificOu équipement équivalent  ;
HémocytomètreMicroscopie électronique Sciences63514-11
Cytomètre en flux analytiqueBD LSR-X20 Fortessa
Percoll  ;SigmaP1644
Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate 1x (DPBS)Gibco, Life Technologies14190-250
Tubes en polypropylène, sans capuchonBecton Dickinson352002
Fixable Viability StainBD Biosciences  ;FVS510,  ; 564406
Anti-CD16/32 (clone : 93)EBioscience14-0161
anti-CD45 (clone : 30-F11)  ; BV421  ;BD Pharmingen103133/4
Anti-Foxp3 (Clone : FJK-16S) APCEBioscience17-5773
Anti-CD127 (Clone : A7R34) PE/Cy7Biolegend135013/4
Anti-CD44 (Clone : IM7) PerCP/Cy5.5Biolegend103031/2
Anti-CD4 (Clone : RM4-5) APC-Cy7Biolegend100413/4
Anti-CD8 (Clone : 53-6.7) BV785Biolegend100749/50
Anti-Ly6G (Clone : 1A8) FITCBiolegend127605/6
Anti-CD11B (Clone : M1/70) PerCP-Cy5.5Biolegend101227/8
Anti-F4/80 (Clone : BM8) APCBiolegend123115/6
Anti-CD11c (Clone : N418) BV785Biolegend117335/6
Anti-CD301 (Clone : LOM-14) PE-Cy7Biolegend145705/6
Anti-CD26 (Clone : H194-112) PEBiolegend137803/4
100 &mu ; Filtre M  ;Fisher Scientific22363548
Fisherbrand Tubes 50 mlFisherOu équipement équivalent  ;
Fisherbrand Tubes 15 mlFisherOu équipement équivalent  ;
SucroseFisher chemicalS5-3
Pipette de transfert à pointe fineSamco Scientific232Ou équipement équivalent  ;
Solution tampon de coloration par cytométrie en fluxEBioscience00-4222-26ou équipement équivalent  ;
1x Tampon de lyse RBCEBioscience00-4333-57ou équipement équivalent  ;

Références

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