Purification de Native Complexes pour l'étude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity

Summary

La méthode de purification par affinité en tandem (TAP) a été largement utilisée pour isoler des complexes natifs à partir d’extraits cellulaires, principalement eucaryotes, pour la protéomique. Ici, nous présentons un protocole de méthode TAP optimisé pour la purification de complexes natifs pour des études structurales.

Abstract

approches de purification d'affinité ont réussi à isoler des complexes indigènes pour la caractérisation protéomique. hétérogénéité structurelle et un degré d'hétérogénéité de la composition d'un complexe ne gênent généralement pas les progrès accomplis dans la réalisation de telles études. En revanche, un complexe destiné à la caractérisation structurale doit être purifié dans un état qui est à la fois de composition et de structure homogène ainsi qu'à une concentration plus élevée que celle requise pour la protéomique. Récemment, il y a eu des avancées significatives dans l'application de la microscopie électronique pour la détermination de structure de grands complexes macromoléculaires. Cela a accru l'intérêt dans les approches pour purifier des complexes indigènes de qualité et en quantité suffisante pour la détermination structurale par microscopie électronique. La méthode Tandem Affinity Purification (TAP) a été optimisé pour extraire et purifier une 18 sous-unité, ~ 0,8 MDa ribonucléoprotéine ensemble de levure bourgeonnante (Saccharomyces cerevisiae)

Introduction

De nombreux processus cellulaires majeurs sont réalisées par grandes protéines et protéines complexes ^ARN-1. Un goulot d' étranglement important pour la réalisation d' études biophysiques et structurelles de ces complexes est leur obtention d'une qualité appropriée (c. -à- homogénéité) et à une concentration appropriée. Isoler un complexe à partir d'une source naturelle présente de nombreux avantages, notamment en conservant les modifications post-transcriptionnel et / ou traductionnelles pertinentes des sous-unités et assurer l'assemblage complexe approprié. Cependant, de grands complexes cellulaires sont souvent présents dans....

Protocol

Remarque: Le protocole suivant a été mis au point pour la purification d'un complexe de 4 litres de culture de cellules, environ 40 g de poids humide de cellules. Une fois préparé, tous les tampons doivent être conservés à 4 ° C et utilisés dans le mois de leur préparation. les inhibiteurs de la protéase et l'agent réducteurs ne sont ajoutés aux tampons juste avant d'utiliser.

1. Préparation de l'extrait de cellules entières pour Tandem Affinity Purification

1. La croissance de S. cellules cerevisiae
   1. Streak TAP désiré marqué S. cerevisiae souche de stockage (-80 ° C) sur une peptone ....

Results

Procédé TAP modifié a été utilisé pour purifier à partir de S. cerevisiae U1 snRNP, un complexe de ribonucléoprotéine 18 sous-unité. Une purification TAP initiale du complexe suivant le protocole publié ^2,3- a abouti à un complexe qui est apparu hétérogène, la migration en trois bandes sur un gel coloré à l' argent de Polyacrylamide natif (Figure 2A). Plusieurs tours d'optimisation de la méthode TAP, on a obtenu un complexe qui a migré comme étant ess.......

Discussion

La méthode TAP utilise deux balises qui équilibrent un besoin pour la liaison rigoureuse et sélective à une résine d'affinité avec un désir de maintenir près des conditions de solution physiologique. Cet équilibre permet de préserver l'interaction stable (s) de la protéine marquée avec l'interaction facteur (s) pour la post-purification de caractérisation. En outre, la TAP individuelle étiqueté ORFs sont disponibles à partir d'une source commerciale, de sorte que l'on peut obtenir toute souche de lev.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Souche de S. cerevisiae marquée TAP	Open Biosystems	YSC1177	Il s’agit de la souche de levure primaire utilisée pour développer le protocole TAP. Son origine est S288C : ATCC 201388 : MATa, his3&Delta ; 1, leu2 et Delta ; 0, met15 et Delta ; 0, ura3 et Delta ; 0, SNU71 ::TAP ::HIS3MX6
Moulin à café	Mr. Coffee	IDS77	Utilisé pour la lyse cellulaire
Hémocytomètre, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Utilisé pour évaluer la lyse cellulaire
JA 9.100 rotor de centrifugeuse  ;	Beckman Coulter, Inc.		Utilisé pour récolter les cellules de levure
Rotor de centrifugeuse à angle fixe JA 20	Beckman Coulter, Inc.		Utilisé pour éliminer l’extrait cellulaire non soluble du rotor de
centrifugeuse à angle fixe Ti 60	Beckman Coulter, Inc.		Utilisé pour clarifier davantage l’extrait cellulaire soluble
Thermomixeur	Eppendorf	R5355	Agitateur à température contrôlée
Système de gel Novex	Thermo Fisher Scientific  ;
Résine IgG	GE Healthcare	17-0969-01	à flux rapide Sepharose 6
	Agilent Technologies, Inc.	214303	Résine Affinity Cocktail d’inhibiteurs
protéase, mini comprimés	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra sans EDTA
Cocktail d’inhibiteurs de protéase, grands comprimés	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra sans EDTA
Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)			Dissous dans de l’isopropanol
2 ml Bio-spin column	Bio-Rad Laboratoires, Inc.	7326008	Utilisé pour emballer et laver la résine Calmodulin
10 ml poly-prep	colonne Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Utilisé pour emballer et laver la résine IgG
Gels natifs PAGE Bis-Tris préfabriqués	Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16 % gels polyacrylamides préfabriqués Étalon de
protéines NativeMark Thermo	Fisher Scientific	LC0725	Étalon de protéines non colorées utilisé pour PAGE natif. Charge 7,5 &mu ; l pour un gel teinté d’argent et 5 &mu ; l pour un gel SYPRO Rubis coloré
Préfabriqué SDS PAGE Bis-Tris gels	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12 % gels préfabriqués de polyacrylamide  ;
Étalon protéique PageRuler	Thermo Fisher Scientific	26614	Étalon protéique non coloré utilisé pour le
tampon de fonctionnement SDS	Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS
Buffer TAP	anticorps Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Anticorps primaire contre l’étiquette CBP
Anticorps secondaire	Thermo Fisher Scientific	31341	Chèvre anti-phosphatase alcaline de lapin conjuguée
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tétrazolium  ;
Unités de dialyse	Thermo Fisher Scientific	88401	Mini unités de dialyse Slide-A-Lyzer
Unités de filtration centrifuges, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 Unité de filtration centrifuge avec membrane Ultracel-100
Billes absorbant les détergents	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Bio-bille SM-2 absorbants
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Colorant fluorescent pour la coloration des acides nucléiques, lors de la détection avec SYPRO Ruby présent, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et une longueur d’onde d’émission de 532 nm
Sondes moléculaires	SYPRO Ruby	S-12000	Colorant fluorescent pour la coloration des protéines, lors de la détection avec SYBR Green II présent, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 457 nm et une longueur d’onde d’émission de 670 nm
Grilles de cuivre	Microscopie électronique Sciences	G400-CP