Le goût est un processus sensoriel important qui facilite l’attraction vers les substances bénéfiques et l’évitement des substances toxiques. Ce protocole décrit un essai d’ingestion simple permettant de déterminer la préférence gustative de la drosophile pour un composé chimique donné.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La perception olfactive et gustative de l’environnement est vitale pour la survie des animaux. L’application la plus évidente de ces chimiosens est d’être capable de distinguer les bonnes sources alimentaires des sources alimentaires potentiellement dangereuses. La gustation nécessite un contact physique avec un composé chimique capable de signaler à travers les récepteurs gustatifs qui sont exprimés à la surface des neurones. Chez les insectes, ces neurones gustatifs peuvent être situés dans tout le corps de l’animal, ce qui permet au goût de jouer un rôle important dans de nombreux comportements différents. Les insectes préfèrent généralement les composés contenant des sucres, tandis que les composés considérés comme amers sont évités. Étant donné l’importance biologique fondamentale du goût, il y a un intérêt intense à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette modalité sensorielle. Nous décrivons un test de goût de la drosophile adulte qui reflète la préférence des animaux pour un composé savoureux donné. Cet essai peut être appliqué à des animaux de n’importe quel patrimoine génétique afin d’examiner la préférence gustative d’un composé soluble souhaité.
Introduction
Les animaux utilisent chemosensation pour distinguer des conditions avantageuses en dehors des conditions désavantageuses. Cette perception peut être critique pour des choses telles que la détermination de la meilleure source alimentaire, en évitant les substances toxiques ou de déterminer le meilleur partenaire d'accouplement 1. Chemosensation est souvent divisée en deux composants sensoriels: sens olfactif et les sens gustatifs. Une principale caractéristique distinctive de ces sens est que l'olfaction (odorat) est utilisé pour échantillonner l'environnement chimique gazeux environnant tout gustation (goût) nécessite un contact physique avec un substrat non volatile. Les deux modalités sensorielles stimulent les réponses neurologiques qui sont traités et décodés dans le cerveau pour produire le comportement attractives ou répulsives appropriée 2. Ces sens sont donc essentiels pour la survie des animaux.
La mouche des fruits Drosophila melanogaster est un organisme modèle qui continue de croître en popularité pour une utilisation dans comprendrement comment les insectes perçoivent l'odeur et le goût. Les mouches des fruits offrent d'énormes avantages par rapport aux autres systèmes de modèles en raison de la richesse des outils génétiques disponibles pour la dissection des voies moléculaires, cellulaires et comportementales. Le travail au cours des 15 dernières années a été particulièrement important dans la caractérisation des identités cellulaires spécifiques, des récepteurs neuronaux, et les mécanismes impliqués à la fois l'odeur et le goût de signalisation. Maintenant, la puissance de la génétique chez la drosophile est utilisée pour élucider la façon dont ces processus sont codés au neurone unique et un seul circuit niveau 3-6. Par conséquent, les essais qui fournissent facilement marqué des lectures altérations des voies sensorielles sont essentielles à l'avance continue de ces champs.
Alors que beaucoup est connu sur la façon dont les signaux olfactifs sont codées et traitées dans le cerveau, beaucoup moins, on entend à propos des mécanismes similaires dans la voie de gustatifs. Nous décrivons ici un protocole qui peut être utilisé pour déterminer le goût préférenCE chez la drosophile. Drosophila, comme les mammifères, préfèrent généralement composés de goût sucré , par opposition à des composés de goût amer. Toute combinaison de ces sources de nourriture peut être utilisée dans cette conception expérimentale pour déterminer comment des altérations génétiques connues affectent le choix du goût. En outre, les stratégies d'intervention pharmacologiques peuvent être évalués de manière similaire pour leurs effets sur la préférence du goût des animaux. La facilité et la flexibilité de ce test, il est un paradigme utile pour comprendre la nature de la perception gustative chez la drosophile.
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Protocole
1. Starvation
- Préparer voler des flacons de famine en saturant une boule de coton avec 18,2 MQ eau au fond d'un flacon de mouche standard. Alternativement, saturer de même une petite bande de papier filtre avec 18,2 MQ eau et lieu à un angle dans le flacon.
- Recueillir les mouches dans des ensembles de ~ 100 animaux sur un coussin de CO 2, puis ajouter les mouches à un flacon préparé.
Remarque: Les meilleurs résultats sont obtenus avec les animaux qui sont âgés de moins de 5 jours. Cependant, l'âge exact des animaux peut être contrôlée comme une variable expérimentale pour déterminer les changements dans les préférences des goûts au fil du temps. - Utiliser une boule de coton ou de mousse bouchon pour fixer les flacons fermés. Placez les flacons de leur côté dans un incubateur à environnement contrôlé. Maintenir la température à 25 ° C et le taux d'humidité supérieur à 70%. Laisser les flacons intacts pendant 24 heures.
2. Goût préférence Assay
- Préparer tous sapides pour le test le même jour uns tests.
Remarque: Les tastants exactes à utiliser varie en fonction de la question expérimentale posées. Ce qui suit est un exemple tastants utilisés dans ce protocole. Voir la section 4 pour les optimisations.- Préparer le contrôle exhausteur de goût (1 mM de saccharose) en combinant 10 ul de 100 mM solution de saccharose, 13 pi de colorant alimentaire rouge, et 977 pi de 18,2 MQ eau.
- Préparer exhausteur de goût expérimental (5 mM de saccharose) en combinant 50 ul de 100 mM solution de saccharose, 10 pi de colorant alimentaire bleu, et 940 pi de 18,2 MQ eau.
- Faire des chambres d'essai en utilisant un x 15 mm plat en plastique de Pétri 100 mm standard préparé de la manière suivante:
- Placez trois 10 gouttes ul de contrôle exhausteur de goût le plus proche du bord de la plaque à 12 heures et un autre 3 gouttes à 6 heures. Assurez-vous que l'espacement entre les gouttes est similaire.
- Placez trois 10 gouttes ul d'exhausteur de goût expérimental le plus proche du bord de la plaque à 3 heures et uneautre 3 gouttes à 9 heures. Assurez-vous que l'espacement entre les gouttes est similaire.
- Répétez les étapes 2.2.1 et 2.2.2 pour autant de répétitions que désiré.
- Empty 1 flacon de ~ 100 mouches affamées sur un tampon juste assez longtemps pour anesthésier les animaux (environ 10 sec) CO 2. Badigeonner les animaux dans le milieu d'une chambre de dosage préparée et couvrir avec le couvercle plat.
Remarque: plus longue période de CO 2 l' exposition doit être évitée afin d' améliorer le temps de récupération et de limiter les interférences avec le comportement alimentaire. L' exposition à la glace (~ 5 min) peut être utilisé pour anesthésier pour éviter CO 2 effets comportementaux qui peuvent découler de même exposition limitée. - Placer la chambre de dosage dans une boîte en carton opaque. Assurez-vous d'étiqueter l'extérieur de la boîte avec la condition et le génotype testé.
- Placer l'ensemble de l'installation (chambre dosage contenue dans une boîte en carton à l'étape 2.4) dans un incubateur à 25 ° d'au moins 70% d'humidité pendant 2 heures.
- Répétez les étapes 2.3 à 2.5 pour toutes les répétitions.
- Après 2 heures, placer les chambres d'analyse, encore contenus dans des boîtes en carton, directement dans un -20 ° C au congélateur jusqu'au moment pour la quantification.
3. Goût préférence Assay Quantification
- Permettre une chambre de dosage unique se réchauffer à la température ambiante (environ 5 min).
- Sous un microscope de dissection, en utilisant une brosse ou une paire de pinces, les animaux du groupe sur la base de la couleur de leur abdomen: rouge, bleu, violet ou clair (Figure 1).
- Notez le nombre d'animaux dans chaque groupe. Considérer les animaux claires de ne pas avoir participé à l'essai, et donc ne pas les inclure dans les calculs.
- Calculer l'indice de préférence selon l'une des équations suivantes:
- Si l'exhausteur de goût expérimental d'intérêt est ajouté au colorant rouge, puis utilisez (N rouge + 0,5N violet) / (N + N rouge bleu + N purple).
- Si l'exhausteur de goût expérimental est ajouté au colorant bleu, puis ajuster l'équation (N bleu + 0,5N violet) / (N + N bleu rouge + N violet).
- Répéter les calculs pour toutes les conditions expérimentales et répétitions.
4. Optimisation du Goût Préférence Assay
- Déterminer empiriquement la concentration des indicateurs de colorants alimentaires à être utilisé si le colorant alimentaire ne modifie pas les résultats de l'essai de goût, de la manière suivante:
- Préparer 4 tastants en utilisant le même composé de base (par exemple mM de sucrose 5) comme indiqué dans l' étape 2.1, mais omettre le colorant alimentaire.
- Ajouter 1,3% colorant alimentaire rouge à l'un des sapides. Faire les 3 tastants restants avec colorant alimentaire bleu de concentrations variables dans chaque tube (par exemple 0,6%, 1% et 1,3%).
- protocole complète les étapes 2.2 à 3.4 pour chaque paire exhausteur de goût: 1,3% contre 0,6% rouge bleu; 1,3% contre 1% rouge et bleu1,3% contre 1,3% rouge bleu.
- Répétez l' étape 4.1.1-4.1.3 avec différents pourcentages de colorant alimentaire bleu jusqu'à ce que les moyennes de l' indice de préférence une valeur de 0 (Figure 2).
Remarque: En tant que point de départ, 1,3% du colorant alimentaire rouge couplé avec 1% de colorant alimentaire bleu donne généralement de bons résultats. Si aucune concentration satisfaisante de colorant alimentaire bleu peut être adaptée à 1,3% de colorant, puis l'étape 4.1.1 à travers 4.1.3 peut être répété avec des concentrations variables de colorant rouge et une concentration constante de colorant alimentaire bleu. - Analyser toutes les conditions à tester avec les mêmes concentrations optimisées de colorant alimentaire.
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Résultats
Quelques résultats typiques de goût des tests de préférence sont présentés ci-dessous. Dans la plupart des expériences une certaine variation de l'intensité de la coloration abdominale On voit (figure 1). Toute coloration dans l'abdomen si intense ou faible est considéré comme une ingestion positive. Il est donc conseillé aux chercheurs de marquer les animaux tout en aveugle à la condition expérimentale afin de limiter les biais potentiels.
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Discussion
Nous avons décrit un protocole simple mais efficace pour déterminer la préférence de goût chez la drosophile. Les versions de ce test sont couramment utilisés dans des expériences pour déterminer les contributions des récepteurs gustatifs (Grs) pour percevoir les différentes qualités (amer, sucré, acide, salé et umami) des composés de goût. Le génome de la Drosophile contient environ 60 gènes qui codent pour 68 récepteurs gustatifs identifiés par l' épissage alternatif 8,9. Cependant, d&...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Tessier pour la lecture critique de ce manuscrit et les suggestions utiles lors de la préparation de ce protocole.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Colorant alimentaire bleu (eau, propylène glycol, FD& C Bleu 1 et Rouge 40, Propylparabène) | McCormick | N/A | |
| Boîtes cryo/congélateur sans séparateurs | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Acide acétique glacial | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | ||
| Boîte de Pétri (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Réutilisable si soigneusement lavé et séché |
| Microtubes Quick-Snap | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Colorant alimentaire rouge (eau, propylène glycol, FD& C Rouges 40 et 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Saccharose | IBI | IB37160 |
Références
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- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
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