Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons

Résumé

Une nouvelle technique de détection des récepteurs endogènes de faible abondance présents dans les embryons de poisson-zèbre est décrite. Nous l’avons nommé AFLIP car il consiste en un marquage par affinité du récepteur par son ligand lié à l’immunoprécipitation.

Résumé

En combinant les puissances de l’abeling Affinity Let de la récipitation Immunop(AFLIP), une technique de détection des récepteurs de faible abondance dans les embryons de poisson-zèbre a été mise en œuvre. Cette technique tire parti de la sélectivité et de la sensibilité conférées par le marquage d’affinité d’un récepteur donné par son ligand avec la spécificité de l’immunoprécipitation. Nous avons utilisé AFLIP pour détecter le récepteur TGF-β de type III (TGFBR3), également connu sous le nom de bêtaglycane, au cours du développement précoce du poisson-zèbre. L’AFLIP a joué un rôle déterminant dans la validation de l’efficacité du phénotype d’un poisson-zèbre morphant TGFBR3. Dans un premier temps, des extraits de protéines embryonnaires sont préparés et utilisés pour générer ¹²⁵complexes I-TGF-β2-TGFBR3 qui sont purifiés par immunoprécipitation. Plus tard, ces complexes sont réticulés de manière covalente et révélés à l’aide de la séparation SDS-PAGE et de la détection par autoradiographie. Cette technique nécessite la disponibilité d’un ligand marqué et d’un anticorps spécifique contre le récepteur à détecter, et doit être facilement adaptée pour identifier tout facteur de croissance ou récepteur de cytokines qui répond à ces exigences.

Introduction

La détection spécifique des protéines exprimées au cours du développement embryonnaire est nécessaire pour valider les profils d’expression obtenus en mesurant leurs ARNm apparentés par RT-PCR ou hybridation in situ (ISH). Ceci est généralement réalisé par un western blot d’extraits d’embryons suivi d’une détection avec des anticorps spécifiques. Cependant, cette approche est difficile à appliquer aux protéines qui sont en très faible abondance, ou qui ont des propriétés qui entravent leur transfert quantitatif lors de leur transfert. Le bêtaglycane, également connu sous le nom de récepteur du facteur de croissance transformant β de type III (TGF-β) (TGFBR3), est un exemple de ces difficultés. TGFBR3 est un protéoglycane membranaire à temps partiel qui se lie au TGF-β par le biais de sa protéine^{centrale 1}, avec une affinité nettement plus élevée pour l’isoforme TGF-β2, une propriété qui le distingue de toute autre protéine^de liaison du TGF-β 2. Le TGFBR3 chez le poisson zèbre est exprimé à partir de 8 hpf, atteignant un maximum à 72 hpf, tel que détecté par RT-PCR de son ARNm³.

Cependant, malgré la disponibilité d’un anticorps³ très spécifique, toutes les tentatives de détection de son produit traduit par western blot se sont avérées infructueuses. Estimant que la nature protéoglycane de TGFBR3, ainsi que sa faible abondance présumée, peuvent être responsables de cet échec, une méthode de détection, AFLIP, qui tire parti de la haute affinité de TGFBR3 pour TGF-β2 a été conçue. Dans cette méthode, un extrait protéique d’embryons regroupés peut se lier spécifiquement à ¹²⁵TGF-β2 marqués I et les complexes récepteur-ligand sont purifiés par immunoprécipitation et réticulés avant d’être séparés par SDS-PAGE. Les schémas de migration observés par autoradiographie des gels ont révélé la présence et la nature des espèces réceptrices marquées. Cette approche combine la spécificité du ligand du marquage d’affinité avec l’immunoprécipitation par des anticorps spécifiques, augmentant la portée de détection, évitant le transfert inefficace de TGFBR3. En raison de ses propriétés inhérentes, le test AFLIP n’est pas un test quantitatif, mais peut être utilisé pour évaluer avec confiance les différences expérimentales relatives dans le récepteur analysé.

Protocole

Toutes les expériences réalisées chez l'animal ont été approuvés par le Comité de laboratoire soin et l'utilisation de l'Université nationale autonome du Mexique (UNAM) des animaux, sous le numéro CICUAL-Protocole: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").

1. Préparation de l'extrait Embryo Protein

1. Recueillir 100 - 200 embryons pour chaque condition de comparer (morphants vs type sauvage) au stade désiré, par exemple 72 heures après la fécondation (HPF).
2. La place des embryons dans des boîtes de Pétri contenant de l' eau de poissons (voir tableau 1) et dechorionate manuellement des embryons en utilisant une pince à pointe fine. Éviter d'utiliser pronase pendant cette étape (ou toute autre protéase tout au long du protocole), tel qu'il peut digérer le récepteur ciblé.
3. La place des embryons dans un tube de 1,5 ml et laver les embryons twla glace avec une solution tampon de phosphate de 1x (PBS) (voir tableau 1).
4. Ajouter 500 pi de tampon de deyolk (voir le tableau 1).
5. Relâchez la plupart de jaune par pipetage de haut en bas (environ 30 - 40 fois) les embryons dans la solution. Pour 72 HPF et 48 embryons HPF utiliser des embouts de pipette bleu et jaune, respectivement. peuvent devoir être légèrement coupé pour éviter la destruction d'embryons pointes jaunes. La libération de jaune réussie peut être vérifiée par l'observation des embryons au microscope.
6. Recueillir des embryons par centrifugation à 600 xg pendant 15 sec.
7. Rejeter le surnageant avec précaution à l'aide d'une pipette.
8. Embryons laver deux fois avec 500 pi de tampon de lavage (voir le tableau 1) faisant tourbillonner doucement à la vitesse la plus basse.
9. Recueillir des embryons par centrifugation à 600 xg pendant 15 sec.
10. A partir de là, poursuivre la procédure à 4 ° C.
11. Rejeter le surnageant avec précaution à l'aide d'une pipette.
12. Resuspendre les embryons dans 350 pi de tampon de lyse (voir le tableau 1) et homogénéiser à l' aide d' un pilon en plastique.
13. Incuber embryons lysées 30 min avec agitation sur une bascule de tube à essai à 4 ° C.
14. Centrifugeuse lysée embryons à 11.000 xg pendant 15 min pour éliminer les débris insolubles.
15. Transfert autorisé surnageant à l'aide d'une pipette dans un tube frais.
16. Déterminer la protéine totale par Bradford protéine test ^4, ou toute autre procédure appropriée. Si dosage de Bradford est utilisé, effectuer la courbe d'étalonnage en présence de concentrations équivalentes des détergents présents dans le tampon de lyse, car ils provoquent une sous - estimation de la protéine standard ^4.

2. Détection de Endogène Receptor Protein

1. Affinity Étiquetage et Immunoprécipitation (toutes ces étapes à 4 ^o C)
   1. Placez 400 - 500 ug de protéine embryonnaire totale dans un tube de 1,5 ml et diluer à 1 ug / ul avec un tampon 1 (voir le tableau 1).
      Remarque: Pour obtenir 500 ug de protéine d'embryon total, environ 100 - 200 embryons doivent être d'abord traitées. 72 HPF embryons produisent couramment ~ 5 pg de protéine totale d'embryons, ce qui est suffisant pour la détection bêtaglycan.
   2. Ajouter un volume suffisant de marqué TGF-β2 stocks pour atteindre une concentration finale de 150 pM et incuber avec agitation sur un tube à essai culbuteur 2 h à 4 ° C. Le TGF-β2 doit être marqué avant aflip est démarré, avec ^125I par la méthode à la chloramine T comme décrit par Cheifetz et al. , ^5.
      ATTENTION: L' utilisation de blindage pour minimiser l' exposition lors de la manipulation ¹²⁵ I ligand marqué.
   3. Ajouter un volume suffisant d'anticorps non dilué contre le récepteur d'intérêt afin de parvenir à une dilution de 1: 100 et continuer l'incubation pendant 2 heures à 4 ° C (incubation peut être O / N). Ceci est la dilution optimale de l' antisérum # 31, utilisé dans cette étude et décrit par ailleurs ^3, mais en fonction de la qualité de l'tibody, une dilution plus ou moins grande peut être optimal.
   4. Ajouter 50 ul de billes de liaison d'immunoglobuline appropriée (par exemple, la protéine G-Sepharose, qui a été préalablement équilibrée en TNTE et remis en suspension 1: 5 de son volume initial en TNTE) et incuber pendant 50 min avec agitation sur une bascule de tube à essai à 4 ° C.
   5. Récupérer les billes par microcentrifugation à 11.000 xg pendant 20 sec.
   6. Rejeter le surnageant dans une poubelle radioactive appropriée.
   7. Laver les IP-billes trois fois avec 1 ml de tampon de lavage IP (voir le tableau 1), par tourbillonnement et microcentrifugation à 11.000 xg pendant 20 secondes à chaque fois.
   8. Resuspendre IP-billes dans 250 pi de tampon de lavage IP.
   9. Ajouter 1,5 ul de subérate de disuccinimidyle (DSS, dissous dans du DMSO à 10 mg / ml). Préparer la solution DSS juste avant son utilisation dans cette étape.
   10. Incuber pendant 15 min à 4 ° C sous agitation.
   11. Pour arrêter la réaction de réticulation, ajouter 500 pi otampon de lavage f IP, complété avec suffisamment de Tris-Cl pH 7,4 actions pour atteindre 25 mM Tris-Cl. Les groupes amino libres dans Tris capturer DSS n'a pas réagi.
   12. Centrifugeuse à 11.000 xg pendant 20 secondes pour recueillir IP perles et éliminer le surnageant.
   13. Resuspendre IP billes dans 30 pl de tampon réducteur de Laemmli.
   14. échantillons Faire bouillir 5 min à 94 ° C.
   15. Le cas échéant, analyser les échantillons dans un compteur gamma en utilisant le protocole du fabricant.
2. Analyse des échantillons
   1. échantillons soumis à une dénaturation SDS-PAGE. Utilisez polyacrylamide le pourcentage correspondant à la masse du récepteur et exécuter un gel selon la procédure standard.
   2. Immergez gel dans la solution de fixation (voir le tableau 1) pendant 30 min à température ambiante.
   3. Laver le gel avec de l'eau distillée pendant 15 min.
   4. Placer le gel dans du papier filtre préalablement hydratée et couvrir avec un film de saran wrap.
   5. gel sec à 80 ° C pendant 1 heure.
   6. Exposer gel sur une phosphorimager scre blancfr à TA O / N.
   7. Numérisation écran exposé en utilisant un phosphorimager en utilisant le protocole du fabricant.

Résultats

La figure 1 montre un résultat représentatif obtenu avec aflip. Les signaux dans la piste 1 proviennent de la I-ligand ¹²⁵ lié de manière covalente soit à la protéine de poisson zèbre bêtaglycan noyau (core BG, au- dessous du marqueur 150 kDa) ou le noyau BG qui a été traité à sa forme de protéoglycanes par l' attachement des glycosaminoglycanes (GAG, frottis allant de 170 kDa à la partie supérieure du gel). Ce modèle de la migration, une protéine de base fort...

Discussion

L'utilisation de Western blots avec un anticorps spécifique contre une protéine d'intérêt est un outil précieux pour étudier son expression ⁷ au cours de l' embryogenèse. Cependant, immunotransfert de protéines hautement glycosylées n'a pas eu beaucoup de succès en raison de leur transfert inefficace et faible liaison à nitrocellulose ou PVDF membranes ^8,9.

Les protéoglycanes sont un bon exemple de cette lacune, en raison de leurs chaînes de glycosaminog...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sous-impôt de disuccinimidyle (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protéine G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel séchoir Modèle 583  ;	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Compteur gamma automatique	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
FDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix