Une nouvelle technique de détection des récepteurs endogènes de faible abondance présents dans les embryons de poisson-zèbre est décrite. Nous l’avons nommé AFLIP car il consiste en un marquage par affinité du récepteur par son ligand lié à l’immunoprécipitation.
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Article de méthode
Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons
Dans cet article
Résumé
Résumé
En combinant les puissances de l’abeling Affinity Let de la récipitation Immunop(AFLIP), une technique de détection des récepteurs de faible abondance dans les embryons de poisson-zèbre a été mise en œuvre. Cette technique tire parti de la sélectivité et de la sensibilité conférées par le marquage d’affinité d’un récepteur donné par son ligand avec la spécificité de l’immunoprécipitation. Nous avons utilisé AFLIP pour détecter le récepteur TGF-β de type III (TGFBR3), également connu sous le nom de bêtaglycane, au cours du développement précoce du poisson-zèbre. L’AFLIP a joué un rôle déterminant dans la validation de l’efficacité du phénotype d’un poisson-zèbre morphant TGFBR3. Dans un premier temps, des extraits de protéines embryonnaires sont préparés et utilisés pour générer 125complexes I-TGF-β2-TGFBR3 qui sont purifiés par immunoprécipitation. Plus tard, ces complexes sont réticulés de manière covalente et révélés à l’aide de la séparation SDS-PAGE et de la détection par autoradiographie. Cette technique nécessite la disponibilité d’un ligand marqué et d’un anticorps spécifique contre le récepteur à détecter, et doit être facilement adaptée pour identifier tout facteur de croissance ou récepteur de cytokines qui répond à ces exigences.
Introduction
La détection spécifique des protéines exprimées au cours du développement embryonnaire est nécessaire pour valider les profils d’expression obtenus en mesurant leurs ARNm apparentés par RT-PCR ou hybridation in situ (ISH). Ceci est généralement réalisé par un western blot d’extraits d’embryons suivi d’une détection avec des anticorps spécifiques. Cependant, cette approche est difficile à appliquer aux protéines qui sont en très faible abondance, ou qui ont des propriétés qui entravent leur transfert quantitatif lors de leur transfert. Le bêtaglycane, également connu sous le nom de récepteur du facteur de croissance transformant β de type III (TGF-β) (TGFBR3),....
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Protocole
Toutes les expériences réalisées chez l'animal ont été approuvés par le Comité de laboratoire soin et l'utilisation de l'Université nationale autonome du Mexique (UNAM) des animaux, sous le numéro CICUAL-Protocole: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").
1. Préparation de l'extrait Embryo Protein
- Recueillir 100 - 200 embryons pour chaque condition de comparer (morphants vs type sauvage) au stade désiré, par exemple 72 heures après la fécondation (HPF).
- La place des embry....
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Résultats
La figure 1 montre un résultat représentatif obtenu avec aflip. Les signaux dans la piste 1 proviennent de la I-ligand 125 lié de manière covalente soit à la protéine de poisson zèbre bêtaglycan noyau (core BG, au- dessous du marqueur 150 kDa) ou le noyau BG qui a été traité à sa forme de protéoglycanes par l' attachement des glycosaminoglycanes (GAG, frottis allant de 170 kDa à la partie supérieure du gel). Ce modèle de la migration, une protéine de base .......
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Discussion
L'utilisation de Western blots avec un anticorps spécifique contre une protéine d'intérêt est un outil précieux pour étudier son expression 7 au cours de l' embryogenèse. Cependant, immunotransfert de protéines hautement glycosylées n'a pas eu beaucoup de succès en raison de leur transfert inefficace et faible liaison à nitrocellulose ou PVDF membranes 8,9.
Les protéoglycanes sont un bon exemple de cette lacune, en raison de leurs chaînes de glycosaminog.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Gilberto Morales pour les soins et l’entretien des poissons, ainsi que les Drs Claudia Rivera et Hector Malagòn (IFC-UNAM Animal Facility) pour leur aide dans la vaccination des lapins. Ce travail a été soutenu par des subventions du CONACYT 131226 et du PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Sous-impôt de disuccinimidyle (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protéine G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel séchoir Modèle 583 ; | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Compteur gamma automatique | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| FDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
Références
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J.
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Réimpressions et autorisations
