Article de méthode

Préparation des échantillons MALDI homogènes pour les applications quantitatives

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DOI :

10.3791/54409

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28 octobre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology

Dans cet article

Résumé

Un protocole pour réduire les hétérogénéités spatiales des signaux d'ions en spectrométrie de masse MALDI en régulant la température du substrat au cours des processus de séchage de l'échantillon est démontrée.

Résumé

Ce protocole démontre une préparation d’échantillon simple pour réduire l’hétérogénéité spatiale des signaux ioniques lors de la spectrométrie de masse MALDI (désorption/ionisation laser assistée par matrice). L’hétérogénéité des signaux ioniques est un grave problème dans le MALDI, ce qui entraîne une faible reproductibilité des données et rend le MALDI inadapté à l’analyse quantitative. En régulant la température de la plaque d’échantillon pendant la préparation de l’échantillon, les écoulements hydrodynamiques induits thermiquement à l’intérieur des gouttelettes de solution d’échantillon sont capables de réduire le problème d’hétérogénéité. Une chambre de préparation d’échantillons à température ambiante équipée d’un bloc de base en cuivre à température régulée qui maintient les plaques d’échantillonnage MALDI facilite le contrôle précis des conditions de séchage de l’échantillon. Après le séchage des gouttelettes d’échantillon, la température des plaques d’échantillon est ramenée à température ambiante et retirée de la chambre pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse. Les zones des échantillons sont examinées avec la spectrométrie de masse à imagerie MALDI pour obtenir la distribution spatiale de tous les composants de l’échantillon. Par rapport à la méthode conventionnelle des gouttelettes séchées qui prépare des échantillons dans des conditions ambiantes sans contrôle de la température, les échantillons préparés avec la méthode décrite ici présentent une distribution spatiale et une intensité du signal nettement meilleures. Selon les observations effectuées à l’aide d’échantillons de glucides et de peptides, la diminution de la température du substrat tout en maintenant l’environnement à température ambiante pendant le processus de séchage peut réduire efficacement l’hétérogénéité des signaux ioniques. Cette méthode est généralement applicable à diverses combinaisons d’échantillons et de matrices.

Introduction

La spectrométrie de masse (MS) est l’une des techniques analytiques les plus importantes pour l’analyse des compositions moléculaires d’échantillons complexes. Parmi toutes les méthodes d’ionisation utilisées dans la MS, la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est la méthode la plus sensible et la plus largement utilisée dans les applications bioanalytiques. 1 Par rapport à d’autres techniques d’ionisation, MALDI présente la sensibilité la plus élevée et une tolérance élevée aux contaminants salins. Ces propriétés analytiques font de MALDI le premier choix pour l’analyse des glucides et de nombreuses applications protéomiques. Cependant, la préparation des échantillons est une étape cruciale pour obtenir des données de haute qualité dans MALDI-MS.

La méthode de préparation d’échantillon la plus couramment utilisée pour MALDI-MS est la méthode des gouttelettes séchées, dans laquelle les gouttelettes d’échantillon sont déposées sur une surface et séchées dans des conditions ambiantes. Cette méthode de séchage est simple et généralement efficace. 2-5 Cependant, un problème courant dans la méthode des gouttelettes séchées est que les cristaux d’analyte/matrice résultants se répartissent normalement de manière irrégulière. Dans de nombreux cas, les cristaux s’agrègent à la périphérie des zones d’échantillonnage, ce qui entraîne la formation de ce que l’on appelle des taches annulaires. 6-8 Les morphologies hétérogènes des cristaux affectent la distribution spatiale des molécules d’analyte, ce qui entraîne une forte fluctuation du signal ionique sur les zones d’échantillonnage. De telles fluctuations de signal sévères et une faible reproductibilité des données sont connues sous le nom de problème du « sweet spot » dans MALDI-MS. 9 Ainsi, il est grand besoin de réduire les hétérogénéités spatiales dans les applications de gouttelettes séchées MALDI-MS.

Les écoulements hydrodynamiques dans les gouttelettes d’échantillon jouent un rôle important dans la détermination de la distribution spatiale des échantillons préparés avec la méthode des gouttelettes séchées. 10-12 Il a été constaté que l’évaporation du solvant induit des flux capillaires vers l’extérieur à l’intérieur des gouttelettes, qui sont responsables de la formation de taches annulaires. 7,10 En revanche, les écoulements de recirculation induits par des gradients de tension superficielle tangentielle peuvent contrebalancer les écoulements capillaires vers l’extérieur. 13 Si les vitesses d’écoulement de recirculation sont supérieures à celles des flux capillaires sortants, les échantillons peuvent être redistribués efficacement pour réduire le problème d’hétérogénéité. 14

Dans ce travail, nous démontrons un protocole détaillé pour la préparation d’échantillons avec une simple chambre de séchage afin d’induire des flux de recirculation efficaces pendant les processus de séchage des gouttelettes. Les conditions de séchage des gouttelettes sont contrôlées avec précision, y compris les températures de la plaque d’échantillon et de son environnement, ainsi que l’humidité relative à l’intérieur de la chambre. Les analytes modèles comprennent la maltotriose et la chaîne de bradykinine (1-7). La matrice utilisée pour la démonstration est la 2,4,6-trihydroxyacétophénone (THAP). Les échantillons sont examinés à l’aide d’une spectrométrie MS à temps de vol (TOF), et les données sont analysées quantitativement pour montrer la réduction de l’hétérogénéité.

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Protocole

NOTE: Ce protocole est développé pour réduire l'hétérogénéité spatiale du fragment maltotriose et la bradykinine (1-7) préparé avec la méthode sèche-gouttelettes. Le protocole consiste en trois étapes principales, y compris la préparation et le préconditionnement, le dépôt de l'échantillon et le séchage, et la masse analyse des données de spectrométrie. Les procédures sont décrites et sont décrits plus en détail ci-dessous:

1. Préparation et préconditionnement

  1. Nettoyage de la plaque échantillon
    1. Porter des gants en nitrile et de la main-laver la plaque d'échantillon doucement avec du détergent et désionisée eau distillée (DDW).
    2. Rincer la plaque échantillon avec du méthanol (MeOH) et DDW.
    3. Insérez la plaque d'échantillon dans un bécher de 600 ml et remplir avec DDW.
    4. Soniquer la plaque d'échantillon dans DDW pendant 15 min dans un bain à ultrasons (200 W, 40 kHz).
    5. Retirer DDW du bêcher et remplir le bécher avec MeOH.
    6. Soniquer la plaque d'échantillon dans du MeOH pendant 15 min dans un bain à ultrasons (200 W, 40 kHz).
    7. Souffler les gouttes de solvant sur la plaque avec de l'azote gazeux et de garder la plaque d'échantillon sec avant le dépôt de l'échantillon.
  2. Réglementer Chambre de séchage Température
    NOTE:. La chambre de séchage est un 35 x 20 x 45 cm 3 (L x P x H) chambre acrylique La figure 1 montre l'image de ce système de séchage. La chambre est purgée avec de l'azote gazeux à température ambiante par l'intermédiaire d'un débitmètre de gaz à un débit constant pour maintenir une condition de faible humidité relative contrôlée par un hygromètre calibré installé à l'intérieur de la chambre de séchage. Un bloc à base de cuivre dans la chambre de séchage équipée d'un circulateur d'eau à température constante programmée est utilisée pour recevoir des plaques d'échantillons en acier inoxydable. Le bloc de base de cuivre est capable de réguler la température de la plaque échantillon 5-25 ° C. Les températures de l'air, le bloc de base de cuivre, et la plaque d'échantillon sont surveillées par des thermocouples de type K.
    1. Ouvrez la porte et mettre rapidement la plaque d'échantillon sur le cuivrebloc de base puis fermez la porte.
    2. ajuster manuellement le débitmètre de gaz pour régler le débit d'azote de 10 pieds cubes standard par heure (SCFH).
    3. Surveiller l'humidité relative dans la chambre de séchage par l'hygromètre et un réglage fin du débitmètre de gaz pour assurer l'humidité relative est toujours inférieure à 25%.
    4. Surveiller la température de la plaque d'échantillons par des thermocouples de type K et régler la température de circulation d'eau manuellement jusqu'à ce que la plaque d'échantillon atteint 5 ° C pendant une expérimentation ou la température ambiante (25 ° C) pour le contrôle.
      Remarque: Afin de stabiliser la plaque d'échantillon à une température conçue, la température de circulation d'eau est généralement réglé entre 0 et 5 ° C inférieure à celle de l'échantillon prévu. Par exemple, pour maintenir 5 ° C à la plaque d'échantillons, le réglage de la température de la circulation d'eau est dans la plage de 0 à 2 ° C; pour maintenir la plaque d'échantillon à 25 ° C, la température de consigne du thermostat d'eau est comprise dans l'intervalle de 23 à 25 ° C.
    5. Vérifiez que les températures requises et l'humidité relative sont atteints (tableau 1) avant le dépôt de l' échantillon.
      Remarque: Tous les paramètres, ainsi que leurs valeurs de réglage pour les procédés de séchage à différentes températures de la plaque d'échantillon sont indiqués dans le tableau 1.
      REMARQUE: à une faible température de plaque d'échantillons, la condensation de l'eau sur la plaque d'échantillon peut se produire si la porte de la chambre est ouverte pendant une longue période. Si la condensation de l' eau se produit, fermez la porte et NE PAS déposer un échantillon sur elle jusqu'à ce que la condensation de l' eau est séché.
  3. Préparation de la matrice et Analyte Solutions
    1. Préparation des solutions de matrice
      1. Préparer une solution 0,1 M THAP avec 50% d'acétonitrile (ACN): 50% de solution aqueuse DDW.
    2. Préparation des analytes
      1. Préparer 10 -4 M solution maltotriose avec DDW.
      2. Préparer 10 -5 M fragment de la bradykinine (1-7) dans une solution à 50% d' acétonitrile(ACN): 50% de solution aqueuse DDW.

2. Le dépôt de l'échantillon et de séchage

  1. Prémélange 0,25 ul de solution THAP 0,1 M et 0,25 pi de 10 -4 M ou maltotriose 10 -5 M fragment de la bradykinine (1-7) des solutions dans un microtube.
  2. Vortex la solution mélangée pendant 3 sec.
  3. Centrifuger la solution mélangée pendant 2 secondes (2000 x g) pour recueillir la solution au fond du tube de centrifugation.
  4. Ouvrez la porte de la chambre de séchage, soigneusement déposer 0,1 ul de la solution sur la plaque d'échantillon à la pipette et fermer la porte immédiatement.
  5. Attendez que l'échantillon gouttelette de sécher.
    . NOTE: Les temps de séchage habituellement observées avec des températures différentes de la plaque d'échantillon sont énumérés dans le tableau 1 pour la température de la plaque d'échantillon de 5 ° C, le temps de séchage moyen est de 800 à 1.000 sec; pour la température de la plaque d'échantillon de 25 ° C, le temps de séchage moyenne est de 100 à 150 sec.
  6. Après séchage, ouvrir la porte de la chambre de séchage.
  7. Régler la température de circulation d'eau à température ambiante (25 ° C).
    REMARQUE: Passer cette étape si la plaque d'échantillon est maintenu en permanence à la température ambiante (25 ° C) pendant le processus de séchage.
  8. Après les échantillons de température de la plaque revient à la température ambiante (25 ° C), retirer la plaque d'échantillon de la chambre de séchage.
  9. Examiner l'échantillon morphologie sous un stéréomicroscope 5X et prendre une image instantanée champ lumineux.
    NOTE: Si les morphologies de cristal ne sont pas comme prévu, il est nécessaire de préparer un nouvel échantillon à la même procédure. Morphologies cristallines typiques sont présentés dans les panneaux supérieurs de la figure 2.
    REMARQUE: Dans les cas où la température basse de la plaque d'échantillons, tels que 5 ° C, il est important de chauffer la plaque à la température ambiante avant de le sortir de la chambre de séchage de l'échantillon. Lors du dépôt des échantillons, NE PAS garder le solutio prémélangéen dans la pointe de la pipette en 10 sec. NE PAS utiliser à nouveau la solution prémélangée après le dépôt des échantillons. Les panneaux supérieurs de la figure 2 montrent des images lumineuses champ d'échantillons préparés avec des températures différentes de la plaque d'échantillon.

3. Analyse des données de spectrométrie de masse

  1. Spectrométrie de masse d'acquisition de données
    NOTE: Après la préparation, l'échantillon peut être analysé par spectrométrie de masse d'imagerie. Dans l'étude actuelle, les imagerie expériences MS sont réalisées à l' aide d' un synchronisé TOF double polarité de laboratoire intégré (DP-TOF) spectromètre de masse d'imagerie. 15 Commercial MALDI-TOF spectromètres de masse avec capacité d'imagerie sont également appropriés pour de telles expériences. Le spectromètre de masse est utilisé dans l'extraction linéaire et modes d'ions positifs avec des retards d'extraction optimisés. L'énergie cinétique des ions est de 20 kV. La taille du faisceau laser est de 35 um de diamètre sur la surface de l'échantillon, et le spectre de chaque endroit est le average de 5 tirs laser.
    1. Insérez la plaque d'échantillon dans le spectromètre de masse MALDI.
    2. Effectuer l'imagerie de masse analyse par spectrométrie à l'échantillon préparé dans les étapes 2.1-2.9.
    3. Sélectionnez un pic de masse caractéristique de la liste de masse affichée dans la fenêtre de résultat et cliquez sur "2D" pour tracer une image d'ions à deux dimensions.
      NOTE: Pour maltotriose mélangé avec THAP, les pics caractéristiques sont sodiated maltotriose, THAP protonée et sodiated THAP. Pour fragment de bradykinine (1-7) mélangé avec THAP, les pics caractéristiques comprennent protonés fragment de bradykinine (1-7), protonée THAP et sodiated THAP.
    4. Cliquez sur les boutons de réglage dans la fenêtre pour déterminer les limites supérieure et inférieure de l'intensité du signal et cliquez sur "enregistrer une image". Ce paramètre définit le contraste des images d'ions.
      NOTE: Dans chaque jeu individuel des données, les zones fissurées et les taches nulles montrant faible luminosité sont éliminés.
    5. Observer et comparer l'ionimage avec l'image lumineuse de champ qui a été prise à l'étape 2.9.
      NOTE: L'imagerie par spectrométrie de masse et la construction d'images d'ions particuliers peut être réalisé avec des instruments commerciaux. En raison de la variété de l'acquisition de données et de logiciels d'analyse, les utilisateurs doivent suivre les instructions logicielles fournies par le vendeur de l'appareil pour obtenir des images de haute qualité.
  2. L'analyse des données
    NOTE: L'hétérogénéité des échantillons est analysé quantitativement. Dans cette démonstration, chaque échantillon est divisé en plusieurs zones concentriques par des logiciels développés en interne pour analyser la distribution spatiale des ions. L'analyse peut également être effectuée en utilisant un logiciel d'analyse de données autonome.
    1. Cliquez sur les points nuls et les zones fissurées dans l'image ionique indiqué dans la fenêtre de résultat pour éliminer les zones sans importance.
      NOTE: Cette procédure définit la zone essentielle image ionique.
    2. Cliquez sur "trouver bord" bouton pour trouver la couche outmost de l'image d'ions.
    3. Cliquez sur "déduire" pour enregistrer les informations de l'abondance d'ions de la couche outmost dans une base de données et enlever cette couche de l'image d'ions simultanément. Une case à cocher représentant cette couche outmost apparaîtra dans la liste des "données de sortie" de la fenêtre de résultat.
    4. Répéter les étapes 3.2.2 et 3.2.3 jusqu'à ce que le centre de l'image d'ions est définie.
    5. Cliquez sur et sélectionnez toutes les cases à cocher dans la liste des "données de sortie" et cliquez sur "export" pour exporter les données.
    6. Ouvrez les données exportées en utilisant le logiciel de feuille de calcul pour calculer l'abondance d'ions moyenne de chaque couche pour obtenir les informations de distribution spatiale des ions.

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Résultats

Les images champ clair, ainsi que les images du fragment maltotriose et la bradykinine (1-7) préparé avec la température de la plaque d'échantillon de 5 et 25 ° C MS sont représentés sur la figure 1. Dans le cas du maltotriose sodiated, le signal d'ions principalement Remplit à la périphérie de la zone d'échantillon lorsqu'il est préparé avec une température de la plaque d'échantillon de 25 ° C. En diminuant la température de la plaque d'échantill...

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Discussion

Sur la base des prédictions théoriques précédentes, les flux hydrodynamiques induites par la température à l'intérieur des gouttelettes peuvent surmonter l'extérieur des flux capillaires induits par évaporation du solvant. L'efficacité d'une telle recirculation interne des molécules est accrue lorsque la température des gradients dans une augmentation des gouttelettes. D'après les résultats prévus, en maintenant la température de la plaque d'échantillon à 5 ° C tout en maintenant son environnemen...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail est soutenu par le Centre de recherche en génomique, l’Academia Sinica et le Ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan, République de Chine (Contrat n° 104-2119-M-001-014).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
fort
Détergent en poudreAlconox242985
MéthanolMerck106009
AcétonitrileMerck100003
2,4,6-trihydroxyacétophénone (THAP)Sigma-AldrichT64602  ;
Fragment de bradykinine (1-7)Sigma-AldrichB1651
MaltotrioseSigma-Aldrich47884
Pointes de pipetteMettler Toledo17005091
Tube de microcentrifugationAxygenMCT-150-C
Equipment
Purification de l’eau Milli-Q systèmeMilliporeZMQS6VFT1
Gants en nitrile non poudrésMicroflexSU-690
600 ml bécherDuran2110648
Nettoyeur à ultrasonsDeltaDC300H
HygromètreWisewind5330
Débitmètre d’azotegazeux DwyerRMA-6-SSV
K-type thermocouplesDigitron311-1670
CentrifugeuseSelect BioProductsForce Mini  ;
PipetteRaininpipet-lite XLS
StéréomicroscopeOlympusSZX16
Chambre de séchage à température contrôlablece laboratoire
Spectromètre de masse à imagerie à temps de vol synchronisé à double polarité (DP-TOF IMS) ce laboratoire
Cible d’échantillon en acier inoxydable MALDI-TOFce laboratoire

Références

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Mots-clés

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