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Article de méthode

Le développement d'un anticorps salivaire Multiplex Immunoassay mesurer l'exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux

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DOI :

10.3791/54415

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12 septembre 2016

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1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati

Dans cet article

Résumé

Dans le climat actuel de rareté des ressources, de nouvelles technologies émergent qui permettent aux chercheurs de mener des études moins coûteuses, plus rapides et avec plus de précision. Nous décrivons ici le développement d’un dosage immunologique multiplex d’anticorps salivaires à base de billes pour mesurer l’exposition humaine à plusieurs agents pathogènes environnementaux simultanément.

Résumé

L'étiologie et les impacts de l'exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux sont une préoccupation majeure dans le monde entier et, par conséquent, la capacité d'évaluer des approches à haut débit rentables d'exposition et les infections à l'aide serait indispensable. Ce mémoire décrit le développement et l'analyse d'un essai immunologique à base de billes multiplexe capable de mesurer la présence d'anticorps dans la salive humaine à des agents pathogènes multiples simultanément. Saliva est particulièrement intéressante dans cette application car elle est non invasive, moins cher et plus facile à recueillir que du sérum. Des antigènes provenant d'agents pathogènes environnementaux ont été couplés à des microsphères carboxylées (billes) et sont utilisés pour mesurer les anticorps dans de très petits volumes d'échantillons de salive humaine en utilisant un dosage en phase de solution à base de billes. Les billes ont été couplés à des antigènes provenant de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G et G I.1 II.4) et le virus de l' hépatite A. Faire en sorte que les antigènes sont suffisamment couplés àles billes, le couplage a été confirmée en utilisant des espèces, des anticorps de capture primaires dérivés d'animaux, suivie par une incubation avec biotinylés anti-espèce des anticorps de détection secondaires et de la streptavidine-R-phycoérythrine rapporteur (SAPE). En tant que contrôle pour mesurer la liaison non spécifique, un jeu de billes a été traité de manière identique aux autres, sauf qu'il n'a pas été couplé à un antigène. Les billes d'antigène couplé et de contrôle ont ensuite été incubées avec des échantillons prospectivement recueillies salive humaine, mesurée sur un analyseur à haut débit basé sur les principes de la cytométrie de flux, et la présence d'anticorps dirigés contre l'antigène a été mesurée dans médiane de fluorescence unités d'intensité (MFI) . Ce dosage immunologique multiplex a un certain nombre d'avantages, y compris davantage de données avec moins de l'échantillon; les coûts et la main-d'œuvre réduits; et la possibilité de personnaliser le test à plusieurs cibles d'intérêt. Les résultats indiquent que le dosage immunologique multiplex salivaire peut être capable d'identifier les expositions et les infections antérieures, qui peut être especially utile dans les études de surveillance impliquant de grandes populations humaines.

Introduction

Quatre-vingt-huit pour cent des maladies liées à la diarrhée dans le monde entier est associé à l' exposition humaine à l' eau contaminée, des aliments dangereux et un mauvais assainissement / hygiène, causant environ 1,5 millions de décès, dont la majorité sont des enfants 1. Ceci est une cause majeure de préoccupation pour les responsables de la santé publique et les décideurs politiques. Dans un effort pour enquêter sur les expositions et les maladies associées à l' origine hydrique et d' autres agents pathogènes environnementaux, nous avons développé un dosage immunologique multiplex pour mesurer les anticorps dans les échantillons humains 2-4. Cette méthode peut être appliquée à des études épidémiologiques pour déterminer l'exposition humaine à ces agents pathogènes et de mieux définir les infections de immunoprevalence et incidents.

Saliva est très prometteur comme alternative au sérum pour la recherche de biomarqueurs humains. Parmi les avantages de l' utilisation de la salive sont les non-invasivité et la facilité de prélèvement d'échantillons, à faible coût, et les échantillons peuvent être facilement recueillies auprès des enfants 5-7 </ Sup>. Des échantillons de sérum et de salive ont été largement étudiés pour les anticorps contre H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonie 12, hépatite virus A et C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, le virus de la dengue 16, le virus de l' immunodéficience humaine (VIH) 17 et Escherichia coli O157: H7 18.

Un dosage immunologique multiplex permet l'analyse de plusieurs analytes simultanément dans un volume d'échantillon unique et dans un seul cycle ou courir. Antigènes multiplexés de C. jejuni, T. gondii, H. pylori, l' hépatite A virus, et deux norovirus ont été utilisés pour mesurer la salive humaine IgG et IgA 2-4 3,4 et plasma IgG 2,3 réponses d'anticorps à ces agents pathogènes en utilisant unà base de billes de dosage immunologique multiplexage. Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec des études épidémiologiques de l'exposition aux microbes dans l'eau, le sol et la nourriture, le type de dosage décrit dans cette étude peut fournir des informations précieuses pour améliorer la compréhension des infections causées par des pathogènes environnementaux. En outre, les données d' anticorps salivaires obtenues à partir de ces études peuvent être utilisées pour améliorer les modèles d'évaluation des risques 19-22.

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Protocole

L'approbation a été obtenue à partir de l'Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) pour la collecte des échantillons de salive créviculaire stimulés de baigneurs à Boquerón Beach, Puerto Rico, dans le cadre des États-Unis Environmental protection Agency (EPA) nationale épidémiologique et évaluation environnementale des loisirs (NEEAR) étude sur l' eau 23 pour évaluer les expositions et les maladies de natation associée. Les sujets ont donné leur consentement éclairé et ont été informés sur l'utilisation du dispositif de collecte de salive par des entrepreneurs USEPA formés. Les échantillons de salive ont été expédiés sur de la glace et, à la réception, ils ont été centrifugés et conservés à -80 ° C comme décrit 4.

1. Bead Activation

  1. Remettre en suspension les stocks de billes par vortex et sonication pendant 20 s et le transfert d' environ 5,0 x 10 6 des perles de stock (400 pi) à des tubes de microcentrifugation.
    Remarque: Til billes sont fournies à une concentration de 12,5 x 10 6 billes / ml.
  2. Sédimenter les billes de licence par centrifugation à 10 000 x g pendant 2 min.
  3. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes sous forme de granulés dans 100 ul d' eau distillée (dH 2 O) par vortex et sonication pendant 20 secondes. Répétez l'étape 1.2.
  4. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes lavées dans 80 ul d'mM de phosphate de sodium monobasique 100, pH 6,2 par vortex et sonication pendant 20 secondes.
  5. Immédiatement avant utilisation, faire un 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) solution en ajoutant 200 pi de dH 2 O à 10 mg Sulfo-NHS aliquote. Mélanger par vortex.
  6. Ajouter 10 ul de 50 mg / ml Sulfo-NHS à billes. Mélanger par vortex.
  7. Immédiatement avant utilisation, faire un / ml 1-éthyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimide 50 mg (EDC) de la solution par addition de 200 pi d' eau distillée (dH 2 O) à 10 mg EDC aliquote. Mélanger par vortex.
  8. Ajouter 10 ul de 50mg / ml solution EDC aux billes. Mélanger par vortex. Incuber les billes pendant 20 minutes à la température ambiante, dans l'obscurité, avec un mélange par tourbillon à des intervalles de 10 min. Pellet les billes activées par microcentrifugation à 10 000 g pendant 2 min.
  9. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes dans 250 pl d'mM d' acide 2- [N - morpholino] éthanesulfonique acide 50 (MES), pH 5,0 par vortex et sonication pendant 20 secondes.
  10. Pellet les billes activées par microcentrifugation à 10 000 g pendant 2 min.
  11. Répétez les étapes 1.9 et 1.10.
    Note: Ceci permet d'obtenir un total de deux lavages avec du MES 50 mM, pH 5,0.
  12. Remettre en suspension les billes dans 100 pl d'mM de MES, pH 5,0 50 par vortex et sonication pendant 20 secondes.

2. Perle Couplage

  1. Coupler les antigènes vers les ensembles de billes en utilisant les concentrations indiquées dans le tableau 1.
  2. Ajouter chaque antigène aux billes activées et amener le volume total à 500 ul dans du MES 50 mM, pH 5,0. Mélanger les antigènes d'perles d par vortex.
  3. Incuber les antigènes et les billes pendant 2 h avec un mélange par rotation (~ 15 min) à la température ambiante dans l'obscurité. Sédimenter les billes couplées par microcentrifugation à 10 000 x g pendant 2 min.
  4. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes dans 500 pl de tampon phosphate salin (PBS), l'albumine de sérum -bovine (BSA), le monolaurate -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) -sodium azoture (PBS-TBN), pH 7,4 par vortex et sonication. Pellet les billes par microcentrifugation à 10 000 xg pendant 2 minutes et retirer le surnageant.
    Attention: L'azoture de sodium est un produit chimique extrêmement toxique. Il est mortel en cas d'ingestion ou prend contact avec la peau. Ne pas respirer les poussières / fumées / gaz / brouillards / vapeurs ou aérosols. Porter un équipement de protection individuelle approprié (EPP) lors de la manipulation et de l'éliminer conformément aux lois appropriées.
  5. Resuspendre les billes dans 1 ml de PBS-TBN par vortex et sonication pendant 20 secondes.
  6. Sédimenter les billes par microcentrifugation à 10 000 x g pendant 2 min.
  7. Répétez les étapes 2.5 et 2.6.
    Note: Ceci permet d'obtenir un total de deux lavages avec du PBS-TBN.
  8. Remettre en suspension les billes couplées et lavées dans 1 ml de PBS, 1% de BSA, 0,05% d'azoture, pH 7,4. Stocker les billes couplées dans un réfrigérateur C 2-8 ° dans l'obscurité.

3. Count Bead

  1. Préparer une dilution 1:10 des billes couplées à de l'eau ou du tampon PBS.
  2. Charge 10 pi de la dilution de talon sur un hémocytomètre au point d'introduction d'échantillon.
  3. Comptez les perles vu dans l'une des grilles 4 x 4 de coin. Calculer le nombre total de billes couplées à l' aide de la formule suivante: Décompte (1 coin de la grille 4 x 4) x (1 x 10 4) x (facteur de dilution) x resuspension volume en millilitres.

4. Confirmation de l'antigène de couplage

  1. Remettre en suspension le mélange des stocks de billes couplées à des antigènes d'intérêt par vortex et sonication pendant 20 sec.
  2. Préparer un mélange de travail de perles en diluant les stocks de billes couplées à une finaleconcentration de 100 perles / ul de chaque perle unique situé dans PBS-1% de tampon BSA (PBS-BSA 1%, pH 7,4).
  3. Préparer au moins 7 à deux dilutions d'anti-espèces anticorps primaire IgG selon les recommandations du fabricant en plaque de 96 puits à fond rond avec du tampon PBS-BSA 1%.
  4. Pré-humidifier une colonne de 8 puits séparés (8 rangées) d'un filtre plaque de fond de 96 puits pour chaque test de confirmation de couplage de l'antigène avec 100 pi de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Ajouter 50 pi de mélange de perles de travail (billes d'antigène couplé) aux puits pré-mouillées.
  5. Ajouter 50 ul de dilutions d' anticorps à des lignes 1-7 de chaque colonne de la plaque filtrante à 96 puits et 50 ul de tampon PBS-BSA 1% à la ligne 8 à la place d'anticorps dilué à servir de puits de fond. Mélanger avec une pipette multi-canaux par pipetage de haut en bas 5 fois. Effectuez la même procédure pour chaque perle ensemble de l'antigène couplé à confirmer.
  6. Couvrir et laisser incuber dans l'obscurité à la température ambianterature pendant 1 h sur un agitateur de microplaque à 500 tours par minute. Retirer le surnageant par le vide.
  7. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répéter 1x. Remettre en suspension les billes dans 50 pl de PBS-BSA à 1% avec un pipetteur multi-canal.
  8. Diluer anti-espèce anticorps de détection biotinylé secondaire IgG spécifique à 16 pg / ml dans du PBS-BSA à 1%.
  9. Ajouter 50 pi d'anticorps secondaire dilué dans chaque puits par pipetage de haut en bas 5 fois.
  10. Recouvrir la plaque filtrante et laisser incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur de plaque. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x.
  11. Remettre en suspension les billes dans 50 pl de PBS-BSA à 1% avec un pipetteur multi-canal.
  12. Diluer la streptavidine-R-phycoérythrine rapporteur (SAPE) à 24 pg / ml dans du PBS-BSA à 1%.
  13. Ajouter 50 ul de reporter à chaque puits et mélanger par pipetage de haut en bas 5 fois.
  14. Cau-dessus de la plaque filtrante et laisser incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur de plaque. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x.
  15. Resuspendre les billes dans 100 pl de PBS-BSA à 1% et à analyser 50 ul en utilisant l'analyseur 29.
    Note: Les résultats de l'analyse immunologique multiplex à base de perles sont mesurées en intensité de fluorescence médiane (MFI). Toujours se référer à la dernière version du manuel du logiciel, si disponible pour éviter les erreurs.

5. salivaire Multiplex Immunoassay

  1. Retirer la salive du congélateur à -80 ° C et laisser décongeler à température ambiante.
  2. un antigène couplé resuspendre les stocks de billes par vortex et sonication pendant 20 secondes.
  3. Préparer un mélange de perles de travail en diluant les stocks de perles couplées à une concentration finale de 100 perles / ul de chaque jeu de billes unique dans un tampon PBS-1% BSA.
  4. Préparer une dilution 1: 4 en poids de la saliveith PBS-1% de tampon de BSA dans un 96 puits, plaque de puits profonds.
  5. plaque de filtre pré-humide avec 100 pi de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide.
  6. Ajouter 50 ul d'un mélange de perles de travail et un volume égal de la salive diluée à 95 puits des plaques à 96 puits de filtre pour un rapport 1: 8 dilution finale. Mélanger les réactions avec un pipetteur multi-canal. Pour une commande bien, ajouter 50 perles d'antigène couplé ul plus 50 pi de tampon PBS-BSA à 1% (en remplacement de la salive).
  7. Couvrir et laisser incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur de microplaque à 500 tours par minute. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x.
  8. Resuspendre les billes dans 50 pl de PBS-BSA à 1% avec un pipetteur multi-canal.
  9. Diluer l'IgG anti-humain de l'anticorps de détection secondaire biotinylé de chèvre à 16 pg / ml dans du PBS-BSA à 1%.
  10. Ajouter 50 ul dilué anticorps secondaire à chaque puits et mélanger le contenu avecun pipetteur multi-canal.
  11. Recouvrir la plaque filtrante et laisser incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur de plaque. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x.
  12. Resuspendre les billes dans 50 pl de PBS-BSA à 1% avec un pipetteur multi-canal.
  13. Diluer la streptavidine-R-phycoérythrine rapporteur (SAPE) à 24 pg / ml dans du PBS-BSA à 1%.
  14. Ajouter 50 ul reporter à chaque puits et mélanger avec une pipette multi-canaux.
  15. Recouvrir la plaque filtrante et laisser incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur de plaque. Retirer le surnageant par le vide. Laver les puits avec 100 ul de tampon de lavage et retirer le surnageant par le vide. Répétez lavage 1x.
  16. Resuspendre les billes dans 100 pl de PBS-BSA à 1% et à analyser 50 ul en utilisant l'analyseur 29.
    Note: Les résultats de l'analyse immunologique multiplex sont mesurées en Median Fluorescence Intensity (MFI) unités. Toujours se référer àla dernière version du manuel du logiciel, si disponible pour éviter les erreurs.

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Résultats

Un jeu de billes unique a été utilisé comme témoin pour mesurer la liaison non spécifique et de l'échantillon à la variabilité de l'échantillon. Ces billes ont été traitées de manière identique à l'antigène billes couplées à l'exception qu'ils ne sont pas mises en incubation avec un antigène dans l'étape de couplage. Les valeurs MFI> 500 obtenues à partir des billes témoins incubées avec les échantillons de salive ont été prélevés à partir d'autres analyses...

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Discussion

Ces résultats indiquent que la méthode d'immuno-essai multiplex est utile pour établir une discrimination entre des échantillons de salive qui sont immunopositif ou immunonegative. Pour déterminer immunopositivité, un seul point de coupure a été développé par le calcul de la moyenne plus trois écarts-types des journaux transformé IMF réponses des perles découplées de contrôle testés avec tous les échantillons de salive. Le point de coupure a donné la capacité d'évaluer l'exposition et immunoprevalence soit à...

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Déclarations de divulgation

L'Agence américaine pour la protection de l'environnement par le biais de son Bureau de recherche et de développement financé et géré la recherche décrite ici. Il a été soumis à l'examen administratif de l'Agence et approuvé pour publication. La mention d'appellations commerciales ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation pour l'utilisation.

Remerciements

Clarissa Curioso a été soutenue par une nomination au programme de participation à la recherche de l’Agence de protection de l’environnement des États-Unis, administré par l’Institut Oak Ridge pour la science et l’éducation dans le cadre d’un accord interagences entre le département de l’Énergie des États-Unis et l’EPA des États-Unis.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Equipment and Software
MicrocentrifugeuseThermo Electron Corporation75002446Utilisé pour centrifuger des échantillons
Vortex MixerVWRG560Utilisé pour mélanger des échantillons
Sonicator (mini)Fisher Scientific15-337-22Utilisé pour séparer les perles
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. CappDivers
Hémacytomètre (Bright Line)Housser Scientific  ;3200Utilisé pour compter les billes couplées
Collecteur à vide multi-écransMilliporeMSVMHTS00Utilisé dans les étapes de lavage pour éliminer le surnageant
MicroShakerVWR12620-926Utilisé pour agiter les billes pendant les incubations
Rack de tubes (1,5 ml et 0,5 ml) (assortis)VWR30128-346
BalanceMettleuse ou autreUtilisé pour mesurer les réactifs de lavage pour la fabrication de tampons
Dynabead Sample MixerInvitrogen947-01Utilisé lors de l’étape d’incubation de couplage
MatLab (R2014b)The MathWorks, Inc.Utilisé pour analyser les données de réponse des anticorps
Microsoft Excel 2014Microsoft CorporationUtilisé pour analyser les données de réponse des anticorps
Analyseur Luminex avec le logiciel xPonent 3.1Luminex CorporationLX200-XPON3.1Instrument et logiciel utilisés pour exécuter des tests
GI.1
Virus de Norwalk : p-particuleXi Jiang (CCHMC)*NA*Hôpital pour enfants de Cincinnati. Conc. final 5 µ ;g.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particuleXi Jiang (CCHMC)*NA*Hôpital pour enfants de Cincinnati. Conc. final 5 µ ;g.
Virus de l’hépatite A : concentré de grade II issu de la culture cellulaireMeridian Life Sciences8505Antigène couplé à 100 & micro ; g
Helicobacter pylori : lysatMeridian Life SciencesR14101Antigène couplé à 25 µ ; g
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1)Meridian Life SciencesR18426Antigène couplé à 25 & micro ; g
Campylobacter jejuni : antigène KPL50-92-93couplé à 50 µ ; g
Anticorps primaires
anti-norovirus de cobaye(CCHMC)*NAUtilisé pour la confirmation du couplage
Souris anti-hépatite A IgGMeridian Life SciencesC65885MUtilisé pour la confirmation du couplage
Souris anti-hépatite A IgGMeridian Life SciencesC65885MUtilisé pour la confirmation du couplage
BacTraceAffinity Anticorps purifié contre Helicobacter pyloriKPL01-93-94Utilisé pour la confirmation du couplage
du pAb de chèvre avec Toxoplasma gondiiAbcamAb23507Utilisé pour la confirmation du couplage
BacTrace Chèvre anti-Campylobacter espèceKPL01-92-93Utilisé pour la confirmation
du couplagesecondaire » Anticorps
Biotine-SP-Conjugués AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)Jackson705-065-149Utilisé pour la confirmation du couplage
IgG anti-chèvre de lapin biotinylé (H+L)KPL16-13-06Utilisé pour la confirmation du couplage
IgG anti-souris de chèvre biotinylée (H+L)KPL16-18-06Utilisé pour la confirmation
du couplageAffinity Anticorps purifié Biotine Étiqueté Chèvre anti-Lapin IgG (H+L)KPL176-1506Utilisé pour la confirmation de couplage
Consommables
1,5 ml Tubes à microcentrifuger en copolymèreUSA Scientific1415-2500Utilisé comme tubes à centrifuger à faible liaison
10 µ ; l recharges d’embouts de pipetteBioVentures5030050C
200 µ ; l recharges d’embout de pipetteBioVentures5030080C
1 000 & micro ; l recharges d’embout de pipetteBioVentures5130140C
Feuille d’aluminiumDivers fournisseursUtilisé pour garder les billes dans l’obscurité pendant les incubations
Plaques Deep WellVWR40002-009Utilisé pour diluer des échantillons de salive
Plaques filtrantes multi-écransMilliporeMABVN1250Utilisé pour effectuer des tests
Système de collecte de salive OracolMalvern Medical Développé LimitedUtilisé pour la collecte de salive
< forts>réactifs
Microsphères carboxylées (billes)Luminex CorporationEn fonction de l’ensemble de billesLes antigènes sont couplés aux microsphères
EDC (chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide)Pierce77149 ou 22980Utilisé dans l’activation
des billesSulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Pierce24510Utilisé dans l’activation des billes
Steptavidin-R-phycoerythrine (1 mg/ml)Sondes moléculairesS-866Utilisé comme rapporteur
MES (2-[N-Morpholino]acide éthanesulfonique)SigmaM-2933Utilisé pour le couplage
Tween-20 (monolaurate de polyoxyéthylènesorbitan)SigmaP-9416Utilisé dans le tampon de lavage pour éliminer les tampons de liaison
protéiques non spécifiques
PBS-TBN (PBS, 0,1 % BSA, 0,02 % Tween-20, 0,05 % Azide, pH 7,4)** ; C
PBS, pH 7,4SigmaP-3813138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
BSASigmaA-78880,1 % (p/v)
Tween-20SigmaP-94160,2 % (v/v)
Azoture de sodium (0,05 % d’azoture)**SigmaS-8032**Attention : L’azoture de sodium est extrêmement toxique. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Portez des EPI appropriés. Disposer conformément aux lois applicables.
couplage (0,05 M MES, pH 5,0)
MES (2-[N-Morpholino]acide éthanesulfonique)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
dosage fort (PBS, 1 % BSA, pH 7,4)  ; Filtre Stériliser et conserver à 4 ° ; C
PBS, 1 % BSA, pH 7,4SigmaP-3688138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 % BSA
Tampon d’activation (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)Filtre Stériliser et conserver à 4 ° ; C
NaH2PO4 (Phosphate de sodium, monobasique anhydre)SigmaS-31390,1 M NaH2PO4
5 N NaOHFisherSS256-500
Wash Buffer (PBS, 0,05 % Tween-20, pH 7,4) ; C
PBS, 0,05 % Tween-20, pH 7,4SigmaP-3563138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05 % DOUZE
tué par la chaleur Filtre Stériliser et stocker à 4 °Filter Stériliser et stocker à 4 °

Références

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