Method Article

Développement d'un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d'antigènes aux cellules T

DOI:

10.3791/54421

⸱

September 18th, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

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Dans ce modèle de colite induite par antigène, les lymphocytes T CD4+ OT-II exprimant une protéine fluorescente rouge ont été transférés adoptivement dans des souris RAG-/- qui expriment une protéine fluorescente verte dans des phagocytes mononucléaires (MP). Les hôtes ont été mis au défi par Escherichia coli (E. coli) exprimant la protéine ovalbumine (OVA) fusionnée à une protéine fluorescente cyan (CFP).

Abstract

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La maladie inflammatoire de l’intestin (MICI) est une inflammation chronique qui affecte le tractus gastro-intestinal (TCM). L’une des meilleures façons d’étudier les mécanismes immunologiques impliqués au cours de la maladie est le modèle de transfert de lymphocytes T de la colite. Dans ce modèle, des souris immunodéficientes (receveuses de RAG-/-) sont reconstituées avec des lymphocytes T CD4+ naïfs provenant d’hôtes sains de type sauvage.

Ce modèle permet d’examiner les premiers événements immunologiques conduisant à la maladie et à l’inflammation chronique, lorsque l’inflammation intestinale se perpétue mais ne dépend pas d’un antigène défini. Pour étudier le rôle potentiel des cellules présentatrices d’antigènes (CPA) dans le processus de la maladie, il est utile de disposer d’un modèle de maladie induit par l’antigène, dans lequel un antigène défini dérivé de commensaux conduit à la colite. Un modèle de colite induite par l’antigène a donc été développé. Dans ce modèle, les lymphocytes T CD4+ OT-II, qui ne peuvent reconnaître que des épitopes spécifiques de la protéine OVA, sont transférés dans des hôtes RAG-/- confrontés à E. coli exprimant CFP-OVA. Ce modèle permet d’examiner les interactions entre les APC et les lymphocytes T dans la lamina propria.

Introduction

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L'intestin est la plus grande surface du corps qui est exposé à l'environnement extérieur. De vastes réseaux de microbes résidents colonisent l'intestin humain pour former le microbiote intestinal (ou microflore). Ceci est estimé à compter jusqu'à 100 trillions de cellules microbiennes et constitue l' un des habitats bactériens les plus densément peuplées connus en biologie 1-3. Dans le GIT bactéries colonisent une niche intestinale où ils survivent et se multiplient 4. En retour, le microbiote confère à l'hôte avec des caractéristiques fonctionnelles supplémentaires non codées sur son génome 1. Par exemple , l....

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Protocol

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Les souris ont été élevés et maintenus sous (SPF) des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques dans l'animalerie de l'Université d'Ulm (Ulm, Allemagne). Toutes les expériences animales ont été réalisées selon les directives de l'utilisation des animaux locaux et comité de protection et le droit national de la protection des animaux.

1. Construction du PCFP-OVA plasmide

  1. Amplifier le gène taille de OVA complète en utilisant les amorces Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') et Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 en utilisant ....

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Results

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Pour établir un modèle de colite entraîné antigène un E. coli a été construit qui contient un plasmide dans lequel le gène de la PCP est fusionnée à la séquence codant pour la protéine ovalbumine de poulet et de la construction de fusion est exprimé sous le contrôle du promoteur constitutif fort P hyper (figure 1A). La microscopie de fluorescence montre que le recombinant E. coli PCFP OVA, mais pas E. parentale

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Discussion

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Comme avec tous les autres modèles, le modèle de colite entraîné antigène décrit ci-dessus peut présenter quelques questions que l'enquêteur effectuant la technique doit être au courant. Lors de l' injection du OT-II Les cellules / Red + T CD4 + CD62L + dans les armées, le chercheur doit être très doux et prudent d'insérer l'aiguille dans la cavité péritonéale. Ne pas le faire peut conduire à la déchirure de l'intestin de la souris qui pourrait conduire à la mort, ou .......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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JHN est soutenu par le Fonds national suisse (FNS 310030_146290).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Rotary ShakeReiss Laborbedarf e. K.Modèle 3020 GFL
Couvettes 2 mm d’écart.Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GlycérolSigma-AldrichG5516-100ML
Gène Pulser Système Xcell  ;BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpicillineSigma-AldrichA9393-5G
SOC MediumSigma-AldrichS1797-100ML
Kit d’isolement de plasmides hautement pursRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Acide acétique glacialSigma-Aldrich537020  ;
Chambre de gelPEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Colorant de chargementThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb Échelle d’ADN  ;Thermo FisherSM0312
Solution de bromure d’éthidiumCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Système de photodocumentation  ;Decon Science Tech GmbHDeVision G  ;
Séquençage de l’ADN  ;MWG-Biotech GmbH
Sérum salin tamponné au phosphate (PBS)BiochromL182-50
Microscope fluorescent  ;ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Échelle de protéines précolorées  ;Fermentas, St. Leon-Rot, Allemagne
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, Royaume-Uni
Membrane nitrocellulosique  ;Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Buvard électroBiometra GmbH846-015-600
Albumines sériques bovines (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Anticorps anti-ovalbumine  ;Abcamab181688
Anti-lapin IgG  ; HRPSigma-AldrichA0545  ;
Substrat de transfert Western Pierce ECL Plus, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Cell StrainersFischer Scientific  ;08-771-2
Chlorure d’ammoniumSigma-Aldrich254134-5G
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
CD4+ CD62 L+ Kit d’isolation T  ;Miltenyi Biotec130-093-227  ;
Colonnes MACS LS  ;Miltenyi Biotec130-042-401
Colonnes MACS MS  ;Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS SéparateurMiltenyi Biotec130-042-302
Séparateur MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Aiguille d’alimentation 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Solution de formol, neutre tamponné, 10 %Sigma-AldrichHT501128
ParaffineSigma-Aldrich1496904
HématoxylineSigma-AldrichH9627
Eosin YSigma-Aldrich230251  ;
DithiothreitolSigma-AldrichD9779  ;
Collagénase de type VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) moyenAppliChemA2044, 9050
Azoture de sodiumSigma-Aldrich438456
souris BD Fc BlockBD Pharmingen553141
Liaison d’anticorps monoclonaux conjugués FITC Vß ; 5.1, 5.2  ;BD Pharmingen553189
Liaison d’AcM conjuguée à l’APC CD4 GK1.5  ;eBioscience17-0041-83
FACS Calibur  ;BD Biosciences
FCS Express V3 logicielDeNovo
Meta microscope confocal à balayage  ;ZeissLSM 710°
Station de travail ZeissZeissLSM 7
Logiciel Zeiss ZEM  ;Zeissv4.2.0.121
Plaques immunitaires Maxisorp  ;NUNC, Roskilde442404
Streptavidin phosphatase alcaline conjuguéeJackson Immuno Research016-050-084
Substrat de la phosphatase alcaline 4-Nitrophényl phosphate disodique sel hexahydratéSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2  ;BD Biosciences554410
TECAN lecteur de microplaques-ELISATecan
Logiciel EasyWinTecan
DNase I recombinant4536282001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

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