Method Article

La détection Colorimétrie visuelle de Multi-nucleotide polymorphismes sur une plate-forme de manipulation pneumatique Droplet

DOI:

10.3791/54424

⸱

September 27th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail présente une méthode simple et visuelle pour détecter les polymorphismes multi-nucléotidiques sur une plateforme de manipulation de gouttelettes pneumatique. Avec la méthode proposée, l'ensemble de l'expérience, y compris la manipulation des gouttelettes et la détection de polymorphismes nucléotidiques multiples, peut être effectuée à proximité de 23 ° C, sans l'aide d'instruments avancés.

Abstract

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Une méthode simple et visuel pour détecter plusieurs polymorphisme nucléotidique (MNP) a été réalisée sur une plate-forme de manipulation de gouttelettes pneumatique sur une surface ouverte. Cette approche de la détection de l'ADN colorimétrie a été basée sur la croissance d'hybridation à médiation par des sondes de nanoparticules d'or (sondes AUNP). La taille de la croissance et la configuration de la AUNP sont dominées par le nombre d'échantillons d'ADN hybridées avec les sondes. Sur la base des propriétés optiques SIZE- et dépendant de la forme spécifique des nanoparticules, le nombre de discordances dans un fragment d'ADN de l'échantillon aux sondes est en mesure d'être discriminé. Les tests ont été effectués par l'intermédiaire de gouttelettes contenant des réactifs et des échantillons d'ADN, respectivement, et ont été transportés et mélangés sur la plateforme pneumatique avec l'aspiration pneumatique contrôlée de la membrane superhydrophobe à base de PDMS flexibles. Gouttelettes peuvent être fournis simultanément et précisément sur une surface ouverte sur la plateforme pneumatique proposée qui est hautement biocompatible sans eff latéralect d'échantillons d'ADN à l'intérieur des gouttelettes. En combinant les deux méthodes proposées, le polymorphisme multi-nucléotide peut être détectée à la vue sur le pneumatique plate-forme de manipulation de gouttelettes; aucun instrument supplémentaire est nécessaire. La procédure de montage des gouttelettes sur la plate-forme pour le résultat final prend moins de 5 minutes, beaucoup moins qu'avec les méthodes existantes. En outre, cette approche combinée de détection MNP nécessite un volume d'échantillon de seulement 10 ul dans chaque opération, ce qui est notablement inférieure à celle d'un système de macro.

Introduction

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Polymorphisme nucléotidique (SNP), qui est d'une seule différence dans une séquence d'ADN de paires de bases, est l'un des variations génétiques les plus courantes. Les études actuelles indiquent que les SNP sont associés à un risque de maladie, l' efficacité des médicaments et les effets secondaires des individus en affectant la fonction des gènes. 1,2 Des études récentes ont également révélé que les mutations à deux ou multi-points (multi-nucleotide polymorphism) provoquent des maladies et individuelles particulières différences dans les effets de la maladie. 3,4 La détection du polymorphisme nucléotidique est donc impératif de prescreening maladie. Des méthodes simples et efficaces pour la détection rapide des oligonucléotides spécifiques de la séquence ont été très développées au cours des deux dernières décennies. 1,5 Les approches actuelles pour identifier les mutations de l' ADN impliquent généralement des procédures , y compris la sonde immobilisation, marquage par fluorescence, électrophorèse sur gel, etc., 6,7 mais ces méthodes nécessitent généralement un processus d'analyse long, expenéquipements sive, techniciens bien formés, et la consommation importante d'échantillons et de réactifs.

Une nanoparticule avec un grand rapport de la surface au volume et propriétés physico-chimiques uniques est un matériau idéal en tant que plate-forme de détection très sensible et pas cher pour des biomarqueurs spécifiques. Les nanoparticules d'or (AUNP) sont largement utilisés pour la détection de l' ADN en raison de leur grande capacité à être modifiée avec des sondes oligonucléotidiques. 8-10 techniques de détection de SNP ont également été développés en utilisant AUNP. 11-13 Dans ce travail , nous avons adopté une approche colorimétrique roman pour détecter la plusieurs polymorphisme nucléotidique (MNP) par croissance d'hybridation à médiation par l' ADN de sondes AUNP 14. Cette méthode de sondage simple et rapide est basé sur la théorie selon laquelle les différentes longueurs d'ADN simple brin (ADNsb) ou de l' ADN double brin (ADNdb) conjugué à AUNP influencer la taille de la croissance et la forme du AUNP (voir Figure 1). 15 Cette méthode de détection de l' ADNdispose d'une faible consommation de réactifs, une petite durée de l'essai (quelques minutes), et une procédure simple, sans contrôle thermique qui est applicable à l'avenir pour le diagnostic clinique et un examen médical interne.

Plusieurs systèmes microfluidiques pour détecter la séquence d'ADN ont été développés; 16 ces systèmes microfluidiques, évolué à partir de protocoles expérimentaux traditionnels, besoin de moins de pièces d'équipement à grande échelle et simplifié les protocoles expérimentaux afin d'améliorer la sensibilité, limite de détection et la spécificité de l'ADN biocapteur. Les méthodes de détection de l' ADN dans les systèmes microfluidiques nécessitent encore, cependant, les instruments d'un processus ultérieur tel qu'une PCR (réaction en chaîne par polymérase) Machine pour l' amplification de signal et un lecteur de fluorescence pour une seule lecture pour identifier le SNP hétérogène. 17,18 Développement simple plateforme sans traitement ultérieur pour lire directement les résultats de multi-nucléotide polymorphismeest hautement souhaitable. Comparé à bien utilisé, classique, fermé des systèmes microfluidiques, la surface ouverte des dispositifs microfluidiques offrent promisingly plusieurs avantages, comme une voie claire optique, un moyen facile d'accéder à l'exemple, un accès direct sur l'environnement et la cavitation pas facilement formé ou une obstruction interfaciale dans le canal. 19 Nos travaux antérieurs mis en place une plate - forme pneumatique simple pour la manipulation ouverte de la surface des gouttelettes (voir la figure 2). 20 Sur cette plate - forme, les gouttelettes peuvent être transportées simultanément et manipulées sans interférence à partir d' une énergie d' entraînement en utilisant une force d'aspiration, qui a une un grand potentiel dans les applications biologiques et chimiques. Cette plate-forme pneumatique a donc été utilisée pour exécuter la manipulation d'échantillons d'ADN pour la détection MNP en combinaison avec l'approche colorimétrique en utilisant le concept de croissance d'hybridation médiée par l'ADN de sondes AUNP.

Le protocole présenté dans le présent document décritune détection visuelle simple de polymorphismes multi-nucléotidiques sur le pneumatique plate-forme de manipulation de gouttelettes sur une surface ouverte. Ce travail confirme que multi-nucléotide polymorphisme est détectable à l'œil nu; la plate-forme pneumatique proposé est adapté pour des applications biologiques et chimiques.

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Protocol

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1. Méthode pour détecter MNP

Remarque: Cette section décrit la procédure pour détecter le MNP basé sur la croissance de l'hybridation médiée par des nanoparticules d'or.

  1. Préparer l'ADN de sonde (5'-thiol GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') solution à une concentration de 100 uM.
  2. Préparer la AUNP sonde ADN modifié (sonde AUNP) particules. 21
    Remarque: Le volume utilisé ici dépend de l'exigence de AUNP sonde ADN modifié (sonde AUNP) particules. Il est donc fonction du nombre d'essais à effectuer. Nous préparons typiquement des particules de sonde AUNP excédentaires sous forme de pièces de rechange. Le volume utilisé dans ces étapes est réglable et flexible.
    1. Ajouter l'ADN de sonde (100 pm, préparé à l'étape 1.1), à une solution de nanoparticules d'or (13 nm, 17 nm) à une concentration de 1 DO / ml.
    2. Amener les concentrations finales de dodécylsulfate de sodium (NaC 12 H 25 SO 4, SDS) et un tampon de phosphate (PBS) à 0,01% et 0,01 M, respectively.
    3. Au bout de 20 minutes, amener la concentration de chlorure de sodium (NaCl) à 0,05 M avec une solution de NaCl (2 M) et du PBS (0,01 M), tout en maintenant SDS à 0,01% et on incube pendant 20 min.
    4. Augmenter la concentration de NaCl par incréments de 0,1 M à une concentration finale de 1 M sur 20 min d'intervalle.
    5. Incuber une nuit avec agitation sur un mélangeur à vortex à 23 ° C. La vitesse d'agitation n'a aucune incidence sur l'expérience aussi longtemps que les échantillons d'ADN et les sondes AUNP deviennent hybridée.
    6. Centrifuger les nanoparticules d'or à 7000 xg pendant 30 secondes et retirer le surnageant.
  3. Ajouter AUNP particules de la sonde dans l'eau déminéralisée (DI de l'eau) à une concentration de 25 nM (solution de sonde AUNP).
  4. Préparer des échantillons d'ADN cible (entièrement complémentaires: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 ', trois paires de bases incompatibles: 5'-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3', six paires de bases incompatibles: 5'-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 ') à des concentrationsde 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 uM, respectivement.
  5. Ajouter une solution de sonde AUNP (6 pi, 25 nM) dans les échantillons d'ADN (350 pi) avec NaCl (14 uM).
  6. Agiter le mélange d'échantillons d'ADN et des sondes AUNP avec un mélangeur à vortex à 23 ° C pendant 5 minutes pour l'hybridation d'ADN.
  7. Pour la croissance AUNP, ajouter NH2OH (6 ul, 400 mM) et de HAuCl 4 (6 ul, 25,4 mM) à la solution (le mélange d'échantillons d' ADN et des sondes AUNP). La croissance de AUNP prend environ 30 secondes pour l'achèvement. Le changement constant de coloration maintient plus de 1 h.
    ATTENTION: Le contact cutané avec HAuCl4 pourrait produire des effets toxiques graves. S'il vous plaît consulter les fiches de données de sécurité (FDS) avant utilisation. S'il vous plaît porter des gants et utiliser une hotte lorsque vous utilisez HAuCl4.

2. Fabrication d'une plate-forme de manipulation pneumatique Droplet

Remarque: La plate-forme de manipulation de gouttelettes à base de PDMS comprend deux composantes: un PMembrane DMS (100 um) avec une surface super-hydrophobe, et une couche de canal d'air (5 mm). Sans un processus de MEMS, les procédés d'usinage communs ont été utilisés pour fabriquer ce dispositif, qui comprend la commande numérique par ordinateur (CNC) micro-usinage pour la fabrication d'un moule, PDMS coulée et la réplication pour le prototypage rapide des composants microfluidiques, et micro-usinage laser pour la fabrication de une surface super-hydrophobe (voir Figure 3).

  1. Utilisez la machine CNC équipée d'un foret (0,5 mm) pour produire des moules de maître à base de PMMA (voir Figure 3) avec microstructures. Utiliser une vitesse d'avance du foret de 7 mm / s et une vitesse de rotation de 26000 tours par minute. Utilisez une soufflerie d'air et de l'eau DI pour éliminer les déchets de PMMA et de nettoyer la surface des moules maîtres.
  2. Préparer un mélange de la base de PDMS et l'agent de durcissement dans un rapport 10: 1. Dégazer le mélange dans un dessicateur pendant 30 minutes ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air sont éliminées.
  3. Verser le PDMS dans èmee maître moule et cuire les PDMS pendant 3 heures à 60 ° C dans le four pour obtenir les microstructures inverses des chambres à air (membrane PDMS) et des canaux d'air (couche de PDMS).
  4. Retirer la couche PDMS du moule maître (à la main). Percez des trous sur la couche PDMS pour les entrées d'aspiration d'air.
  5. Mettre la membrane PDMS, la couche de PDMS et le substrat de verre dans la chambre du système de traitement par plasma d'oxygène. Après traitement par plasma d'oxygène, une liaison de la membrane PDMS, la couche de PDMS et le substrat de verre en même temps sur une plaque chauffante (90 ° C) pendant 10 min.
  6. Mettre la puce composite dans la machine de découpe au laser (PDMS côté de la membrane vers le haut). Importer le fichier .dwg pour définir la zone superhydrophobe (15 mm x 12 mm). Voir la figure 3. Directement graver la membrane PDMS avec une machine à -Laser CO 2 pour créer la zone superhydrophobe sur la membrane PDMS (puissance 12 W, la vitesse de balayage 106,68 mm / s).
  7. Nettoyer la surface superhydrophobe avec de l'eau DI pour laverloin les résidus carbonisés sur la surface.
  8. Raccorder l'entrée d'aspiration d' air et de la pompe à vide par une électrovanne (voir la figure 4). Connecter l'électrovanne à l'ordinateur et le contrôle avec un module USB E / S numérique.

3. Opération pour la détection des MNP sur la plate-forme pneumatique

Remarque: Cette section décrit le fonctionnement d'identifier rapidement la colorimétrie et MNP sur le pneumatique plate - forme de manipulation de gouttelettes (voir Figure 5). Toutes les étapes ont lieu à 23 ° C (température ambiante) et une humidité relative de 85%.

  1. Placer l'échantillon de gouttelettes d'ADN cible (10 ul, 0,5 uM) sur la surface superhydrophobe du pneumatique, la plate-forme de manipulation de gouttelettes.
  2. Placer la sonde de gouttelettes AUNP (10 ul, 25 nM) sur la surface superhydrophobe du pneumatique, la plate-forme de manipulation de gouttelettes.
  3. Commander l'aspiration d'air pour provoquer la déformation de la membrane PDMS d'une électrovanne et un SIprogramme de mple (par exemple, Labview). Fournir une aspiration d'air dans chaque chambre d'air le long du trajet de migration des gouttelettes (contenant de l'ADN cible et les sondes AUNP respectivement) sur la membrane PDMS de telle sorte que les gouttelettes entrent en collision les uns avec les autres et se soudent. Utiliser une pression de travail de la pompe à vide de -80 kPa (pression manométrique).
    1. En variante, le contrôle de l'aspiration d'air manuellement tant que la goutte est totalement mélangé. Par contre, brancher ou débrancher la pompe à vide et des entrées de chambre à air avec des tubes dans les premiers stades de l'essai.
  4. Contrôle de l'aspiration d'air à rouler la gouttelette coalescence avant et en arrière pour améliorer l'efficacité du mélange pendant 3 minutes en utilisant le système de commande de l'électrovanne. L'ADN cible et les sondes AUNP deviennent bien mélangés et hybridés à moins de 3 min. Utiliser une fréquence d'entraînement et une pression de fonctionnement de 5 Hz et -80 kPa (pression manométrique), respectivement.
  5. Placez une gouttelette contenant NH 2 OH (2 pi, 400 mM) et HAuCl4 (2 ul, 25,4 mM) sur la surface superhydrophobe du pneumatique , la plate - forme de manipulation de gouttelettes.
  6. Contrôle de l'aspiration d'air (-80 kPa de pression) pour laisser les gouttelettes entrent en collision les uns avec les autres et fusionnent. Puis contrôler l'aspiration d'air (5 Hz et -80 kPa de pression) pour laisser la gouttelette rouleau coalescence vers l'avant et vers l'arrière afin d'améliorer l'efficacité du mélange pendant 1 min.
  7. Mesurer et enregistrer la couleur de la gouttelette coalescence à l'œil nu.

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Results

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Dans ce travail, trois échantillons d'ADN ont été testés à l'aide d'une méthode simple et nouvelle de la détection grâce à la croissance de l'hybridation ADN médiée par des sondes AUNP. Les séquences d'ADN de la sonde et des échantillons d'ADN de trois types, en particulier, CDNA (entièrement complémentaire pour sonder l'ADN), TMDNA (trois paires de bases d'ADN ne correspondent pas), et SixMDNA (DNA dépareillés six paires de bases) sont énumérés dans le protocole étape 1. les inadéquatio...

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Discussion

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Dans ce protocole, une méthode colorimétrique simple pour détecter MNP peut être mis en oeuvre à des concentrations allant de 0.11-0.50 uM dans des tubes de microcentrifugation. En outre, la méthode de détection MNP proposé est réalisé sur une plate-forme de manipulation de gouttelettes de pneumatique qui a un fort potentiel pour le criblage de l'ADN et d'autres applications biomédicales. En pratique, la plage détectable de la concentration d'ADN de l'échantillon dépend de l'efficacité de mélange des...

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgements

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Ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan a apporté un soutien financier à cette recherche dans le cadre des contrats MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PDMSDow CorningSYLGARD 184
graveurs de paillasseRoland DGEGX-400
machine de découpe laserUniversal Laser Systems, Inc.VLS 3.50
Système de traitement au plasma d’oxygèneFemto Science Inc. CoréeCUTE-MPR
électrovannepompe à
videULVAC KIKO, Inc.DA-30D
13-nm Solution AuNPTAN Bead Inc., TaïwanADN NG-13
(avec thiol marqué à 5')MDBio, Inc., Taiwan
phosphate salin tamponné (PBS)UniRegion  ; Bio-Tech,. TaiwanPBS001-1L
dodécylsulfate de sodium (SDS)J. T. baker4095-04
Solution d’hydroxylamine (NH2OH)Sigma-Aldrich467804
Acide chloroaurique (HAuCl4)Sigma-AldrichG4022
chlorure de sodium (NaCl)
mélangeurvortexInstruments de laboratoire Digisystem Inc.Centrifugeuse VM-2000
Hermle Labortechnik GmbH.Z 216 MK
maison

References

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