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Conception et utilisation d'un faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques

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DOI :

10.3791/54426

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27 septembre 2016

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un morbidostat configurable à faible coût qui permet de caractériser la résistance aux antibiotiques en ajustant dynamiquement la concentration du médicament. Le dispositif peut être intégré à une plate-forme microfluidique multiplexée. L’approche peut être étendue aux études de résistance aux antibiotiques en laboratoire.

Résumé

Nous décrivons un faible coût, morbidostat configurable pour caractériser la voie de l'évolution de la résistance aux antibiotiques. Le morbidostat est un dispositif de culture bactérienne qui surveille en permanence la croissance bactérienne et ajuste la concentration du médicament à récuser en permanence les bactéries à mesure qu'ils évoluent pour acquérir une résistance aux médicaments de façon dynamique. L'appareil dispose d'un volume de travail de ~ 10 ml et est entièrement automatisé et équipé de la mesure de la densité optique et micro-pompes à moyen et à la délivrance de médicaments. Pour valider la plate - forme, nous avons mesuré l'acquisition progressive de la résistance triméthoprime dans Escherichia coli MG 1655 et intégré de l'appareil avec une plate - forme microfluidique multiplexé pour étudier la morphologie des cellules et la sensibilité aux antibiotiques. L'approche peut être mise à échelle des études de laboratoire de la résistance aux antibiotiques, et est prorogeable adaptatifs évolution des améliorations de contrainte dans l'ingénierie métabolique et d'autres expériences de culture bactérienne.

Introduction

Depuis l'introduction de la première pénicilline médicament antibiotique, la résistance aux antibiotiques microbienne est devenue un problème de santé mondial 1. Bien que l'acquisition d' une résistance aux antibiotiques peut être étudié rétrospectivement in vivo, les conditions de ces expériences sont souvent pas contrôlés tout au long de l' évolution 2. En variante, l' évolution de laboratoire adaptatif peut révéler l'évolution moléculaire d'une espèce microbienne sous contraintes de l' environnement ou de la pression de sélection d'un médicament antibiotique 3. Récemment, de nombreuses expériences d'évolution bien contrôlée de la résistance aux antibiotiques ont élucidé l'émergence de la résistance aux antibiotiques. Par exemple, le groupe d'Austin a démontré l' émergence rapide dans un environnement compartimenté de microfluidique correctement conçu 4. Le morbidostat développé récemment induit des mutations systématiques sous la pression de la sélection des médicaments 5,6. Le morbidostat, une sélec microbiennedispositif de tion qui ajuste en continu la concentration en antibiotique pour maintenir une population à peu près constante, constitue une avancée majeure dans le test de fluctuation utilisée en microbiologie 7,8. Dans le test de fluctuation, un médicament antibiotique est injecté à une concentration élevée, et les mutants survivants sont criblés et comptés. Au lieu de cela, les microbes dans un morbidostat sont constamment remises en question et d'acquérir de multiples mutations.

Le morbidostat fonctionne de façon similaire à la chémostat, un dispositif de culture inventé par Novick et Szliard en 1950 qui maintient une population constante par apport continu de nutriments alors que la dilution de la population microbienne 9. Depuis son introduction, le chemostat a été avancée et améliorée. chémostats microfluidiques actuelles ont atteint des capacités de nanolitre et une seule cellule. Cependant, ces dispositifs ne sont pas appropriés pour des expériences d'évolution adaptative, qui nécessitent une grande population de cellules avec de nombreux événements de mutation 10,11. Récemment, mini-chémostats avec des volumes de travail de ~ 10 ml ont également été développés pour combler l'écart entre le litre bioréacteurs à l'échelle et la microfluidique chemostat 12,13.

Ici, nous présentons la conception et l'utilisation d'un faible coût, morbidostat automatisé pour une étude de résistance aux antibiotiques de la drogue. Le module proposé peut être utilisé dans un incubateur à agitateur dans un laboratoire de microbiologie à l'exigence d'un minimum de matériel. Le firmware open-source est également facilement adapté à des applications spécifiques de l' évolution adaptative, tels que l' ingénierie métabolique 3. Enfin, le morbidostat est intégré dans une plate - forme microfluidique multiplexé pour les tests de sensibilité aux antibiotiques 14.

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Protocole

Assemblée 1. et prétest de l'appareil Morbidostat

  1. Assemblée de la Morbidostat
    1. Poinçonner des trous 3 sur le bouchon du flacon de culture avec une aiguille de seringue 18 G. Couper trois morceaux de tube en polyéthylène ~ 7 cm de longueur. Insérez ces trois morceaux de tuyaux en polyéthylène sur le bouchon.
    2. Utilisez du ruban adhésif pour envelopper le bord de la capsule pour servir le casting pour le mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS). Mélanger 5 g de composant A et 0,5 g de composant B du PDMS dans un récipient en plastique de 150 ml en agitant manuellement à l'aide d'un cure-dent. Charger le mélange dans une seringue de 10 ml.
      1. Verser le mélange PDMS sur le bouchon avec la seringue. Cuire l'ensemble de bouchon pour guérir les PDMS pendant 8 heures dans le four à 70 ° C.
    3. Soudez l'anode LED avec le fil de calibre 24 et la cathode LED avec la résistance de carbone avec un fer à souder. Soudez une résistance de 680 Ω de carbone avec un G fil 24. Isolez la connexion de fil à l'aide du ruban électrique.
    4. Alorslder le collecteur du photo-détecteur avec le G fil 24 et l'émetteur du photodétecteur avec une résistance de 100 kQ de carbone. Isolez la connexion de fil à l'aide du ruban électrique.
    5. Placez la diode émettant de la lumière dans le support de la culture de flacon. En suivant le schéma de la figure complémentaire 2, connectez la diode électroluminescente et la puissance avec une alimentation de 5 V. Assurez -vous que la LED fonctionne en utilisant un appareil photo numérique qui permet de détecter IR (par exemple, une caméra de téléphone mobile).
    6. Placer le photodétecteur dans le support de flacon de culture. En suivant le schéma de la figure complémentaire 2, connectez le photodétecteur et la puissance avec une alimentation de 5 V. Branchez le fil sur les deux côtés des résistances photodétecteurs pour mesurer la tension aux bornes de la carte de commande électronique.
    7. Coller un aimant sur l'arbre du ventilateur de refroidissement, qui sert d'unité d'agitation magnétique. A noter que le alignement de l'arbre du ventilateur dans le flacon de culture, et l'espacement entre la fiole de culture et l'aimant est très critique pour le bon fonctionnement de l'unité d'agitation magnétique.
    8. Connectez chaque morceau de tube en polyéthylène du flacon de culture dans le morceau de tube en silicone correspondant pour les micro-pompes, bouteilles moyennes, et une bouteille de déchets. Tournez sur la pompe pendant 1 heure et mesurer le volume total pompé de la bouteille moyenne dans le flacon de culture pour déterminer le débit de la pompe. Notez que le taux de pompage typique devrait être ~ 4 ml / h, ce qui correspond au taux de dilution D = 0,33 h -1 pour un 12 ml de volume de la fiole de culture de travail.
    9. Placez tout l'ensemble sur une taille moyenne (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) Agitateur incubateur.
  2. Prétest l'Morbidostat
    1. Set tension d'alimentation du ventilateur cool de 5 V pour démarrer son moteur à tester la barre d'agitation magnétique. Notez que l'action d'agitation peut être inspecté visuellement. La tension qui conduisents le moteur du ventilateur de refroidissement est contrôlée avec précision par la largeur d'impulsion (PWM).
    2. Préparer une série de type sauvage E. coli échantillons ayant une densité optique à 600 nm allant généralement de 0,07 à 0,3 pour l' étalonnage. Placez un test E. échantillon coli dans le flacon de culture et d' enregistrer la tension de photodétecteurs.
      1. Placer ~ 100 ul du même échantillon dans le lecteur de plaque et enregistrer la densité optique. Utiliser la tension du photodétecteur en fonction des données de densité optique pour tracer la courbe d'étalonnage. Notez que généralement, un changement d'unité de densité optique correspond à ~ 7,6 V changement dans le photodétecteur avec le schéma de polarisation utilisé ici.

2. Exécution de l'Morbidostat

  1. Préparation Avant de commencer l'expérience quotidienne
    1. Préparer le flacon de culture avec trois ultra-résistants aux produits chimiques tubings Tygon avec diamètre intérieur 1/32 pouce et le diamètre extérieur de 3/32 pouce pour les entrées pour former le dispositif de l'article1.1 et à la figure 1 supplémentaire.
    2. Préparer le milieu minimum M9 (0,2% de glucose) et le triméthoprime (TMP) médicaments contenant du milieu. Stériliser le milieu, la bouteille moyenne, le milieu bouteille de médicament, le flacon de récupération, et le flacon de culture dans un autoclave à 121 ° C.
      NOTE: Le TMP est une solution de réserve qui est utilisée pour obtenir plus tard , les concentrations dans le tableau 1 et le médicament TMP contenant du milieu ne sont pas autoclavé.
  2. Exécution de l'Morbidostat
    1. Le premier jour de l'expérience, dégeler 1 ml de type sauvage congelé E. coli MG1655 cellules pendant 5 min à température ambiante , et le transfert de 120 ul de cellules dans le flacon de culture contenant ~ 12 ml de milieu de culture M9. Après le premier jour, décongeler 1 ml de E. congelées coli , des cellules de la veille pendant 5 min et le transfert de 120 ul des cellules à un nouveau flacon de culture contenant environ 12 ml de milieu de culture M9.
    2. Allumez l'incubateur shaker et régler le tempeh rature à 30 ° C sans agitation.
    3. Démarrer l'opération de morbidostat en activant la micro-pompe, l'unité d'agitation magnétique et la mesure de la densité optique.
      Remarque: Au cours de l'opération, un algorithme de seuil de contre-réaction est utilisé pour commander l'injection du médicament. Lorsque la densité optique mesurée dépasse un seuil prédéterminé, la pompe d'injection de médicament serait activé et la pompe à fluide soit mis hors tension. Dans le cas contraire, la pompe d'injection de médicament reste éteint et la pompe à fluide est activée.
    4. Surveiller la tension de temps à autre pour qu'il y ait une croissance microbienne.
      Remarque: En raison du gel et du dégel du cycle, E. coli cellules présentent un retard de ~ 4 h au cours de la croissance de chaque jour.
    5. Après ~ 23 h, arrêter le micro-pompe en éteignant sa tension d'alimentation et retirez le flacon de culture. Ajouter 15% de glycérol dans le flacon de culture et congeler l'échantillon à -80 ° C pour le stockage.
    6. Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.5.
le "> 3. Antibiotique Susceptibilité Mesure dans 96 puits Format

REMARQUE: Effectuez la mesure du taux de croissance dans un lecteur de plaque avec un format de 96 puits pour déterminer le niveau de résistance aux antibiotiques.

  1. Décongeler l'échantillon congelé par jour à la température ambiante pendant 5 minutes et transférer 15 pl de la cellule dans le flacon de culture contenant environ 15 ml de milieu M9. Leur permettre de se développer jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm atteint ~ 0,1. Diviser les 15 ml dans des flacons de 1 ml et ajouter le médicament TMP à cette étape pour obtenir les concentrations désirées de médicament comme indiqué dans le tableau 1.
  2. Prendre 200 pi de l'échantillon de l' étape 3.1 et la place dans chaque puits dans le lecteur de plaque et leur permettre de se développer pendant 12 h 5. La densité optique à une longueur d'onde de 600 nm est automatiquement enregistrée pendant la mesure.
    NOTE: Pour chaque point de données, les mesures sont enregistrées en triple et en moyenne pour assurer la cohérence des données. Les données sur la densité optique en fonction du temps peut be utilisée pour obtenir le taux de croissance.
  3. Tracer les données de taux de croissance par rapport à la concentration du médicament pour obtenir IC50. A noter que la CI50 est définie comme la concentration de médicament à laquelle le taux de croissance est de cinquante pour cent du taux de croissance maximal 5.

4. Single Cell Morphologie et sensibilité aux antibiotiques dans la mesure dispositifs microfluidiques

  1. Effectuer la fabrication des dispositifs microfluidiques par lithographie douce multicouche de PDMS comme décrit ailleurs 15.
    1. Utilisez photolithographie pour faire le moule de résine photosensible pour les couches de contrôle et de débit. Notez que pour la couche de contrôle, utilisez photorésist négatif (~ 15 um de hauteur) et résine photosensible positive (~ 8 pm hauteur) pour produire un moule sur une plaquette de silicium nue.
    2. Préparer des mélanges de PDMS avec des rapports de reticulation de 5: 1 et 20: 1 pour la couche de contrôle et la couche d'écoulement, respectivement. Mettez les mélanges dans un dessiccateur sous vide pour éliminer les bullesPendant 1 h.
    3. Exposer les moules couche de résine photosensible de contrôle sur la plaquette de silicium à triméthylchlorosilane (TMCS) vapeur. Rendre la couche de contrôle de l'épaisseur ~ 6 mm par coulée du mélange PDMS (avec un rapport de réticulation 5: 1) sur la plaquette de silicium sur la couche surmoulée contrôle de résine photosensible. Cuire la couche de commande pendant 40 min à 80 ° C pendant 1 h dans le four.
    4. Rendre la couche d'écoulement par revêtement par centrifugation d'un mélange de PDMS (avec un rapport reticulation 20: 1, la vitesse de rotation de 3000 rpm pendant 60 secondes) sur un moule de résine photosensible couche d'écoulement. Cuire la couche d'écoulement pendant 30 min à 80 ° C pendant 1 h dans le four.
    5. Utilisez une lame de rasoir pour couper la couche de contrôle dans la taille de la puce souhaitée (typiquement 3 cm x 2 cm) et manuellement décoller la couche de contrôle. Placez la couche de contrôle sur le dessus de la couche d'écoulement et les aligner sous un stéréomicroscope. Durcir l'ensemble aligné à 80 ° C pendant une nuit dans le four. Ensuite, faire tremper l'ensemble dans 250 ml d'eau déminéralisée dans un récipient en plastique pendant 5 heures pour dissoudre le TMCS résiduel.
    6. Par la suite, poinçonner les trous d'entrée avec 20 g d'aiguilles et de lier l'ensemble élastomère sur une lame de verre recouverte d'une couche de PDMS ébauche (PDMS réticulation rapport 5: 1, vitesse de rotation 2000 tours par minute pendant 30 secondes), par traitement par plasma d'air pendant 40 secondes à 1.2 pression d'air Torr.
    7. Effectuer une vaste cuisson pendant 36 heures à 80 ° C pour réduire les effets cytotoxiques de PDMS. A noter que cette étape de cuisson est crucial pour minimiser la toxicité pour les cellules bactériennes.
  2. On Chip Growth Experiment
    1. Avant de charger dans le dispositif microfluidique, rincer avec de l'eau déminéralisée pendant 1 heure et moyenne M9 pendant 1 h.
    2. Décongeler l'échantillon congelé tous les jours à la température ambiante pendant 5 min et inoculer un nouveau tube à essai avec un milieu M9 frais. Placer l'échantillon dans un incubateur agitateur à 37 ° C pendant une nuit.
    3. Diluer l'échantillon 10 fois microbienne avec un milieu M9 et le charger dans le dispositif microfluidique en faisant pression sur le récipient d'échantillon microbienne à 5 psi. Chargez ensuite le médicament TMPmoyen dans la puce en faisant pression sur le récipient milieu de médicament à 5 psi. Exécuter le mélange entre le microbe et de médicament par actionnement de la valve micromécanique entre les deux chambres de la puce microfluidique pendant 15 min.
    4. Placez la puce microfluidique dans l'incubateur de microscope monté sur le microscope inversé. Acquérir l'image de cellules dans la chambre de croissance à chaque heure pendant 8 heures avec la caméra CCD montée sur le microscope inversé.
    5. Utiliser le script de programme personnalisé pour calculer le nombre de cellules par l' intermédiaire d' un algorithme de seuil sur les données d'image de la cellule 18. A noter que les données de numéros de cellule sont typiquement en moyenne plus de trois chambres microfluidiques.

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Résultats

Le morbidostat décrit ci-dessus est schématisé sur la figure 1. Les opérations de morbidostat communes, y compris l' évolution expérimentale, test de sensibilité aux antibiotiques et la morphologie des cellules de vérification, ont été validées dans un E. culture coli MG1655 exposée au triméthoprime (TMP), un médicament antibiotique couramment utilisé 5,6. TMP induit par étapes augmente très distinctives dans la résistance aux médicaments...

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Discussion

Un dispositif de morbidostat faible encombrement à partir de composants à faible coût est démontrée. Les augmentations du niveau de résistance aux médicaments enregistrés par l'appareil sont identiques à ceux des rapports précédents 5. Conçu pour les études évolutives de la résistance aux médicaments, le dispositif est potentiellement applicable à beaucoup d'autres expériences. Tout d'abord, une base de données complète des mutations induites par les médicaments peut être établie pour un grand nom...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le professeur Sze-Bi Hsu et Mme Zhenzhen pour leurs discussions utiles et leur aide dans l’analyse théorique et la simulation numérique. Y. T. Y. tient à remercier le ministère des Sciences et de la Technologie sous les numéros de subvention MOST 103-2220-E-007-026 et MOST 104-2220-E-007-011, ainsi que l’Université nationale de Tsing Hua sous les numéros de subvention 103N2042E1, 104N2042E1 et 105N518CE1.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Incubateur ShakerEnvironnemental BioSanES-20
Arduino Leonardo BoardArduinoLeonardo
680 Ohm Résistance CarboneDigikeyRésistance Bias pour LED
100k Ohm Résistance CarboneDigikeyRésistance Bias pour phototransistor
940 nm Diode électroluminescentelumineuse ÉlectroniqueBIR-BM13E4G-2 Mesure dela densité optique
940 nm phototransistorKodenshi  ;ST-2L2BMesure de densité optique
Darlington paire IC ToshibaMouserULN2803APGce circuit intégré entraîne des micropompes et une unité d’agitation magnétique
Ventilateur brushless 5 V DCADDAAD0405LX-G70spécifications : tension d’alimentation 5 V et 80  ; maman; disponible www.jameco.com
Micropompe piézoélectriqueCurieJetPS15I-FT-5LPression > 3  ; kPa ; Débit >5 ml/min
Tygon 3350 TuningSaint GobainABW00001ID : 1/32 » OD : 3/32 » L :50'  ;
Barre d’agitation magnétiqueCOWIEforme conique dim : 10  ; mm x 4 mm
Flacon de verre à scintillation de 20 ml VerreDGSPyrex 28 mm (diamètre) x 61 mm (hauteur)
Porte-flaconFabriqué sur mesure en polyformaldéhyde  ;
SiliconeDow CorningSylgald 184utilisé pour sceller le flacon en verre
Bouteille moyenneVWR66022-065
Difco M9 sel minimal 5xBD
Acide cadaminomoyen BD
Glucosemoyen Sigma
Agar BatériologiqueOxoidpour plaque de gélose
Luria Bertani medium
Microscope inverséLeica Microsystems LeicaDMI-LEDutilisé pour la mesure microfluidique Utilisation Objectif 40X NA = 0,55
Microscope IncubateurLive Cell InstrumentCU-109utilisé pour la mesure microfluidique
ÉlectrovannesPneumadyneS10MM-31-12-3Normalement ouvert 1,3 Watt 12 Vdc
Carte d’interface USBHobby EngineeringModule d’E/S numériques USBIO24-R  ;pour la mesure microfluidique
Compresseur d’airRocker ScientificROCKER 440Source de pression pour microfluidiques ; Pression max. 80 psi
Raccords Luer-lock mâles à ValuePlastics.com cannelés 1/8 »MTLL230-1utilisés pour le contrôle microfluidique
Cannelures 1/8 » à 10-32 orificesfiletésValuePlastics.com B-1utilisés pour le contrôle microfluidique
Raccords Luer-lock femelles à orificefileté 10-32ValuePlastics.comKFTL-1utilisé pour le contrôle microfluidique
NPN darlington transistor 500 mA, 40  ; V (2N6427)DigiKey.com2N6427GOS-NDutilisé pour le contrôle microfluidique
10 kOhm, résistance à film de carbone, 0,25 WDigiKey.comP10KBACT-NDutilisé pour le contrôle microfluidique
Condensateur au tantale, 10  ; &mu ; F, 25 V, 10 %DigiKey.com478-1841-NDutilisé pour le contrôle microfluidique
Caméra CCD Andor Zyla4.2 Plus SCMOSutilisée pour l’imagerie microfluidique sur puce
Lecteur
à deux composants Silicone  ;MinuteiveRTV 615utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques
SU-8 photoresistMicrchemSU8 2015utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques
AZ4620 photoresistClariantAZ 4620utilisé pour la fabrication de puces microfluidiques
Nettoyant plasmaHarrick PlasmaPDC 32Gutilisé pour la fabrication de puces microfluidiques
Aiguille de seringue de calibre 20BDutilisé pour la fabrication de puces microfluidiques
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
ADN polyméraseToyoboKDO PlusAmplification PCR
TriméthoprimeSigma Lecteur de
plaquesBiotekSynergy H1 hybrid  ;Mesure de la résistance aux antibiotiques
LED de culture de plaque ELISA

Références

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R sistance aux antibiotiquesvolution bact riennemesure de la densit optiqueadministration par micro pomper sistance au trim thoprimeEscherichia coliplateforme microfluidiqueajustement de la concentration m dicamenteuse

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