A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Résumé

Nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable pour imiter le microenvironnement tumoral (TME). Le modèle consiste en une culture cellulaire mixte, permet la génération simplifiée de populations cellulaires individuelles hautement enrichies sans utiliser le marquage fluorescent ou le tri cellulaire, et permet d’étudier la communication intercellulaire au sein du TME dans des conditions normales ou de stress.

Résumé

Comprendre les interactions hétérotypiques précoces entre les cellules cancéreuses et le stroma non-cancéreuse environnante est important pour élucider les événements qui ont conduit à l'activation du stroma et l'établissement du microenvironnement de la tumeur (TME). Plusieurs in vitro et dans des modèles in vivo de TME ont été développés; cependant, en général, ces modèles ne permettent pas facilement l'isolement des populations de cellules individuelles, dans des conditions non-perturbation, pour une étude plus approfondie. Pour contourner cette difficulté, nous avons utilisé un modèle in vitro de TME en utilisant un substrat de croissance cellulaire consistant en un insert de membrane microporeuse perméable qui permet la génération simple de populations de cellules hautement enrichis cultivés intimement, mais séparément, de part et d' autre de la membrane de l'insert de coopération élargie -Culture fois. Grâce à l'utilisation de ce modèle, nous sommes capables de générer des fibroblastes associés au cancer grandement enrichi (CAF) populations de fibroblastes humains diploïdes normaux suivanteco-culture (120 h) avec des cellules fortement métastatiques de cancer du sein humain, sans l'utilisation d'un marquage fluorescent et / ou le tri cellulaire. En outre, en modulant la taille des pores de la pièce, on peut contrôler le mode de communication intercellulaire (par exemple, la communication de l' écart-jonction, les facteurs sécrétés) entre les deux populations de cellules hétérotypiques, ce qui permet d' étudier les mécanismes sous - jacents au développement du TME, y compris le rôle de l'écart-perméabilité de la jonction. Ce modèle est un outil précieux pour améliorer notre compréhension des événements initiaux conduisant au cancer-stroma initiation, l'évolution rapide de la TME, et l'effet de modulation du stroma sur les réponses des cellules cancéreuses à des agents thérapeutiques.

Introduction

Le microenvironnement de la tumeur (TME) est un système très complexe composé de cellules de carcinome qui co-exister et d'évoluer aux côtés de stroma hôte. Ce composant de stroma est typiquement constitué de fibroblastes, les myofibroblastes, les cellules endothéliales, les divers composants du système immunitaire, ainsi qu'une matrice extracellulaire ^1. Un constituant important, souvent la majorité de ce stroma, sont des fibroblastes activés, souvent appelé fibroblastes associés au cancer ou des fibroblastes de carcinome associées (CAF) ^2,3. A la différence, les fibroblastes normaux non activés, CAFs contribuent à l' initiation d&#....

Protocole

1. Préparation de milieux de culture et les cellules

1. Préparer 500 ml de milieu essentiel minimum d'Eagle additionné de 12,5% (vol / vol) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 2 mM de L-alanyl-L-glutamine et de 100 unités de pénicilline et 100 ug de streptomycine par ml.
   NOTE: Le milieu de croissance et le supplément (s) peut facilement être échangé pour les besoins d'autres souches de cellules ou de lignées cellulaires croissance.
2. Préparer 70 pi de milieu de culture cellulaire pour chaque pièce d'insertion (6 puits forme insertion): le milieu essentiel minimum d'Eagle additionné de 50% (vol / vol) de 2 mM de L....

Résultats

Ici , nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable à mettre au point un système cellulaire hétérotypique co-culture in vitro qui imite le microenvironnement de tumeur in vivo (figure 1). Ce système permet de deux populations de cellules différentes pour être cultivées sur chaque côté de la membrane poreuse de l'insert pendant des périodes de temps prolongées (jusqu'à 120 h, dans l'utilisation). Il est important que le systè.......

Discussion

Le protocole décrit ici est un simple, adaptable au mode opératoire in vitro (figure 1) qui utilise un insert de membrane microporeuse perméable pour générer des populations de cellules individuelles hautement enrichis à partir d' une co-culture de cellules hétérotypiques. De manière significative, le modèle est adapté pour étudier les différents modes de communication intercellulaire. Les étapes critiques comprennent la sélection de l'insert de taille de pore appropriée pour u.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) fibroblaste diploïde humain	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 lignée cellulaire d’adénocarcinome du sein	PerkinElmer	119261	Lignée parentale : ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP lignée cellulaire d’adénocarcinome du sein	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle’s minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Sérum fœtal bovin (FBS), qualifié	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Pénicilline Streptomycine Solution, 100x	Corning Cellgro	30-002-CL
Insert Transwell (i.e., insert de membrane microporeuse perméable) (0,4 &mu ; m pore)	Costar	3450
Transwell Insert (c’est-à-dire , insert de membrane microporeuse perméable) (1 &mu ; m pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (c’est-à-dire , insert de membrane microporeuse perméable) (3 &mu ; Costar		3452
Plaque de culture 6 puits	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 CellStar		658 170
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 1x	Corning Cellgro	21-040-CV	sans calcium ni magnésium
0,25 % (vol/vol) Trypsine, 2,21 mM EDTA, 1x	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 ml Tube à centrifuger	CellTreat	229411
35 mm x 10 mm Plat de culture cellulaire	Greiner bio-one	627 160
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Pour la microscopie immunofluorescente
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence - 1:5 000
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence - 1:2 000
Albumine sérique bovine - Fraction V	Rockland	BSA-50	Sans immunoglobulines ni protéases
16 % (poids/vol) Solution de formaldéhyde	ThermoFisher Scientific	28908	Diluer à 4 % avec 1x verre de protection PBS
Premium (22 mm x 22 mm n° 1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
Réactif anti-décoloration SlowFade Gold avec DAPI	Invitrogen	S36938
Nom	Entreprise	>Numéro de catalogue	Comments
Pour l’analyse cytométrique en flux
Calcein,	Sondes moléculaires	C3100MP
la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot - 1:1,000
Tween-20	BioRad	170-6531
Membrane nitrocellulosique (0,2 &mu ; m)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	BioRad	161-0302
Désoxycholate de sodium monohydraté (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
Solution d’acrylamide/Bis à 30 %, 37,5:1	BioRad	161-0158

AM