Method Article

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

DOI:

10.3791/54429

⸱

September 20th, 2016

 ,  , 
1Department of Radiology, New Jersey Medical School, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable pour imiter le microenvironnement tumoral (TME). Le modèle consiste en une culture cellulaire mixte, permet la génération simplifiée de populations cellulaires individuelles hautement enrichies sans utiliser le marquage fluorescent ou le tri cellulaire, et permet d’étudier la communication intercellulaire au sein du TME dans des conditions normales ou de stress.

Abstract

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Comprendre les interactions hétérotypiques précoces entre les cellules cancéreuses et le stroma non-cancéreuse environnante est important pour élucider les événements qui ont conduit à l'activation du stroma et l'établissement du microenvironnement de la tumeur (TME). Plusieurs in vitro et dans des modèles in vivo de TME ont été développés; cependant, en général, ces modèles ne permettent pas facilement l'isolement des populations de cellules individuelles, dans des conditions non-perturbation, pour une étude plus approfondie. Pour contourner cette difficulté, nous avons utilisé un modèle in vitro de TME en utilisant un substrat de croissance cellulaire consistant en un insert de membrane microporeuse perméable qui permet la génération simple de populations de cellules hautement enrichis cultivés intimement, mais séparément, de part et d' autre de la membrane de l'insert de coopération élargie -Culture fois. Grâce à l'utilisation de ce modèle, nous sommes capables de générer des fibroblastes associés au cancer grandement enrichi (CAF) populations de fibroblastes humains diploïdes normaux suivanteco-culture (120 h) avec des cellules fortement métastatiques de cancer du sein humain, sans l'utilisation d'un marquage fluorescent et / ou le tri cellulaire. En outre, en modulant la taille des pores de la pièce, on peut contrôler le mode de communication intercellulaire (par exemple, la communication de l' écart-jonction, les facteurs sécrétés) entre les deux populations de cellules hétérotypiques, ce qui permet d' étudier les mécanismes sous - jacents au développement du TME, y compris le rôle de l'écart-perméabilité de la jonction. Ce modèle est un outil précieux pour améliorer notre compréhension des événements initiaux conduisant au cancer-stroma initiation, l'évolution rapide de la TME, et l'effet de modulation du stroma sur les réponses des cellules cancéreuses à des agents thérapeutiques.

Introduction

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Le microenvironnement de la tumeur (TME) est un système très complexe composé de cellules de carcinome qui co-exister et d'évoluer aux côtés de stroma hôte. Ce composant de stroma est typiquement constitué de fibroblastes, les myofibroblastes, les cellules endothéliales, les divers composants du système immunitaire, ainsi qu'une matrice extracellulaire 1. Un constituant important, souvent la majorité de ce stroma, sont des fibroblastes activés, souvent appelé fibroblastes associés au cancer ou des fibroblastes de carcinome associées (CAF) 2,3. A la différence, les fibroblastes normaux non activés, CAFs contribuent à l' initiation d' une tumeur, la progression, l' angiogénèse, l' invasion, la métastase et la récurrence 4-11 dans une grande variété de cancers, y compris du sein, de la prostate, du poumon, du pancréas, de la peau, du côlon, de l' œsophage, et ovaire 5,6,12-17. Pourtant, la nature exacte de la contribution de la CAF à travers la pathogenèse du cancer reste mal défini. En outre, la preuve clinique a démontré une valeur pronostique de CAFs, Corréler leur présence à des tumeurs malignes de haut grade, échec thérapeutique, et la mauvaise 10,18,19 globale de pronostic.

De toute évidence, l'amélioration de notre compréhension des événements initiateurs dans le développement de la CAF, ainsi que les communications intercellulaires médiatrices leur rôle au sein de la TME, peuvent fournir de nouvelles cibles thérapeutiques intéressantes et des stratégies améliorées qui pourraient améliorer les résultats des patients. Pour atteindre cet objectif, plusieurs in vivo et in vitro , des modèles ont été développés. Alors que les approches in vivo sont plus représentatives de la TME de patients, ils possèdent des limitations, y compris l'immense complexité et l' hétérogénéité à l'intérieur et entre les tumeurs. En outre, des échantillons de tumeurs provenant de sujets humains représentent souvent très développés TME et ne permettent pas une bonne compréhension des événements initiateurs TME. Des études expérimentales chez l'animal offrent certains avantages, mais la généralisation des données animales aux humains doit être fait avec prudence en raison des différences de phylogie entre les humains et les animaux tels que les rongeurs (par exemple, la chimie thiol 20, le taux métabolique 21, la tolérance au stress 22, etc.). En outre, contrairement à la population humaine, qui est génétiquement hétérogène dans la nature, les animaux de laboratoire sont généralement élevés jusqu'à homogénéité. En outre, il est souvent difficile d'examiner les variations physiologiques transitoires et des modifications du phénotype des cellules, ainsi que pour contrôler les paramètres expérimentaux spécifiques en utilisant des animaux tels que les rongeurs. Ainsi, in vitro 2 et 3 dimensions (2D et 3D) des modèles de culture de tissus sont fréquemment utilisés pour faire avancer la compréhension de base du développement TME. En dépit de leur manque d'une représentation exacte de la complexité des systèmes in vivo, ces modèles offrent des avantages qui facilitent grandement les enquêtes mécanistes. In vitro modèles permettent une analyse plus simplifiée, ciblée et rentable de la TME, de sorte que statistiquement significative les données peuvent être généréescellules libres des variations systémiques qui surviennent chez les animaux.

Il existe plusieurs variétés de systèmes in vitro. Les deux TME modèles les plus couramment utilisés in vitro consistent en monocouche mixte ou des cultures de cellules sphéroïdes. Les deux méthodes de culture sont avantageux pour les études de base des interactions intercellulaires (par exemple, les cellules normales avec des cellules tumorales) et pour l'analyse des divers changements de phénotype cellulaire spécifiques TME (par exemple, l' apparition de fibroblastes associés au cancer de fibroblastes normaux). En outre, les sphéroïdes sont capables de créer une structure de TME tissu ressemblant plus réfléchi, et peuvent être représentatifs de l' hétérogénéité tumorale 23. Cependant sphéroïdes produisent souvent très différents gradients de tension d'oxygène à travers les couches, ce qui peut compliquer les conclusions expérimentales 24. Malheureusement, les deux modèles sont extrêmement limitées dans leur capacité à isoler des populations cellulaires pures pour une caractérisation plus poussée et l'étude suivante coopérationCulture. Pour ce faire, il faudrait au moins un type de cellule à être marqués par fluorescence ou marqué avec un fabricant identifiant, puis en soumettant le mélange co-culture extensive de traitement et de tri cellulaire pour séparer les populations de cellules. Alors un trieur de cellules est capable d'isoler une population de cellules plutôt pure, il faut être conscient du stress cellulaire et la contamination microbienne risques potentiels 25.

Pour faciliter la compréhension de la communication intercellulaire, de grands efforts ont été consacrés au développement et l' optimisation des systèmes in vitro qui imitent étroitement l'environnement in vivo, tout en permettant une approche simplifiée. Un tel outil est l'insert microporeux perméable, un substrat de membrane qui a été développé en 1953 26 et ensuite adapté pour des applications diverses et des études (par exemple, la polarité cellulaire 27, endocytose 28, le transport de la drogue 29, la modélisation des tissus 30, FERTilization 31, effet bystander 32,33, etc.). Ce système permet la croissance des cellules in vivo avec anatomique -like et la différenciation fonctionnelle, ainsi que l' expression d' un grand nombre in vivo , les marqueurs 34,35 qui ne sont pas observées lorsqu'il est cultivé sur plasticware imperméable. En outre, la membrane poreuse extrêmement mince (10 um d' épaisseur) permet la diffusion rapide des molécules et des temps d'équilibrage, qui simule l'environnement in vivo et permet le fonctionnement cellulaire indépendante à la fois les domaines de la cellule apicale et basolatérale. Un avantage supplémentaire de l'utilité de l'insert comme un système TME est la séparation physique des deux populations de cellules cultivées hétérotypiques de part et d'autre de la membrane dans les mêmes conditions environnementales, tout en maintenant les différents modes de communication intercellulaire à travers les pores de la membrane. Bien qu'ils soient séparés physiquement, les deux populations de cellules sont métaboliquement couplés par l'intermédiaire d'éléments sécrétées et, dedécrit ici, aussi, par la voie de l'écart-jonctionnel. En outre, en maintenant les plaquettes in vivo à la pression d'oxygène partielle (PO 2), le modèle réduit les complications des gradients d'oxygène et chimiques observés dans d' autres systèmes. Au contraire, elle augmente la compréhension des mécanismes naturels de contrôle TME. En particulier, les deux populations de cellules peuvent être facilement isolées avec une pureté élevée, sans marquage fluorescent et / ou le tri cellulaire après une longue période de co-culture.

Nous décrivons ici un protocole de TME in vitro comprenant des cellules de carcinome du sein humain et des fibroblastes humains cultivés, respectivement, de part et d' autre d'un insert de membrane microporeuse perméable, mais encore dans une communication bidirectionnelle continue à travers les pores de la membrane. Nous montrons que l'utilisation de membranes avec différentes tailles de pores, la contribution d'un type spécifique de la communication intercellulaire (par exemple, des facteurs sécrétés par rapport à jonctions gap) pour le développementdu TME peut être étudiée.

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Protocol

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1. Préparation de milieux de culture et les cellules

  1. Préparer 500 ml de milieu essentiel minimum d'Eagle additionné de 12,5% (vol / vol) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 2 mM de L-alanyl-L-glutamine et de 100 unités de pénicilline et 100 ug de streptomycine par ml.
    NOTE: Le milieu de croissance et le supplément (s) peut facilement être échangé pour les besoins d'autres souches de cellules ou de lignées cellulaires croissance.
  2. Préparer 70 pi de milieu de culture cellulaire pour chaque pièce d'insertion (6 puits forme insertion): le milieu essentiel minimum d'Eagle additionné de 50% (vol / vol) de 2 mM de L-alanyl-L-glutamine inactivé par la chaleur de FBS, et 100 unités de la pénicilline et 100 ug de streptomycine par ml.
    NOTE: Le milieu est supplémenté avec 50% de FBS pour faciliter la fixation des cellules sur le côté inférieur ( à savoir, inférieure) de l'insert. Le milieu de croissance et le supplément (s) peuvent être facilement échangés pour les besoins d'autres souches de cellules ou de lignées cellulaires croissance.
  3. Préparer une suspension cellulaire des cellules destinées à être plaquées sur la face inférieure de l'insert.
    REMARQUE: Ici, les résultats ont été obtenus en utilisant AG1522 des fibroblastes humains normaux cultivés dans des flacons de 75 cm2 de culture cellulaire, et ces cellules vont donc être l'objet de la description de la préparation de la suspension cellulaire.
  4. Pour recueillir les cellules, éliminer le milieu de croissance et laver les 2x monocouches de cellules avec 5 ml 1x tampon phosphate salin (PBS).
  5. Retirer le PBS et s'étendre 1 ml de 0,25% (volume / volume) de trypsine à 2,21 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), préchauffée à la température ambiante (RT) sur les cellules pendant 2 min à TA (température ambiante).
  6. Étancher l'activité de la trypsine avec 9 ml de milieu de croissance complet (préparé à l'étape 1.1) et recueillir les cellules par pipetage doucement la suspension de cellules sur la surface du flacon 10x.
  7. Déterminer la concentration des cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur électronique et le volume de la pipette la suspension de cellules qui Provid'Aire 250.000 cellules par insert dans un tube de 15 ml de centrifugeuse stérile.
  8. Sédimenter la suspension cellulaire par centrifugation (800 x g, 2 minutes). Suspendre le culot cellulaire avec un milieu de croissance (préparé à l'étape 1.2) pour créer une concentration de 250.000 cellules par 70 ul.
    REMARQUE: la culture de cellules dans des inserts perméables de la membrane microporeuse est basée sur des substrats 2D, l'ensemencement des cellules est effectuée de manière similaire, excepté les cellules doivent d'abord être mises en suspension dans un milieu contenant 50% (volume / volume) de FBS pour faciliter la fixation.

2. Préparation des inserts

NOTE: Afin d'assurer des conditions stériles, le travail dans une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire dédié à la culture cellulaire.

  1. Sélectionnez inserts avec une taille de pores de la membrane de 0,4 pm, 1 pm, ou 3 pm (déterminé par l'intérêt (s) expérimentale, comme la taille des pores peuvent être utilisés pour explorer le rôle des différents modes de communication intercellulaire).
    NOTE: Le 0,4 um pore est small suffit pour limiter la formation des jonctions communicantes entre les cellules fonctionnelles de part et d'autre de la membrane d'insert et peut être utilisée pour étudier la communication intercellulaire par des facteurs sécrétés. Considérant que, les 1 pm et 3 pm pores sont suffisamment grands pour permettre la formation de jonctions lacunaires fonctionnelles et peuvent être utilisés pour étudier la communication intercellulaire par les deux jonctions lacunaires et les facteurs sécrétés.
  2. Retirer les inserts individuels de l'emballage et la placer dans un plat multi-puits de taille égale.
    NOTE: Les inserts sont disponibles avec différentes zones de surface de la membrane pour répondre aux besoins spécifiques de l' application (par exemple, 6 puits, inserts 12 puits et 24 puits.). Ici, les résultats ont été obtenus en utilisant l'insert de 6 puits, et seront donc l'objet de la description du modèle.
  3. Couvrir le plat contenant les inserts avec le couvercle plat. Tenir le plat multi-puits avec les deux mains, retourner doucement le plat de telle sorte que les fonds d'insertion (c. - dessous) sont maintenant tournés vers le haut.
  4. Retirer ee fond de la boîte à puits multiples, exposant ainsi la face inférieure des inserts. Travailler avec un insert à la fois, utiliser une paire de pinces stériles et tenir doucement l'insert en place. Avec la main libre, utiliser une pipette avec une pointe à large ouverture pour attirer 70 ul de la suspension cellulaire (préparé dans les étapes 1,3-1,8), contenant 250.000 cellules.
  5. Pour plaquer les cellules, placez la pointe de la pipette doucement sur le centre de la membrane de l'insert, et pipette lentement les 70 pi de suspension cellulaire tout en se déplaçant lentement la pointe de la pipette autour de la surface de la membrane. Veillez à ne pas étendre la pointe de la pipette et la suspension cellulaire au bord de l'insert.
    REMARQUE: toucher le bord de l'insert pourrait entraîner une perte de tension capillaire de la suspension cellulaire conduisant à des cellules de séchage pendant la fixation.
  6. Répétez l'opération pour inserts restants, avec soin exercé de ne pas travailler directement sur les inserts exposés pour éviter toute contamination microbienne.
  7. revenir doucement le multi-puitsfond plat pour couvrir les inserts. Garder le plat avec inserts inversé, incuber dans une atmosphère d'air humidifié de 5% (volume / volume) de CO 2 à 37 ° C pendant 30-45 min.
    NOTE: Si la suspension de cellules sur les contacts d'insertion Le fond du puits, soulevez soigneusement le fond plat et reposer sur le bord de la partie supérieure de plat, de sorte qu'il forme un léger angle et crée une plus grande séparation entre la surface du plat et la face inférieure des inserts (où les cellules sont ensemencées). Cela va empêcher les cellules de se fixer à la surface des puits à la place de l'insert.
  8. Après le temps d'incubation de 30-45 min, retirez délicatement le plat contenant les inserts et le placer dans l'enceinte de sécurité biologique à flux laminaire.
  9. Avec les deux mains et en gardant le couvercle plat serré, légèrement ré-inverser le plat de telle sorte que la face inférieure des inserts contenant les cellules attachées maintenant vers le bas.
  10. Lentement et soigneusement ajouter 2 ml (1 ml pour 3 um pore inserts pour éviter migratisur des cellules à travers les pores d'insertion) de milieu complet préchauffé (voir étape 1.1) à chaque puits, de sorte que le fond de l'insert est immergé.
  11. Après avoir ajouté un milieu de croissance dans tous les puits contenant des inserts, placez le plat de nouveau dans l'incubateur humidifié.
  12. Laisser les inserts de rester intact dans l'incubateur pendant 48 heures. Au bout de 48 h, alimenter les cellules en aspirant les 2 ml de milieu à partir du fond du puits et en ajoutant 2 ml de milieu de croissance frais.
  13. Après avoir ajouté du milieu frais au fond du puits, semences 1 ml de la seconde suspension de population cellulaire (~ 250.000 cellules / ml) sur la face supérieure de l'insert, qui a déjà la première population de cellules en croissance sur le côté inférieur (pour ceux-ci expériences, AG1522 (contrôle) de cellules ou de cellules cancéreuses (expérimental) sont plaquées sur le dessus des inserts, qui ont déjà cellules AG1522, destiné à devenir CAFs, poussant sur le côté inférieur des plaquettes). Placer le plat de nouveau dans l'incubateur humidifié.
    NOTE: Si le travailtion avec des cellules qui ne se conforment pas bien au fond de l'insert, ces cellules peuvent être cultivées en variante sur la face supérieure de l'insert.
  14. Changer le milieu à 24, 72 et 96 heures après l'ensemencement de la seconde population de cellules sur le côté supérieur de la plaquette par aspiration du milieu de la partie supérieure de l'insert et le fond du puits. ajouter doucement 1 ml de milieu frais à la partie supérieure de l'insert et 2 ml au fond du puits. Laisser les deux populations cellulaires restent dans la co-culture de part et d'autre de la membrane microporeuse perméable à l'insert pendant 120 heures.

3. La collecte de cellules à partir d'insertion par trypsinisation

NOTE: En plus de la facilité d'obtention de populations cellulaires enrichies, le modèle de TME d'insertion permet également de traitements expérimentaux similaires (par exemple, l' incubation avec des produits chimiques, l' exposition à des conditions d'oxygène qui sont au- dessus ou au- dessous de l' atmosphère ambiante, un traitement par ionisation, etc.) comme autres in vitro TME modèles de co-culture. En outre, le substrat de co-culture insert perméable peut être analysée par des techniques déjà mises au point pour les modèles de culture de tissus 2D standard. Par exemple, les cellules peuvent être récoltées à partir de chaque côté de la membrane d'insert pour obtenir des populations hautement enrichi, qui peut ensuite être utilisé pour l' analyse des paramètres (par exemple, in situ immunodétection, Western Blot in) ou propagées par des expériences ultérieures 36.

  1. Pour recueillir les cellules, retirez le cache du milieu de croissance et le placer dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm contenant 1 ml de PBS. Laver le fond et les côtés supérieurs des 1x insert avec 1 ml de PBS.
  2. Retirer le PBS et on ajoute 200 ul de 0,25% (volume / volume) de trypsine avec de l'EDTA 2,21 mM, préchauffée à la température ambiante.
    1. Si la collecte des cellules cultivées sur le côté inférieur de l'insert, placer la solution de trypsine dans la cuvette de 35 mm et placer délicatement le fond de l'insert dans la solution de trypsine pendant 2 minutes à la température ambiante.
    2. Si la collecte de la cellules cultivées sur le côté supérieur de l'insert, placer l'insert dans une boîte de 35 mm et d'ajouter la solution de trypsine à la partie supérieure de l'insert et incuber pendant 2 minutes à température ambiante.
  3. Étancher l'activité de la trypsine par addition de 800 ul de milieu de croissance complet.
    1. Si la collecte des cellules cultivées sur le fond de l'insert, d'ajouter au milieu de croissance au mm plat 35 et de recueillir les cellules par pipetage de 1 ml de suspension cellulaire sur la surface de l'insert de 10x, à l'insert étant maintenu à une légère l'angle, de telle sorte que la suspension de cellules à recueillir dans le récipient.
    2. Si la collecte des cellules à partir de la face supérieure de l'insert, d'ajouter au milieu de croissance sur la face supérieure et la pipette doucement les 1 ml de suspension cellulaire sur la surface de l'insert de 10x.

4. Caractérisation des cellules Pureté par cytométrie de flux

NOTE: Pour caractériser la capacité des inserts perméables à membrane microporeuse pour maintenir la pureté de til deux populations cellulaires (ie, haut et bas) pour un maximum de 120 heures, les sections 1-3 ont été réalisées, avec la protéine fluorescente verte (GFP) -tagged MDA-MB-231 cellules étant plaqué sur la face supérieure de l'insert, et AG1522 cellules non étiquetées GFP étant plaquées sur la face inférieure de 0,4 μm- 1 μm- ou 3 um inserts de pores.

  1. Une fois que les cellules provenant du côté inférieur de l'insert ont été collectés (procédure décrite dans la section 3), un culot de la suspension cellulaire par centrifugation (500 g, 30 s).
  2. Eliminer le surnageant et mettre en suspension le culot cellulaire dans 400 pi de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) additionnée de 1% (volume / volume) de FBS.
  3. Effectuer une analyse cytométrique sur un cytomètre de flux équipé d'un laser à 488 nm pour exciter la GFP et un filtre passe - bande de 530/30 à détecter l' émission de photons 37 GFP.
  4. Pour des fins d'identification de cellule, utiliser des populations de cellules de contrôle AG1522 pour ajuster l'avant et des tensions de dispersion latérale sur la cytométrie de flux. Réglerla tension de la chaîne de GFP pour définir la valeur d'autofluorescence cellulaire comme le seuil de détection plus faible pour le signal de la GFP.
  5. Déterminer gating seuil en utilisant des cellules de contrôle. Évaluer la pureté de chaque population de cellules basée sur la présence de cellules GFP-positives par rapport au témoin.
    NOTE: Une population pure serait le reflet de pas de cellules GPF-positifs détectés.

5. Caractérisation des cellules par In Situ immunofluorescence

  1. Après trypsinisation des cellules de l'insert (voir la section 3), recueillir des cellules, plaque 5 x 10 4 cellules dans 250 ul de milieu de croissance (voir l' étape 1.1) sur des lamelles de verre stériles, et permettre de fixer pendant 1 h dans une atmosphère d'air humidifiée 5% (volume / volume) de CO 2 à 37 ° C incubateur.
  2. A la fin de l'incubation, retirez délicatement le plat contenant la lamelle et la placer dans l'enceinte de sécurité biologique à flux laminaire.
  3. Ajouter avec précaution 2 ml de milieu complet préchauffé (voir étape1.1) à chaque boîte, de sorte que la lamelle couvre-objet est immergé.
  4. Après avoir ajouté un milieu de croissance pour tous les plats contenant des lamelles, retourner les plats à une atmosphère d'air humidifiée de 5% (volume / volume) de CO 2 à 37 ° C dans un incubateur pendant 48 heures.
  5. Après l'incubation de 48 heures, laver les échantillons 3x avec PBS et fixer avec 4% (poids / volume) de formaldéhyde dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
  6. Rinçage 5x avec du tampon Tris Buffered Saline (TBS: 50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, NaCl 150 mM), puis perméabiliser avec 0,25% (volume / volume) de Triton X-100, 0,1% (poids / volume) de saponine pendant 5 min à TA.
  7. Bloquer non spécifique des sites de liaison à 2% (vol / vol) de sérum de chèvre normal (NGS), 1% (poids / volume) de sérum-albumine bovine (BSA), 0,1% (volume / volume) de Triton X-100 dans du TBS (blocage solution) pendant 1 heure à température ambiante.
  8. Laisser incuber avec l'anticorps primaire (anti-cavéoline 1 (CAV1), 1: 1000) dans une solution de blocage à 4 ° C jusqu'au lendemain.
  9. Laver les anticorps primaires non liés (3x, 5 min / lavage) avec 0,2% NGS (vol / vol), 1% (poids / volume) de BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 dans du TBS (solution de lavage).
  10. Incuber avec l'anticorps secondaire à température ambiante pendant 1 h dans une solution de blocage (voir section 5.4).
  11. Laver l'anticorps secondaire non lié (3x, 5 min / lavage) avec une solution de lavage (voir étape 5.6).
  12. Mont lamelles de sur une lame avec un milieu de montage anti-fade contenant 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), et sceller avec du vernis à ongles.
  13. Observer les cellules en utilisant un objectif de grossissement d'huile 63X sur un microscope inversé équipé d'une source de lumière externe pour l'excitation de fluorescence et de capturer des images à l'aide d'un appareil photo numérique associée pour une analyse ultérieure.

6. Caractérisation des cellules par Western Blot

REMARQUE: La procédure de Western blot est décrit ailleurs 38. Un bref aperçu est décrit ici:

  1. Après le détachement des cellules de l'insert par trypsinisation (voir section 3), sédimenter la suspension cellulaire par centrifugation (500 g, 30 sec).
  2. Retirer le surnageant et suspendre les 2x à granulés de cellules avec 100 ul de PBS.
  3. Éliminer les cellules du surnageant et lysent dans 50 pl d'essai de radioimmunoprécipitation modifié (RIPA) tampon (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 à 1% (volume / volume), le désoxycholate de sodium monohydraté (DOC) à 0,5% (volume / volume), dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,1% (volume / volume)) contenant de la protéase et un inhibiteur de la phosphatase cocktail.
  4. Incuber pendant 20 min sur la glace et centrifuger à 19000 g pendant 15 min à 4 ° C.
  5. Déterminer la concentration de protéines dans le surnageant en utilisant un dosage de la densité optique de la protéine, compatible avec les détergents dans le tampon RIPA.
  6. les protéines séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et de dodécyle de sodium (SDS-PAGE) et électroblot sur une membrane de 0,2 um de nitrocellulose.
  7. Incuber les membranes dans du TBS contenant 0,1% (vol / vol) de Tween-20 (TBST) et 4% (poids / volume) de lait écrémé (solution de blocage) pendant 60 minutes et réagir avec l'anticorps primaire à 4 ° C pendant une nuit (anti-CAV1, 1: 1000).
  8. Laver 3x membranaires avec TBST à température ambiante (5 min / lavage).
  9. Incuber les membranes pendant 30 min dans une solution de blocage contenant un anticorps secondaire anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (1: 5000).
  10. Laver 3x membranaires avec TBST à température ambiante (5 min / lavage).
  11. Visualisez les produits de réaction par chimiluminescence en utilisant un système de détection Western blot.

7. Caractérisation de la communication intercellulaire par cytométrie de flux

NOTE: Pour caractériser la capacité d' adaptation de la membrane microporeuse perméable insère pour examiner différents modes de communication intercellulaire (par exemple, des facteurs sécrétés, jonctions gap). 1-2.12 sections ont été réalisées avec des cellules non fluorescentes AG1522 étant plaquées sur la face inférieure de 0,4 μm- 1 μm- ou inserts 3 um pores.

  1. Culture non-étiquetés cellules AG1522 dans un plat de 35 mm à 90% de confluence en utilisant du milieu décrit dans la section 1.1.
  2. RInse cellules 1x avec 1 ml de HBSS.
  3. Les cellules de charge avec calcéine AM par incubation des cellules dans HBSS contenant 30 uM de calcéine AM.
  4. Incuber pendant 15 min dans une atmosphère d'air humidifiée à 5% (vol / vol) de CO2 à 37 ° C.
  5. On lave les cellules 2 fois avec 1 ml de HBSS.
  6. Trypsiniser les cellules en ajoutant une solution de 200 ul de 0,25% (volume / volume) de trypsine avec de l'EDTA 2,21 mM, pendant 2 minutes à la température ambiante.
  7. Étancher l'activité de la trypsine par addition de 800 ul de milieu complet contenant 12,5% (volume / volume) de FBS.
  8. Amener les cellules en suspension par pipetage répété.
  9. Déterminer la concentration des cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur électronique et la plaque de 250.000 cellules chargées de calcéine AM à la face supérieure d'inserts qui ont déjà AG1522 cellules qui poussent sur le côté inférieur.
  10. Incuber les inserts dans une atmosphère d'air humidifiée à 5% de CO2 à 37 ° C , pendant 6 heures.
  11. Après 6 heures, recueillir les cellules à partir de la face inférieure des inserts, tels que décritsdans la section 3.
  12. Sédimenter la suspension cellulaire par centrifugation (500 g, 30 s).
  13. Eliminer le surnageant et mettre en suspension le culot cellulaire dans 400 pi de HBSS additionné de 1% (volume / volume) de FBS.
  14. Analyser les cellules sur un cytomètre équipé d'un laser et le filtre capable d'exciter et détecter l'émission de calcéine (496 nm et 516 nm, respectivement), selon le protocole du fabricant.
  15. Pour des fins d'identification de cellule, utiliser une population de cellules de contrôle unstained AG1522 pour ajuster l'avant et des tensions de dispersion latérale sur la cytométrie de flux. Régler la tension de canal calcéine pour définir la valeur d'autofluorescence cellulaire comme le seuil de détection plus faible pour le signal calcéine.
  16. Déterminer la limite supérieure de seuil en utilisant des cellules de contrôle calcéine-chargés. Évaluer la communication pour chaque insertion de cellules basée sur la présence de cellules calcéine positives par rapport au témoin.

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Results

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Ici , nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable à mettre au point un système cellulaire hétérotypique co-culture in vitro qui imite le microenvironnement de tumeur in vivo (figure 1). Ce système permet de deux populations de cellules différentes pour être cultivées sur chaque côté de la membrane poreuse de l'insert pendant des périodes de temps prolongées (jusqu'à 120 h, dans l'utilisation). Il est important que le système est capab...

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Discussion

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Le protocole décrit ici est un simple, adaptable au mode opératoire in vitro (figure 1) qui utilise un insert de membrane microporeuse perméable pour générer des populations de cellules individuelles hautement enrichis à partir d' une co-culture de cellules hétérotypiques. De manière significative, le modèle est adapté pour étudier les différents modes de communication intercellulaire. Les étapes critiques comprennent la sélection de l'insert de taille de pore appropriée pour u...

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts ou contradictoires.

Acknowledgements

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Cette recherche a été financée par des subventions de la Commission du New Jersey sur la recherche sur le cancer (bourse pré-doctorale DFHS13PPCO17), des National Institutes of Health (CA049062) et de la National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) fibroblaste diploïde humainCoriell107661Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 lignée cellulaire d’adénocarcinome du seinPerkinElmer119261Lignée parentale : ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP lignée cellulaire d’adénocarcinome du seinCell BiolabsAKR-201
Eagle’s minimal essential medium (MEM)Corning Cellgro15-010-CV
Sérum fœtal bovin (FBS), qualifiéSigmaF6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine)Corning Cellgro25-015-Cl
Pénicilline Streptomycine Solution, 100xCorning Cellgro30-002-CL
Insert Transwell (i.e., insert de membrane microporeuse perméable) (0,4 &mu ; m pore)Costar3450
Transwell Insert (c’est-à-dire , insert de membrane microporeuse perméable) (1 &mu ; m pore)Greiner bio-one657610
Transwell Insert (c’est-à-dire , insert de membrane microporeuse perméable) (3 &mu ; Costar3452
Plaque de culture 6 puitsGreiner Bio-One Cellstar657160-01
75 cm2 CellStar658 170
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 1xCorning Cellgro21-040-CVsans calcium ni magnésium
0,25 % (vol/vol) Trypsine, 2,21 mM EDTA, 1xCorning Cellgro25-053-Cl
15 ml Tube à centrifugerCellTreat229411
35 mm x 10 mm Plat de culture cellulaireGreiner bio-one627 160
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Pour la microscopie immunofluorescente
Mouse anti-Caveolin 1BD Transduction Laboratories610406In situ Immunofluorescence - 1:5 000
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11029In situ Immunofluorescence - 1:2 000
Albumine sérique bovine - Fraction VRocklandBSA-50Sans immunoglobulines ni protéases
16 % (poids/vol) Solution de formaldéhydeThermoFisher Scientific28908Diluer à 4 % avec 1x verre de protection PBS
Premium (22 mm x 22 mm n° 1)Fisher12548B
Triton X-100SigmaT8787-50ML
Réactif anti-décoloration SlowFade Gold avec DAPIInvitrogenS36938
NomEntreprise>Numéro de catalogueComments
Pour l’analyse cytométrique en flux
Calcein,Sondes moléculairesC3100MP
la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)Gibco14025-076
NameCompanyNuméro de catalogueComments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1BD Transduction Laboratories610406Western Blot - 1:1,000
Tween-20BioRad170-6531
Membrane nitrocellulosique (0,2 &mu ; m)BioRad162-0112
Western Lightning Plus-ECLPerkinElmerNEL104001EA
BioRad DC Protein AssayBioRad500-0116
Dodécylsulfate de sodium (SDS)BioRad161-0302
Désoxycholate de sodium monohydraté (DOC)SigmaD5670
IGEPAL CA-630 (NP40)SigmaI8896
Solution d’acrylamide/Bis à 30 %, 37,5:1BioRad161-0158
AM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
  3. Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
  4. Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
  5. Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
  6. Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  7. Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
  8. Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
  9. Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  10. Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
  11. Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
  12. Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  13. Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  14. Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
  15. De Wever, O., Nguyen, Q. -D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
  16. Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
  17. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
  18. Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
  19. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
  20. Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
  21. Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
  22. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  23. Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
  24. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  25. Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
  26. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  27. Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407(2009).
  28. Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
  29. Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638(2013).
  30. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
  31. Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387(2010).
  32. Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
  33. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540(2011).
  34. Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
  35. Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
  36. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
  37. Ducrest, A. -L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65(2002).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  39. Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
  40. Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
  41. Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
  42. Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102(2013).
  43. Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
  44. Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
  45. Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
  46. Tyan, S. -W., Kuo, W. -H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313(2011).
  47. Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
  48. Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310(2013).
  49. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
  50. Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
  51. Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).

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