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Article de méthode

Murine Flexor Tendon blessures et chirurgie de réparation

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⸱

DOI :

10.3791/54433

⸱

19 septembre 2016

 , 
1Center for Musculoskeletal Research, Department of Orthopaedics & Rehabilitation, University of Rochester Medical Center

Dans cet article

Résumé

tendons fléchisseurs de la main sont souvent blessés, conduisant à la fonction de la main avec facultés affaiblies. Cependant, la réponse de cicatrisation du tissu cicatriciel ne sont pas bien caractérisés. Un modèle murin de tendon fléchisseur de guérison est démontré ici. Ce modèle peut améliorer la compréhension globale du processus de guérison et d'évaluer les approches thérapeutiques pour améliorer la guérison.

Résumé

Tendon relie le muscle squelettique et de l'os, ce qui facilite le mouvement de la quasi-totalité du corps. Dans la main, les tendons fléchisseurs (FTS) permettent la flexion des doigts et de la fonction générale de la main. Les blessures aux FTs sont communs, et la guérison satisfaisante est souvent altérée en raison de tissus et des adhérences entre le tendon et les tissus environnants cicatrice en excès. Cependant, on sait peu sur les composants moléculaires et cellulaires de FT réparation. À cette fin, un modèle murin de FT réparation qui récapitule de nombreux aspects de la guérison chez les humains, y compris les troubles de l'amplitude des mouvements et une diminution des propriétés mécaniques, a été développé et décrit précédemment. Voici une démonstration en profondeur de cette intervention chirurgicale est prévue, impliquant transection et réparation ultérieure du tendon fléchisseur des orteils (FDL) dans la patte arrière murin. Cette technique peut être utilisée pour effectuer une analyse de la lignée des différents types de cellules, d'évaluer les effets du gain ou de la perte du gène de fonction, et de tester l'efficacité des interventions pharmacologiques dans le processus de guérison. Cependant, il y a deux principales limites à ce modèle: i) le tendon FDL dans la partie médiane de la patte arrière murin, où le transection et la réparation se produisent, ne sont pas entouré par une gaine synoviale. Par conséquent, ce modèle ne tient pas compte de la contribution potentielle de la gaine au processus de formation de cicatrice. ii) Afin de protéger l'intégrité du site de réparation, le FT est libéré à la jonction myotendineuse, ce qui diminue les forces mécaniques du tendon, a probablement contribué à l'augmentation de la formation de cicatrices. L'isolement de cellules suffisantes provenant du tissu de granulation du FT pendant le processus de guérison pour une analyse cytométrique en flux a révélé difficile; cytologique centrifugation pour concentrer ces cellules est une autre méthode utilisée et permet de générer des préparations de cellules sur lesquelles marquage immunofluorescent peut être effectuée. Avec cette méthode, la quantification des cellules ou des protéines d'intérêt au cours de la guérison FT devient possible.

Introduction

tendons fléchisseurs dans le travail de la main, de concert avec les muscles fléchisseurs de l'avant-bras et les gaines numériques pour permettre la flexion des doigts et de la fonction de préhension de la main. tendons fléchisseurs courent le long de la face palmaire de la main; cet endroit relativement superficielle entraîne souvent des blessures aux tendons fléchisseurs pendant un traumatisme à la main. Tendons guérissent par une réponse d' un tissu cicatriciel au lieu de la régénération du tissu normal du tendon 1. Bien que ce tissu cicatriciel assure la continuité du tendon, la fonction est considérablement diminué par rapport au tendon sain. Composites de tissus Tendon-cicatrice se caractérisent par des propriétés mécaniques affaiblies 1, ce qui rend les tendons réparés plus susceptibles de se rompre. En outre, le tissu cicatriciel n'a pas l'organisation de la structure des fibres de collagène de tendon natif, ce qui entraîne une augmentation de la taille du tendon et d'encombrement. Compte tenu des contraintes anatomiques de l'unité tendon-gaine, même une légère augmentation de la taille du tendon peut considérablement rougeUCE la fonction de glissement du tendon, et donc plage de chiffres de mouvement et la fonction de la main.

Avant les blessures du 1960 aux tendons fléchisseurs, en particulier dans la zone II de la main, ne sont pas systématiquement réparées en raison des complications graves dans la guérison qui se posent avec ces réparations 2. Cette zone de la main a été appelé «la terre de personne» 3. Cependant, l' amélioration des techniques chirurgicales, des motifs de suture et des protocoles de réhabilitation de physiothérapie ont considérablement amélioré les résultats du tendon fléchisseur réparations 2. Malgré ces progrès, jusqu'à 40% des réparations entraînent la formation d'adhérence suffisante pour empêcher la fonction de la main 4. Par conséquent, une approche biologique est nécessaire pour améliorer la guérison. Malheureusement, on sait très peu sur le processus de guérison du tendon au niveau cellulaire et moléculaire. Ainsi, l'objectif était de développer un modèle murin qui pourrait être utilisé pour améliorer la understandin fondamentaleg des composants cellulaires et moléculaires de fléchisseur guérison du tendon et la réponse de la formation de cicatrices, comme un moyen d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la guérison.

modèles animaux plus grands ont contribué à améliorer la compréhension du processus de guérison du tendon fléchisseur. Études de Canine et le lapin ont démontré à la fois la capacité de guérison intrinsèque et extrinsèque des tendons fléchisseurs 5,6, l'importance du mouvement passif tôt contrôlée pour minimiser la formation d'adhérence par rapport à l' immobilisation 7, ainsi que les effets des différents motifs de suture sur le processus de guérison 8 , 9. En outre, le modèle canin a été utile pour tester des approches d'ingénierie tissulaire translationnelle pour améliorer la guérison 10. Cependant, il existe plusieurs avantages importants à l'aide d'un modèle murin par rapport à un grand modèle animal, y compris le coût relatif, la disponibilité des réactifs spécifiques de souris et de la facilité de génération globale KNOCk-out ou constructions délétion / surexpression spécifiques de tissus. En outre, les similitudes fonctionnelles entre les humains et les souris en ce qui concerne les tendons fléchisseurs 11 indiquent l'utilité potentielle dans le développement d' un modèle murin.

Développement d'un modèle murin de tendon fléchisseur transection et de réparation imite de nombreux aspects de la guérison clinique, y compris la formation de tissu cicatriciel abondante et des propriétés mécaniques avec facultés affaiblies. Le modèle décrit ici est pas un vrai récapitulation de la pratique clinique en raison de transection du FDL à la jonction myotendineuse afin de protéger le site de réparation. En outre, ce modèle ne tient pas compte de la contribution des cellules synoviales de la gaine à la réponse de cicatrisation, comme il n'y a pas de gaine synoviale recouvrant la partie médiane du tendon se produit lorsque la réparation. Malgré ces limites, ce modèle a l'avantage de la gamme de production d'adhérences de mouvement de limitation, qui doit encore être démontrée dans des modèles murins que plus de closely rapprochant le scénario clinique. Ce modèle a été utilisé pour évaluer les modèles knock-out souris 12,13, et de tester différentes approches pharmacologiques pour améliorer la guérison 14-17. analyse histologique de ce modèle, par immunohistochimie et hybridation in situ, peut fournir des indications importantes pour la localisation des gènes et des protéines clés au cours de la guérison. Cependant, l'histologie ne donne qu'une analyse spatiale en coupe transversale et ne permet pas de quantification dans l'ensemble du tissu entier. La cytométrie en flux est une approche plus quantitative, mais seulement un nombre très limité de cellules peuvent être isolées à partir du tissu de tendon de guérison dans le modèle de souris, et ce nombre est encore diminué au cours des étapes de fixation, perméabilisation et lavage. Prenant cela en compte, écoulement devient cytométrie une approche irréalisable en raison du nombre d'animaux qui seraient nécessaires. Une autre méthode est nécessaire pour préserver la majorité de cette petite population de cellules dans le butpour caractériser davantage le milieu de guérison. La méthode utilisée pour ce faire, ici, concerne la concentration des cellules isolées par centrifugation cytologique sur une lame de verre, suivie par immunocytochimie. Dans la présente étude EdU (5-éthynyl-2'deoxyuridine, un analogue de la thymidine) l'incorporation et l'étiquetage ultérieur a été utilisé pour déterminer l'état prolifératif relatif de cellules sur le site de guérison. Cette approche peut être appliquée pour tester l'efficacité des traitements pharmacologiques sur la prolifération cellulaire, le gène knock-out ou d'une surexpression ou d'identifier et de quantifier des populations de cellules différentes.

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Protocole

Le Comité de l'Université sur la recherche animale de l'Université de Rochester a approuvé l'ensemble des expérimentations animales. Dix-12 souris C57BL femelle / 6J ont été utilisés.

1. Préparation des animaux pour la chirurgie Flexor Tendon (~ 15 min)

  1. instruments chirurgicaux autoclaves pour stériliser, porter des gants stériles tout au long, et de maintenir un champ opératoire stérile.
  2. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (ip) avec un volume de kétamine (80 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) correspondant au poids corporel. Confirmer la profondeur de la sédation par absence de toe-pincement réflexe.
  3. Administrer analgésie préventive (buprénorphine, 0,05-0,1 mg / kg) par injection sous-cutanée. Appliquer une pommade ophtalmique pour éviter les yeux de se dessécher.
  4. Préparer le site chirurgical par clipsage la fourrure sur l'ensemble du membre postérieur. La stérilisation de la peau par lavage successivement avec de l'iode de povidone, suivie par 70% d'éthanol, et de nouveau avec de la povidone iode.

2. Murine Flexor Tendon blessures et chirurgie de réparation (~ 10 min)

  1. Trouver le tendon, vu superficiellement dans la face interne du mollet long fléchisseur des orteils (FDL). L'utilisation d'un scalpel, faire une petite 0,5-1 cm incision dans la peau avec des micro-ciseaux pour exposer le tendon.
  2. Utilisez une pince pour séparer le tendon FDL du tissu environnant et il trace jusqu'à la jonction myotendineuse. Couper le tendon à cette jonction avec des ciseaux à ressort pour le libérer, en prenant soin d'éviter l'artère tibiale postérieure.
  3. Fermer la peau avec 5-0 sutures en nylon.
    Note: La transection FDL et réparation (étapes 2.4) doivent être effectuées à l'aide d'un stéréomicroscope.
  4. Faire une incision de 3 mm sur l'aspect postérolatérale de la patte arrière en utilisant ressort micro-ciseaux. rétracter délicatement les tissus mous environnants et les muscles avec une pince, en veillant à minimiser les dommages aux tissus, et identifier le tendon FDL.
    1. Soulevez doucement le tendon FDL et complètement transect en utilisant micro-ciseaux. Suturer les extrémités du tendon FDL ensemble selon un motif Kessler modifié avec des sutures 8-0, évitant ainsi le séchage du tendon en mouillant périodiquement avec une solution saline.
    2. Remplacer les tissus mous et les muscles sur le tendon, puis fermez l'incision avec 5-0 sutures en nylon.
  5. Placer des souris sur une lame de chauffe ensemble à 37 ° C, afin de maintenir la température du corps jusqu'à récupéré de l'anesthésie.
  6. Surveiller les souris post-opératoire pour des signes de déficience ou d'une infection, y compris la vocalisation accrue et fourrure ébouriffée. Injecter buprénorphine (50 pl / souris) comme analgésique toutes les 12 heures jusqu'à ce que les souris ne montrent plus de signes de douleur ou de détresse.
  7. Permettre aux souris de guérir pendant une période de 10 jours après la chirurgie avant de continuer à les prochaines étapes.
    Remarque: Les cellules peuvent être récoltées à tout point de temps après la chirurgie. Ici, 10 jours sont choisis pour ces expériences représentatives étant donné la relativement élevée cellularité du tissu à ce moment.

3. Labeling de cellules Cyclisme (~ 10 min)

  1. Préparer EdU (5-éthynyl-2'deoxyuridine) solution (10 mg / ml dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate [PBS] + 1% de diméthylsulfoxyde [DMSO] pour augmenter la solubilité).
  2. Injecter souris avec 100 ul EdU (50 mg / kg) par injection ip 24 h avant le sacrifice.

4. Les cellules de récolte pour cytologie Centrifugation (2,5 h, ~ 30 min temps sur les mains)

  1. Préparer 3 mg / ml de collagénase I dans du PBS.
  2. Euthanize souris par asphyxie du dioxyde de carbone à un taux de pas plus de 3 L / min Débit et effectuer luxation du rachis cervical en tant que mesure secondaire.
  3. Localisez le tendon réparé en utilisant l'étape 2.4 ci-dessus, et d'isoler le tissu du tendon en coupant environ 2 mm de chaque côté du site de la lésion avec des micro-ciseaux.
    1. tissu Hacher avec scalpel dans une boîte de Pétri avec 1 ml de 3 mg / ml de collagénase, puis passer à travers un mélange de 18 aiguilles G à plusieurs reprises pour briser le tissu. Recueillir le mélange dans un tube de 1,5 ml de centrifugeuse.
    2. Digest tissu tendineux pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation.
    3. Essorage du tissu vers le bas (300 g pendant 5 min), aspirer la collagénase, puis remettre en suspension les cellules / tissus avec de l'albumine de sérum bovin 500 ul de 3% (BSA) dans du PBS par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
    4. suspension de cellules de filtre à travers un tamis cellulaire de 70 um pour éliminer les débris et de gros morceaux de tendon, et mettre de côté dans un incubateur à 37 °.
    5. Placez tissu tendineux dans un autre tube de 1,5 ml de centrifugeuse, et rafraîchir avec 1 ml de solution de collagénase, pipetage haut et bas pour mélanger.
    6. Laisser incuber le tissu encore une heure à 37 ° C sous agitation.
    7. Isoler tissu tendineux digéré (300 g pendant 5 min), puis remettre en suspension dans 500 pi 3% de BSA dans du PBS par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
    8. Filtre suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 pm, combiner avec suspension isolé en 4.3.3, puis compter les cellules avec un hémocytomètre.
    9. Laver les cellules une fois avec 3% de BSA dans du PBS, puis remettre en suspension à 3-610 x 4/100 ul.
  4. Fixer un entonnoir cytologique sur une lame chargée positivement et verrouiller dans le support de diapositives. Insérer l'appareil entier dans une centrifugeuse cytologique et ajouter 100 ul de suspension cellulaire dans l'entonnoir. Centrifuger à 300 g pendant 5 min pour disperser les cellules sur la lame.

5. immunocytochimie pour détecter EdU (2 h, ~ 45 min temps sur les mains)

Remarque: Toutes les étapes d'incubation doivent être effectuées dans l'obscurité pour limiter photoblanchiment des fluorophores.

  1. les cellules de cercle avec un stylo à barrière hydrophobe pour réduire au minimum une solution nécessaire pour les étapes suivantes, puis fixer immédiatement avec 150 ul de 3% de paraformaldehyde dans du PBS 15 min à température ambiante (TA).
    1. Laver deux fois pendant 5 min avec 150 ul de BSA à 3% dans du PBS.
    2. cellules perméabiliser avec 0,5% de Triton-X 100 dans du PBS 20 min à température ambiante.
    3. étape de lavage répétée comme dans 5.1.1.
  2. Préparer EdU réaction Cockttous selon les instructions du kit pas plus de 30 minutes avant l'utilisation.
    1. Ajouter 150 ul cocktail à chaque diapositive, incuber 30 min à température ambiante.
    2. étape de lavage répétée comme dans 5.1.1.
  3. Incuber avec 150 ul de contraste nucléaire Hoechst33342 dilué 1: 2000 dans du PBS 30 min à température ambiante.
    1. Laver deux fois pendant 5 min avec 150 ul de 1 x PBS.
  4. Ajouter 1-2 gouttes moyen pour les cellules de montage anti-fade, puis lentement lamelle inférieure pour empêcher les bulles.
    1. Laisser le milieu de montage sécher durant la nuit dans l'obscurité à la température ambiante.
    2. Utilisez vernis à ongles transparent pour sceller la lamelle à la diapositive.
  5. Les diapositives d'images au grossissement 40X en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres d'excitation / émission capables de détecter DAPI (Hoeschst33342) et Texas Red (Alexa Fluor 594).

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Résultats

Le long fléchisseur des orteils (FDL) musculaire, situé dans le mollet, agit pour fléchir les chiffres de la patte arrière de la souris via le tendon fléchisseur (indiqué en bleu sur la figure 1A, et montré histologiquement à la figure 2A), qui fonctionne de manière proximale de la myotendineuse jonction et se termine par les phalanges distales. Dans ce modèle de tendon fléchisseur guérison, le tendon FDL est sectionnée et réparé à la mi-pied, à proximit...

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Discussion

La procédure chirurgicale pour un modèle murin de transection complète et la réparation du tendon fléchisseur des orteils est présenté dans cette étude. En outre, une nouvelle application de la concentration de petites populations de cellules avec la cytologie centrifugeuse est démontrée, permettant une analyse immunocytochimique quantitative de l'environnement cellulaire pendant la guérison du tendon fléchisseur. Ce modèle de tendon fléchisseur de réparation démontre une réponse de guérison reproductible, qui peut ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents

Remerciements

Ce travail a été partiellement financé par la Société américaine pour la chirurgie du Prix Pilot Main et NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (à AEL) et NIAMS / NIH P30AR061307.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Préparation chirurgicale
souris C57BL/6J  ;Jackson Laboratories000664
KétamineHospiraNDC # 0409-2051-05
XylazineLloyd Inc.NDC # 61311-482-10
BuprénorphinePar Pharmaceutical Inc.NDC # 42023-179-10
Irrigation au chlorure de sodium à 0,9 %HospiraNDC # 0409-6138-03Pour la préparation de solutions de kétamine/xylazine et de buprénorphine
ml de seringueBD309659
30 G d’aiguilleBD305106
solution de povidone et d’iodeAplicare82-226
70 % d’éthanol
Puralube veter pommade ophtalmiqueDechra Veterinary ProductsNDC# 17033-211-38
Nom>EntrepriseNuméro de catalogueComments
>Outils chirurgicaux
Balance portable 200 gOhausSP202
Ciseaux à ressortOutils pour les sciences fines15124-12
Pince Dumont #5Outils pour les sciences fines11251-30
Porte-aiguillespour les sciences fines91201-13
Ciseaux à micro-ressortsOutils pour les sciences fines15003-08
Porte-micro-aiguillespour les sciences fines12061-02
5-0 sutures en nylonEthicon668G
8-0 microchirurgie sutures en nylonEthicon2808G
Lab-Line histologie chauffe-lamesBarnstead International26025
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Cytospin forte
Collagénase de type I, lyophiliséeLife Technologies  ;1700-017
bovin AlbumineCell Signaling Technologies9998S
1x PBSThermo Fisher10010-023
Entonnoirs de cytologieFisher HealthCare10-354
Lames de microscope HistoBond+VWR16005-110
Cytospin 2 centrifugeuseShandonSH-CYTO2
NameCompanyNuméro de catalogueComments
Immunocytochemistry
Plateau de coloration de lames avec couvercle noirIHC WorldM920-2
Click-iT Plus EdU Imaging KitLife Technologies  ;C10639Comprend EdU et  ; Hoeschst 33342
Immedge Stylo barrière hydrophobeVector LaboratoriesH-4000
ProLong Diamant médium de montageThermo FisherP36970
Lamelles en verre 24 x 50 mm #1.5
Vernis
1 Sérum à ongles transparent

Références

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