Procédure d'adaptation Laboratoire de l'évolution de Microorganismes Utilisation chémostat

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir adaptatif évolution en laboratoire de micro-organismes dans des conditions à l'aide de la culture chemostat. En outre, l'analyse génomique de la souche évoluée est discutée.

Abstract

L’évolution naturelle implique une diversité génétique telle que le changement environnemental et une sélection entre de petites populations. L’évolution adaptative en laboratoire (ALE) fait référence à la situation expérimentale dans laquelle l’évolution est observée à l’aide d’organismes vivants dans des conditions contrôlées et des facteurs de stress ; Les organismes sont ainsi artificiellement forcés d’effectuer des changements évolutifs. Les micro-organismes sont soumis à une variété de facteurs de stress dans l’environnement et sont capables de réguler certaines protéines induites par le stress pour augmenter leurs chances de survie. Les mutations spontanées naturelles entraînent des changements dans le génome d’un micro-organisme qui affectent ses chances de survie. L’exposition à long terme à la culture des chémostats provoque une accumulation de mutations spontanées et rend dominante la souche la plus adaptable. Par rapport aux méthodes de transfert de colonies et de transfert en série, la culture de chimiostats implique le plus grand nombre de divisions cellulaires et, par conséquent, le plus grand nombre de populations diverses. Bien que la culture du chémostat pour l’ALE nécessite des dispositifs de culture plus complexes, elle demande moins de main-d’œuvre une fois l’opération commencée. Des analyses comparatives génomiques et transcriptomiques de la souche adaptée fournissent des indices évolutifs sur la façon dont les facteurs de stress contribuent aux mutations qui surmontent le stress. L’objectif de cet article est d’accélérer l’évolution des micro-organismes dans des conditions de laboratoire contrôlées.

Introduction

Les microorganismes peuvent survivre et s'adapter à des environnements divers. En cas de stress sévère, l' adaptation peut se produire via l' acquisition de phénotypes bénéfiques par des mutations génomiques aléatoires et la sélection positive ultérieure ^1-3. Par conséquent, les cellules microbiennes peuvent adapter en changeant métabolique ou les réseaux de régulation pour une croissance optimale, qui est appelé «l'évolution adaptative". tendances microbiennes importantes récentes, telles que les épidémies de superbactéries et l'apparition de souches microbiennes robustes, sont très étroitement liés à l'évolution adaptative dans des conditions stressantes. Dans des conditions de laboratoire définies, nous sommes en mesure d'étudier les mécanismes de l'évolution moléculaire et même de contrôler la direction de l'évolution microbienne pour diverses applications. Contrairement à des organismes multicellulaires, les organismes unicellulaires sont bien adaptés à l'évolution de laboratoire adaptatif (ALE) pour les raisons suivantes: ils régénèrent rapidement, ils maintiennent des populations importantes, et il est facile de créer et maintenir homenvironnements ogeneous. Combiné avec les récentes avancées dans les techniques de séquençage de l'ADN et des technologies à haut débit, ALE permet l'observation directe des changements génomiques qui conduisent à des changements réglementaires systémiques. la dynamique de mutation et la diversité de la population sont également observables. Stratégies de génie génétique peuvent être déterminées à partir de l'analyse des souches d'ale ^4,5.

Culture Chemostat est une méthode utilisée pour obtenir des cellules à l' état ​​stable et d' augmenter la productivité dans les processus de fermentation ^6. Du milieu frais est ajouté et le bouillon de culture est récolté pendant le processus (celui-ci comprend en moyenne et la biomasse). Culture chemostat à long terme, cependant, modifie la productivité à l' état ​​stable de la culture et provoque l'accumulation de mutations spontanées et la sélection lors de la culture (figure 1a). Sous diverses pressions de sélection (facteurs de stress), l'accumulation de mutations est améliorée. Une augmentation progressive de stress dans un long terme chémostat prévoit une sélection continue de mutations qui agissent contre les facteurs de stress donnés, tels que la température, le pH, la pression osmotique, des substances nutritives inanition, l' oxydation, des produits finaux toxiques, etc. , le transfert des colonies à partir d' un milieu solide et le transfert en série à partir d' un milieu liquide (répété culture discontinue) permettent également aux chercheurs d'obtenir des micro - organismes évolués (figure 1b et 1c). Bien que la culture chemostat nécessite des méthodes compliquées, la piscine de la diversité (nombre de répétitions et de la taille de la population) est supérieure à celle obtenue par transfert des colonies et des techniques de transfert de série. L'exposition au stress stable à des cellules individuelles et une diminution de la variation de l'état cellulaire pendant la culture chemostat (état stable) sont les autres avantages de l'ALE par rapport aux techniques basées sur la culture par lots. ALE Le stress induit par des Escherichia coli soumis à des conditions succinate élevées est introduit dans cet article.

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Figure 1: Méthodes d'évolution de laboratoire adaptatif (A) Chemostat;. (B) transfert en série; (C) transfert des colonies. Les chiffres supérieurs illustrent le concept des méthodes pour ALE, et les chiffres inférieurs illustrent le nombre de cellules qui se sont développées au cours ALE. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

1. Équipement Préparation

1. Obtenir un récipient chimiostatique (150-250 ml) ou d'un Erlenmeyer (250 ml) contenant un orifice d'entrée et un orifice de sortie. Connectez les ports avec des tubes de silicium permettant des taux de 10-100 ml / h de débit. En option, utiliser un évent, un orifice de sortie d'air et des orifices d'entrée et sortie d'eau à température contrôlée.
2. Obtenir un dispositif approprié pour le pot de chemostat qui fournit pour l'agitation et de la température (ou utiliser un incubateur agitateur rotatif).
3. Obtenir deux pompes péristaltiques afin d'offrir un milieu frais et de percevoir la culture.
4. Obtenir un pot de réservoir (10 à 20 L) contenant un orifice de sortie de fluide et un orifice d'entrée d'air.
5. Obtenir un tube de silicium pour le taux de dilution (c. -à- ID 0,8 mm, plage de débit de 0,06 à 36 ml / min; L / S 13 tubes).

2. Moyen Préparation et stérilisation

1. Medium initial
   1. Dissoudre 0,3 g de glucose, 0,08 g de NH ₄Cl, 0,05 g de NaCl, 0,75 g de Na ₂ HPO ₄ .2H ₂ O, et 0,3 g de KH ₂ PO ₄ dans 90 ml d' eau distillée (DW) dans un récipient chimiostatique.
   2. Sceller le bocal en chemostat avec le tuyau à l'aide des pinces. Ne pas sceller l'évent.
   3. Stériliser le pot de chemostat dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min. Après stérilisation, stocker le pot de chemostat à la température ambiante.
   4. Dissoudre 0,02 g de MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0,01 g de CaCl _2, et 0,1 mg de thiamine dans 10 ml DW (solution A).
   5. Une solution de filtration à l'aide d'une seringue et d'un filtre à seringue pré-stérilisé (un filtre de 0,45 um de pores).
   6. Ajouter la solution A filtrats dans le pot de chemostat.
2. stress Medium
   1. Dissoudre 30 g de glucose, 8 g de NH ₄ Cl, 5 g de NaCl, 75 g de Na ₂ HPO ₄ .2H ₂ O, 30 g de KH ₂ PO ₄ et 300 g de succinate disodique hexahydraté (Na ₂ · succinate .6H _{2 O; le facteur de stress utilisé dans cette expérience) dans 9,9 L DW dans un pot de réservoir.}
   2. Sceller le pot de réservoir avec le tuyau à l'aide des pinces. Ne pas sceller l'évent.
   3. Stériliser le pot de réservoir dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min. Après stérilisation, stocker le pot à la température ambiante.
   4. Dissoudre 2 g MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1 g de CaCl _2, et 10 mg de thiamine dans 100 ml DW (solution A).
   5. Une solution de filtre avec une seringue et d'un filtre à seringue pré-stérilisé (un filtre à pores de 0,45 um).
   6. Ajouter la solution A filtrats dans le pot de réservoir.
   7. Aseptique connecter le tube de silicium stérilisé pour le pot de réservoir et fixer les pompes péristaltiques.
3. Haut-stress moyen
   1. Préparer le milieu comme dans la section 2.2, mais avec une plus grande concentration de stresseur (ie, 3-5 g / L plus élevé dans l'adaptation succinate).
      Remarque: Ce protocole est pour l'adaptation à une contrainte eà peut être livré via le support. Dans le cas des facteurs de stress physiques tels que la température, l'agitation ou l'illumination, la culture doit être conçu en conséquence.

3. Culture initiale

1. Inoculer une seule colonie de type sauvage E. coli dans un tube à essai de 15 ml contenant 4 ml de milieu initial.
2. Incuber le tube à essai dans un incubateur à agitation par secousses pendant 12 heures à 37 ° C et à 220 tours par minute.
3. transfert aseptique 1 ml de préculture au pot chemostat.
4. Incuber le pot de chemostat, prévoyant l'aération (air 50 ml / min) et l'agitation (200 rpm), à 37 ° C pendant 6 heures.

4. Stress Adaptation

1. Aseptique connecter l'extrémité du tube de silicium à partir des pompes à la jarre de chemostat.
2. Démarrer la pompe de sortie (10 ml / h ou plus) et recueillir la culture.
   Remarque: La culture doit être en phase exponentielle, généralement 4-8 heures après la culture initiale.
3. ChEck la densité optique (600 nm) de la culture de la tubulure de sortie.
4. Démarrer la pompe d'entrée (10 ml / h, ce qui correspond à un taux de dilution de 0,1 h ^-1).
5. Vérifier la densité optique de la culture à 600 nm à partir de la tubulure de sortie toutes les 24 heures.
6. Faire fonctionner le chemostat pendant 96 heures (chiffre d'affaires de 9,6 fois) ou plus. Si la densité optique est stable, échanger le réservoir contenant le milieu de stress élevé. Si la densité optique est inférieure à 0,2, arrêter la pompe d'entrée d'alimentation pendant 6 heures. Redémarrez la pompe d'entrée et vérifier que la densité optique est supérieure à 0,2.
7. Augmenter graduellement la concentration du facteur de stress en changeant à un réservoir contenant une concentration plus élevée de facteur de stress.
8. Prélever des échantillons de la culture adaptée chaque fois qu'il atteint une étape importante (par exemple, une souche adaptée à 100 g / L stress succinate), et un magasin pour une analyse génomique.
9. Pour le stockage de l'échantillon, mélanger l'échantillon de culture (0,5 ml) avec un stérilisée 80% de glycérol solutisur (0,5 ml) et le stocker à -80 ° C.
   Remarque: si le micro-organisme acquiert une capacité de dégrader le facteur de stress au cours du procédé ALE, la concentration du facteur de force dans le récipient de fermentation ne sont pas les mêmes que dans le réservoir frais.

5. unique colonie d'isolement de la souche adaptée au stress

1. Préparer le milieu de plaque de gélose (1,6% de gélose) contenant le même facteur de stress et à la même concentration du milieu.
2. La culture de la plaque de sortie (0,1 ml) à partir du chemostat, et incuber à 37 ° C pendant 16 heures.
3. Prélever des colonies uniques à partir de la plaque à l'aide d'un cure-dent stérile et inoculer 15 ml dans les tubes à essai contenant le même facteur de stress et à la même concentration que dans le milieu chémostat, et laisser incuber pendant 6 heures.
4. Transférer 1 ml de bouillon de culture dans un erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de milieu. Récolte 0,5 ml du bouillon de culture, toutes les 1 h, et de mesurer la DO à 600 nm. Comparer le taux de l'strai adapté de croissancen à celle de la souche de type sauvage étant donné le stresseur.

Results

Pour haute succinate adaptation au stress, le type sauvage E. coli W3110 a été cultivé dans un chemostat à D = 0,1 h ^-1 pendant 270 jours (Figure 2).

Figure 2: High-succinate adaptation au stress de E. coli W3110 en utilisant la culture chemostat. flèches minces indiquent les mome...

Discussion

Les microorganismes sont capables d'adapter à presque tous les environnements en raison de leur taux de croissance rapide et de la diversité génétique. évolution de laboratoire Adaptive permet des micro-organismes à évoluer dans des conditions conçues, ce qui fournit un moyen de sélectionner les organismes individuels hébergeant des mutations spontanées qui sont bénéfiques dans les conditions données.

La technique de chemostat est plus robuste pour réaliser l'évolution entraînée arti...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fermenteur mini-chémostat	Biotron Inc.	-	fabriqué par commande spéciale
tube en silicone La taille du	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	peut être modifiée en fonction du taux de dilution et de la taille du pot de fermenteur.
bocal réservoir	Bellco	Media bouteille de stockage	20 L
produits chimiques	Sigma-Aldrich-réactif
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS réactif
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	pour la biologie moléculaire, adapté à la culture cellulaire, &ge ; 99,5 %
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	réactif ACS, &ge ; 99 %
Na2HPO4· ; 2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101 %
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	réactif ACS, &ge ; 99 %
MgSO4· ; 7H2O	Réactif Sigma-Aldrich	230391	ACS, &ge ; 98 %
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	réactif ACS, &ge ; 96 %
thiamine· ; HCl	Sigma-Aldrich	T4625	grade réactif, &ge ; 99 %
Na2· ; succinate· ; 6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, &ge ; 99 %