Article de méthode

Imagerie Multimodal quantitative phase avec Digital Holographic Microscopy Évalue avec précision guérison inflammation intestinale et épithéliales des plaies

DOI :

10.3791/54460

⸱

13 septembre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Institute of Palliative Care, University Hospital Münster, 3Biomedical Technology Center, University of Münster, 4Department of Gastroenterology, Klinikum Bielefeld

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une évaluation précise des effets anti-inflammatoires est de la plus haute importance pour l’évaluation de nouveaux médicaments potentiels pour le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin. La microscopie holographique numérique permet d’évaluer l’inflammation dans des échantillons de tissus murins et du côlon humain, ainsi que d’évaluer multimodalement automatiquement la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'incidence de la maladie inflammatoire de l' intestin, à savoir, la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. L'étiologie des MICI reste inconnue et les stratégies thérapeutiques actuelles sont basées sur la suppression non spécifique du système immunitaire. Le développement de traitements qui ciblent spécifiquement l'inflammation intestinale et la guérison des plaies épithéliales pourrait améliorer considérablement la gestion des MII, mais cela nécessite une détection précise des changements inflammatoires. À l' heure actuelle, les candidats potentiels de médicaments sont généralement évaluées en utilisant des modèles animaux in vivo ou par des techniques à base de culture cellulaire in vitro. L'examen histologique nécessite habituellement les cellules ou les tissus d'intérêt à être colorés, qui peuvent modifier les caractéristiques de l'échantillon et, en outre, l'interprétation des résultats peut varier selon l'expertise des enquêteurs. La microscopie holographique numérique (DHM), basée sur la détection de la longueur de chemin optique de retard, permetsans tache contraste d'imagerie de phase quantitative. Cela permet aux résultats d'être directement corrélées avec les paramètres biophysiques absolus. Nous montrons comment la mesure des variations de densité des tissus avec DHM, basée sur la mesure de l'indice de réfraction permet de quantifier les altérations inflammatoires, sans taches, dans les différentes couches de spécimens de tissus du côlon des souris et des humains souffrant de colite. En outre, nous démontrons une surveillance sans étiquette multimodale en continu de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro, en utilisant la DHM possible grâce à la détermination automatisée simple , de la zone blessée et la détermination simultanée des paramètres morphologiques tels que la masse sèche et une épaisseur de couche de cellules migrantes. En conclusion, DHM représente un précieux outil original et quantitative pour l'évaluation de l' inflammation intestinale avec des valeurs absolues pour les paramètres possibles, la quantification simplifiée de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro et a un fort potentiel de u diagnostic translationnelle doncproprement parler.

Introduction

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Les maladies inflammatoires de l' intestin (MICI), à savoir la rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn (MC) sont des troubles inflammatoires idiopathiques du tractus gastro - 1. La recherche sur la physiopathologie des MICI et l'évaluation des nouveaux médicaments potentiels ou approches diagnostiques nouveaux est particulièrement important. Dans la recherche fondamentale et la prise en charge clinique des patients atteints de MII, la muqueuse intestinale est devenu un centre d'attention 2,3. La muqueuse représente une limite anatomique, au cours de laquelle l'interaction entre les bactéries commensales, les cellules épithéliales et les différents composants cellulaires du système immunitaire intestinal orchestrer homéostasie intestinale 4,5. Cependant, chez les patients atteints de MII, l' inflammation intestinale non contrôlée et persistante conduit à la muqueuse des dommages, détectable comme ulcérations ou une sténose, qui peut finalement aboutir à répartition de la fonction de barrière épithéliale, qui s'aggrave l' inflammation locale 6.

épithélial la guérison des plaies est donc crucial pour la régénération épithéliale suivant l' inflammation , mais est également une exigence de base pour la guérison des ulcères gastro - intestinaux ou une fuite anastomotique après chirurgie gastro - intestinale 7. La cicatrisation epitheliale peut être simulé in vitro dans la plaie et la guérison des tests dans des modèles murins d'inflammation intestinale 8,9. Fois in vitro et in vivo des approches présentent des inconvénients qui limitent la précision de l' évaluation expérimentale. Essais in vitro, comme des dosages classiques de grattage, exiger des procédures de coloration prolongées ou transfection avec des chromophores fluorescents. Ils sont souvent limités par leur surveillance discontinue de la prolifération cellulaire et la migration qui ne peuvent pas être automatisés 10. Modèles in vivo, tels que le sulfate de dextran de sodium (DSS) de la colite induite, manquent souvent robustes lecture-outs, en partie en raison de la variation importante vu des marqueurs de laboratoire, maroi de tels marqueurs inappropriés pour évaluer la colite gravité 11,12. L' analyse histologique de la muqueuse enflammée est encore actuellement l'approche la plus valable pour déterminer la colite gravité mais, comme la plaie de guérison des essais épithéliales in vitro, nécessite une coloration et dépend de l'expertise de l' enquêteur 13.

La microscopie holographique récemment numérique (DHM), une variante de microscopie de phase quantitative 14, a été identifié comme un outil utile pour l'évaluation de l' épithélium la cicatrisation in vitro et in vivo 15. DHM permet d' évaluer la densité du tissu en mesurant la longueur de trajet optique à retard (OPD) , qui diagnostic perspectives roman cancer 16-18 et la quantification de l' inflammation liée tissus altérations 19. En outre, la DHM permet la surveillance de la dynamique de la morphologie des cellules en déterminant l'épaisseur de la cellule, la cellule recouverte de surface et intracellulaires (protéine) la quantité de contenu 15,20. Dans des essais in vitro, DHM permet également l'analyse de processus physiologiques, par exemple, cellulaire perméabilité à l'eau en évaluant les variations de volume cellulaire et d' épaisseur 21,22. En outre, les mesures DHM peuvent être automatisées qui empêche le biais de l'échantillon chercheur associé.

Ici, nous démontrons l'utilisation de DHM dans un modèle murin de l' inflammation intestinale, et appliquons également DHM à l' analyse d'échantillons de tissus humains pour le suivi quantitatif de la cicatrisation des plaies comme un test sans marqueur in vitro. Tout d'abord, nous évaluons les altérations inflammatoires de différentes couches murales colique chez la souris colitique et des coupes de tissus provenant d'êtres humains atteints de MICI. Après avoir décrit la DHM phase quantitative procédure d'imagerie, nous fournissons des instructions détaillées pour l'utilisation des composants de microscope, la préparation des coupes de tissus et aussi décrire l'évaluation des images de phase quantitatives acquises.

Ensuite, nous montrons que DHM peut être utilisée pour la surveillance multimodale continue de la cicatrisation des plaies épithéliales in vitro, et décrire l'analyse des caractéristiques cellulaires telles que l' épaisseur de la couche de cellules, la masse sèche et le volume cellulaire donner un aperçu de la drogue induit et cellulaires altérations physiologiques.

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le comité régional d'éthique (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Allemagne) selon la loi sur la protection des animaux allemande. Le comité d'éthique local de l'Université de Münster a approuvé l'utilisation de tissus humains pour l'analyse histologique et microscope.

1. Les animaux et les matériaux

  1. Utilisez une femme ou des souris mâles de la souche DSS-sensibles nécessaires qui pèsent 20 à 25 g, et la maison conformément à la législation de protection des animaux. Fournir chow spéciale pour les rongeurs et autoclaves boire de l' eau ad libitum.
  2. Provoquer DSS colite aiguë par administration 3% p / v de sulfate de dextran sodium (DSS, poids moléculaire: 36,000-50,000 Da) dans l' eau du robinet autoclavée pendant 5 jours.
    NOTE: La puissance du DSS est très variable selon le fabricant et le lot. Testez votre DSS fournisseur fourni d'abord pour l'induction de l'activité de la maladie, pour laquelle dapoids corporel ily est un indicateur fiable et objective.
  3. Pour une évaluation histologique des échantillons de tissus du côlon, l' euthanasie des souris par le CO 2 insufflation (ou comme spécifié par les directives nationales et institutionnelles) à la fin de l'expérience.

2. Installation expérimentale pour DSS-colite et In-vitro Wound Healing Assays

  1. La culture cellulaire et la mise en place d'essai de cicatrisation.
    1. Cultivez cellules Caco-2 dans une humidité de 95% et 5% de CO 2 environnement à 37 ° C. En utilisant du milieu RPMI avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine.
    2. Seed cellules Caco-2 à une densité de 4 x 10 5 cellules / cm 2 sur 35 mm des boîtes de Pétri avec la haute culture-insert (voir la figure 4A).
      NOTE: L'insert génère deux zones recouvertes de cellules qui sont séparées par un espace libre de cellule définie représentant la zone blessée à analyser.
    3. Changer le milieu deux jours après seeding. Effectuer par le premier moyen d'aspiration résiduel avec des débris cellulaires à l'aide d'une pipette automatique, rincer avec 100 pi de tampon phosphate salin (PBS) et on ajoute du milieu RPMI frais ou du milieu de privation de sérum.
    4. cellules de culture pour 24 heures dans un milieu de sérum privé (0,1% de FBS) additionné de 20 ng EGF / ml de sérum ou 2 pg mitomycine c / ml de sérum pour détecter des altérations du comportement de cicatrisation des plaies. Ajouter un milieu RPMI normal de contrôler les cellules pendant 24 heures.
    5. Après 24 heures de culture, enlever et jeter des inserts de culture comme décrit dans l'étape 3.4 et effectuer DHM.
  2. Induction de colite aiguë DSS
    1. Dissoudre 3 g de DSS dans 100 ml d'eau autoclavés pour obtenir un 3% (p / v) solution DSS. Fournir cette solution en place de l' eau potable à des souris ad libitum pendant 7 jours. Calculer 5 ml de DSS-solution par souris / jour. Fournir de l' eau autoclavée sans DSS pour les souris de contrôle ad libitum.
  3. Préparation des sections cryostatiques de côlon humain et murin
    1. Euthanasier souris par CO 2 insufflation à la fin de l'expérience.
    2. Disséquer l'abdomen de l'animal par laparotomie 23. Retirez tout le côlon soigneusement à l'aide des pinces et couper l'extrémité de l'iléon et du rectum à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Couper le côlon avec une paire de ciseaux longitudinalement du caecum à la fin du rectum et ouvrir le côlon. Retirez toutes les matières fécales de l'échantillon à l' aide de pinces , suivi par un lavage avec du PBS 24.
    3. Préparer roulés en enroulant l'ensemble du côlon avec un coton-tige longitudinalement à partir du caecum à la fin du rectum avec la muqueuse incurvée vers l'intérieur. Incluez échantillons colique de la température de coupe optimale (OCT) composé et maintenir congelé à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
    4. Incluez tissu du côlon humain de prélèvement chirurgical en coupe optimale température octobre composé et maintenir congelé à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
    5. sections coupées de 7 um d'épaisseur des échantillons OCT-composés-embedded avec l'aide d'un cryotomoi juste avant l'examen.
      NOTE: L'épaisseur optimale de l' échantillon dépend de la persistance et les propriétés de diffusion du type de tissu sous investigation. Pour les expériences décrites à l'aide de tissus du côlon, l'épaisseur de la tranche> 10 um cause augmentation significative du bruit en raison de la diffusion de la lumière dans les quantitatifs des images à contraste de phase DHM, alors que les échantillons d'épaisseur <5 um présentent un risque plus élevé de dommages induits par des artefacts du processus de coupe de cryo.
    6. Transfert sections sur une lame de verre porte-objet.

3. L'équipement technique, les logiciels et les procédures d'acquisition et d'évaluation des Hologrammes numériques

  1. microscope holographique numérique pour cellulaire quantitative et l'imagerie des tissus
    1. Utiliser un système de microscopie hors axe de Mach-Zehnder holographique numérique pour l' imagerie des cellules vivantes 25, comme représenté sur la figure 1. Assurez -vous que le microscope est équipé d'un10X lentille de microscope, une platine de microscope avec un support pour les objets en verre glissières de support et des boîtes de Petri d'un diamètre de 35 mm, une chambre de chauffe afin de préserver la température physiologique à 37 ° C et un logiciel d'imagerie de phase quantitative 25.
      NOTE: Par exemple, comme décrit dans Kemper et al 26 et Langehanenberg et al 27...
      REMARQUE: Vous pouvez également utiliser un système similaire qui est capable d'effectuer la microscopie en champ clair et l' imagerie de phase quantitative de cellules vivantes et les lames de tissus disséqués.
    2. Lentille de microscope propre et d'un condenseur avec du papier de nettoyage de lentille et un agent de nettoyage (par exemple, l' éthanol) , comme recommandé par le fabricant du microscope pour enlever la poussière ou d' autres contaminations.
    3. Démarrez le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM, sélectionnez le mode d'imagerie "en champ clair" et le commutateur "sur" l'illumination de la lumière blanche. Assurer Köhler-vignetagetion de l'échantillon, tel que recommandé par le constructeur du microscope en observant l'échantillon dans la fenêtre d'imagerie en temps réel du logiciel d'acquisition d'image (en variante, un logiciel d'acquisition d'image standard peut être utilisé dans cette étape).
      NOTE: L'intensité de l' image doit être répartie de manière homogène dans le champ de vision et la position de l' échantillon ne doit pas se déplacer pendant le recentrage optique avec le lecteur de mise au point du microscope.
    4. Sélectionnez le mode "DHM" d'imagerie, mettez "off" éclairage en lumière blanche et l'interrupteur "sur" la lumière laser. Vérifiez que l'éclairage avec une lumière laser est homogène ( à savoir que l' intensité lumineuse est répartie de façon homogène dans la fenêtre d'imagerie en direct du logiciel d'acquisition d'imagerie du microscope DHM) et observez que le transporteur motif de franges d' interférence hors axe apparaît avec un contraste adéquat dans le les images capturées (hologrammes numériques).
  2. Préparation des sections de cryostat pour l'imagerieavec DHM
    1. Prenez le (section de cryostat sur un porte-objet en verre, épaisseur: 7 pm, comme décrit dans 2.3) échantillon du congélateur. Décongeler l'échantillon pendant environ 5 min à température ambiante et de l'atmosphère normale.
    2. Ajouter de 50 à 100 ul de phosphate de la solution saline tamponnée (PBS) comme milieu d'inclusion sur la section de tissu à l'aide d'une pipette jusqu'à ce qu'elle soit complètement recouverte d'un tampon. Couvrir l'échantillon avec une lamelle de verre propre (épaisseur de verre de 170 um).
      REMARQUE: Un séchage peut induire des changements importants de l'indice de réfraction et des propriétés dispersives de l'échantillon.
    3. Assurez-vous que le fond du support de verre et la lamelle sont nettoyées de la poussière et d'autres contaminants qui peuvent induire une diffusion de la lumière. L'échantillon est prêt pour l'enquête sur le terrain avec la microscopie lumineuse et DHM.
  3. Imagerie en phase quantitative de coupes de tissus avec DHM
    1. Allumez le microscope holographique numérique, choisir la lentille de microscope 10X pour l'imagerie. Démarrez le ilogiciel d'acquisition de mage du microscope DHM et sélectionnez lumineux mode d'imagerie de fichier.
    2. Placer la lame de tissu comme décrit dans 2) dans le support de lame de microscope, avec la lamelle faisant face à l'objectif du microscope.
    3. Switch "sur" le champ éclairage lumineux du microscope DHM. Positionner l'échantillon avec la platine du microscope et faire en sorte que la zone de tissu d'intérêt est visible dans la fenêtre de surveillance en direct. Améliorer la netteté de l'image à l'aide mise au point de route du microscope.
      NOTE: En plus de la zone d'intérêt, une zone de diapositive sans tissus doivent également être présents dans le champ de vision.
    4. Capturer une image lumineuse sur le terrain de l'échantillon fortement concentré en utilisant le logiciel d'acquisition d'image.
    5. Sélectionnez "DHM" mode d'imagerie, mettez "off" l'illumination de la lumière blanche et tourner "sur" l'illumination de lumière laser. Sélectionnez le "temps d'exposition" pour l'enregistrement d'hologramme en dessous de 3 msec, observer que holographic hors-axe des franges d'interférence apparaissent avec un contraste suffisant dans la fenêtre d'imagerie en temps réel du logiciel d'acquisition d'images et de capturer un hologramme numérique.
    6. Répétez les étapes 3.3.3 - 3.3.5 jusqu'à ce qu'un nombre suffisant d'images de champ lumineux et des hologrammes numériques de zones échantillons différents ont été enregistrés. acquisition Hologram est maintenant terminée.
  4. Préparation des essais de cicatrisation de la plaie pour l'imagerie DHM
    1. Allumez la chambre de chauffage de boîte de Pétri du microscope DHM environ 1-3 heures avant le début de l'expérience afin d'assurer des conditions de température stables pendant les mesures DHM.
    2. Préparer établi avec l'équipement nécessaire (boîte de Petri pour le dosage de la cicatrisation est décrite au point 2.3): pipettes, pince à épiler, couvercle en verre pour boîte de Pétri, 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) tamponné milieu de culture cellulaire avec physiologique température (37 ° C) pour la préparation de l'échantillon dans un environnement stérile.
      REMARQUE: 3.
    3. Retirer le couvercle en plastique de la boîte de Petri et éliminer le milieu de culture de cellules avec une pipette. Retirez le cache de la boîte en bas Petri en utilisant des pinces.
    4. Laver l'échantillon 1 - 2 fois avec 1 ml de tampon HEPES milieu de culture cellulaire afin d'éliminer les cellules mortes et les composants cellulaires restants (par exemple, sérum) dans la zone de la plaie. Ajouter 2 ml de tampon HEPES milieu de culture cellulaire et de coiffer la boîte de Pétri avec le couvercle en verre.
    5. Assurez-vous que le couvercle de verre et le plat en bas Petri ont été nettoyées de la poussière et d'autres contaminants. L'échantillon est prêt pour le temps écoulé observation avec DHM.
  5. Surveillance continue multimodale de cicatrisation in vitro avec DHM
    1. Allumez la chambre de chauffage de boîte de Pétri du microscope DHM d'environ 1 - 3 heures avantau début de l'expérience pour assurer des conditions de température stables pendant les mesures DHM.
    2. Switch "sur" le microscope holographique numérique, sélectionner la lentille 10X de microscope pour l'imagerie. Démarrez le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM et sélectionnez le mode d'imagerie "en champ clair". Veiller à ce que la chambre de chauffage pour la boîte de Pétri fonctionne une température physiologique (37 ° C).
    3. Placer la boîte de Pétri avec le dosage de la cicatrisation des plaies, préparée comme décrit dans 4), dans la chambre de chauffage du microscope DHM.
    4. Sélectionnez lumineux mode d'imagerie de champ et de positionner l'échantillon avec la platine du microscope tout en observant dans la fenêtre de surveillance en direct du logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM. Notez que la zone souhaitée de l'échantillon apparaît fortement concentré sous un éclairage de lumière blanche.
    5. Capturez des images lumineuses sur le terrain des différentes zones de l'échantillon (zone de la plaie et les zones environnantes avec des cellules confluentes) sous blancune lumière d'éclairage avec le logiciel d'acquisition d'images et le document de l'aspect, la densité cellulaire et l'homogénéité.
    6. Sélectionnez "champ clair" mode de fonctionnement du microscope DHM d'imagerie. Choisissez une zone de la plaie approprié sous la lumière blanche illumination dans la fenêtre de surveillance en temps réel avec le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM. Vérifiez que la surface de la plaie est exempt de cellules mortes et aucun sérum reste, et veiller à ce que les deux parties comprennent une seule couche de cellules homogène, de préférence avec des bordures droites.
    7. Capturez une image de lumière blanche de la zone initiale de la plaie en plein mode d'imagerie de champ avec le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM.
    8. Tourner "off" éclairage en lumière blanche, sélectionnez le mode "DHM" et le commutateur "sur" illumination laser. Sélectionnez un temps d'exposition inférieur à 3 ms pour enregistrement d'hologramme (observer que hors axe holographique franges d'interférence apparaissent avec un contraste adéquat dans la fenêtre d'imagerie en direct du logiciel d'acquisition d'images de til DHM microscope) et de capturer un hologramme numérique.
    9. Capturez un échantillon hologramme en mode DHM avec le logiciel d'acquisition d'image et de reconstruire une image quantitative de phase avec le logiciel de reconstruction du microscope DHM afin de vérifier la qualité d'image.
    10. Sélectionnez un délai approprié (par exemple, le 3 - 5 min) pour l' acquisition d'hologramme time-lapse avec le logiciel d'acquisition d'image du microscope DHM.
    11. Sélectionnez le mode d'acquisition time-lapse du logiciel d'acquisition d'image dans laquelle l'échantillon est seulement éclairé par une lumière laser lors de l'acquisition d'hologramme.
    12. Démarrez le time-lapse DHM observation de l'essai de cicatrisation.
    13. Arrêtez l'acquisition time-lapse après l'heure prévue, sélectionnez lumineux mode d'imagerie de champ et documenter l'aspect final de l'échantillon sous imagerie de lumière blanche.
  6. Reconstruire hologrammes numériques des tissus disséqués et déterminer l'indice de réfraction moyen comme un paramètre pour quantifierdensité tissulaire
    1. Reconstruire des images quantitatives de phase à partir des hologrammes numériques des tissus disséqués avec le logiciel du microscope DHM, par exemple, comme décrit dans Kemper et al. 26 et Langehanenberg et al. , 27.
    2. Déterminer le contraste de phase moyen Δφ dans les couches de tissus différents (épithélium, la sous - muqueuse, stroma) dans les régions choisies de manière appropriée des intérêts (ROI) 19.
    3. Déterminer l'indice de réfraction du milieu d'enrobage à l'aide d'un réfractomètre ou en variante en utilisant une valeur appropriée de la littérature. (valeurs d'indice de réfraction pour les médias typique d'enrobage: n eau = 1,334 28, n du tampon phosphate salin (PBS) = 1,337 29, n milieu de culture cellulaire = 1,337 à 1,339 29,30).
    4. Calculer les indices de réfraction des couches de tissu différentes des valeurs du contraste de phase moyenne 19
      figure-protocol-1 NOTE: Dans l' équation. 1 λ est la longueur d'onde de la lumière laser (ici: λ = 532 nm), d l'épaisseur des tissus disséqués (ici: 7 pm) et n moyen est l'indice de réfraction du milieu d' enrobage (ici: n moyen = n PBS = 1,337, déterminé par un abbé-réfractomètre).
  7. Reconstruire et évaluer des hologrammes numériques du time-lapse cicatrisation de la plaie observation de la série
    1. Reconstruire images quantitatives de phase à partir de la série temporelle lapse hologramme obtenu lors de l' observation de la cicatrisation des plaies avec le logiciel de microscope DHM 26,27.
    2. Normaliser chaque série d'images quantitatives de phase à l'image avec un contraste de phase maximale.
    3. Déterminer la surface S c qui est couverte par les cellules dans les images quantitatives DHM phase par la segmentation d' image, qui peut être parformé en utilisant la cellule profileur du logiciel libre (www.cellprofiler.org 31).
    4. Calculer le contraste de phase moyenne de la cellule des cellules dans la zone Δφ S c.
    5. Récupérez le cellulaire DM de masse sèche de la cellule Δφ de contraste de phase moyenne dans la zone S c 15
      figure-protocol-2 (2)
      NOTE: Dans l' équation 2 DM désigne la masse cellulaire sèche, S c présente la zone qui est occupée par les cellules et α = 0,002 m 2 / kg.
    6. Déterminer l'indice de réfraction n cellulaire cellule intégrale et l'indice de réfraction du milieu de culture cellulaire n moyenne. Déterminer n cellules séparément expérimentalement à partir de cellules en suspension comme décrit dans 30 et mesurer n moyenne avec un réfractomètre. Alternautiliser relativement valeurs de la littérature pour n cellules 30 et n moyenne 29,30.
    7. Calculer la cellule d moyenne épaisseur de la cellule de λ, cellule Δφ, n cellule et n moyenne 26,32
      figure-protocol-3 (3)
      NOTE: Dans l' équation. 3 la cellule paramètre d est l'épaisseur moyenne des cellules, λ désigne la longueur d' onde lumineuse de la lumière laser, une cellule Δφ désigne le contraste de phase moyenne, et n cellule et n moyen est l'indice de réfraction cellulaire intégré , et l'indice de réfraction du milieu environnant.

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Résultats

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Configuration typique pour DHM Imaging pour Digital Holographic Microscopy (DHM)

Pour effectuer l' imagerie du champ lumineux et quantitative DHM contraste de phase d' imagerie, nous avons appliqué un microscope inversé comme représenté sur la figure 1 B. Le système a été modifié par fixation d' un module de DHM, comme décrit précédemment 25. Hologr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous démontrons que DHM fournit une évaluation précise des dommages histologiques dans les modèles de colite murins et des échantillons humains de tissus colique ex vivo. En outre, nous avons montré DHM peut surveiller en permanence la cicatrisation épithéliale tout en fournissant simultanément l' information multimodale sur les altérations cellulaires. Dans DHM, la reconstruction d'hologrammes capturées numériquement est effectuée numériquement 32. Par conséquent, par rapport à la microscopi...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Faekah Gohar pour la relecture du manuscrit. Nous remercions Sonja Dufentester et Elke Weber pour leur assistance technique experte.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactifs
Azoxyméthane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AllemagneA5486
Flacon de culture cellulaireGreiner Bio-One, Frickenhausen, Allemagne658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, États-Unis4488
Sulfate de dextran sodique (DSS)TdB Consultation, Uppsala, SuèdeDB001
DMEM/Ham’s F12PAA Laboratories - Pasching - AutricheE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, AllemagneSPR3196
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AllemagneE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgique352070
Isopentane (2-méthylbutane)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, AllemagneM32631-1L
Bleu de méthylèneMerck, Darmstadt, Allemagne1159430025
Mitomycine CSigma - Aldrich, Deisenhofen, AllemagneM4287
Lames de microscopeG. Menzel, Braunschweig, AllemagneJ1800AMNZ
Composé O.C.T. Tissue Tek  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;Sakura, Zoeterwonde, Pays-Bas4583
Pen/Strep/Amphotericin BLonza, Verviers, Belgique1558
Saline tamponnée au phosphate, PBSLonza, Verviers, Belgique4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgique3626
Chlorure de sodium 0.9 %Braun, Melsungen, Allemagne5/12211095/0411
Régime standardAltromin, Lage, Allemagne1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Pays-Bas4566
Trypsine EDTALonza, Verviers, Belgique7815
Vitro &ndash ; CludR. Langenbrinck, Teningen, Allemagne04-0002  ;
  ; µ ;-Plat 35 mm avec insert de culture, highibidi GmbH, Munich, Allemagne81176
Couvercle DIC pour µ ;-Plats, avec insert en verreibidi GmbH, Munich, Allemagne80050<
strong>Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Microscope holographique numérique
ComponentModelCompany
Inverted MicroscopeiMICTill Photonics, Graefelfing, Germany
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Luebeck, Allemagne
Objectif de microscopeZeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Göttingen, Allemagne
Caméra CCDDMK 41BF02La source d’imagerie, Brême, Allemagne

Références

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