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Article de méthode

Ferriques murin Thrombose modèles induits par Chlorure

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DOI :

10.3791/54479

⸱

5 septembre 2016

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Dans cet article

Résumé

Nous rapportons une procédure raffinée du chlorure ferrique (FeCl 3) Les modèles de thrombose induites sur la carotide et l' artère mésentérique ainsi que la veine, caractérisé efficacement en utilisant la microscopie intravitale pour surveiller le temps de formation de thrombus occlusif.

Résumé

La thrombose artérielle (caillot sanguin) est une complication fréquente de nombreuses maladies systémiques associées à l’inflammation chronique, notamment l’athérosclérose, le diabète, l’obésité, le cancer et les troubles rhumatologiques auto-immuns chroniques. Les thrombus sont la cause de la plupart des crises cardiaques, des accidents vasculaires cérébraux et de la perte des extrémités, ce qui fait de la thrombose un problème de santé publique extrêmement important. Étant donné que ces thrombus résultent d’une activation plaquettaire inappropriée et d’une coagulation ultérieure, le ciblage thérapeutique de ces systèmes a une importance clinique importante pour le développement de traitements plus sûrs. En raison de la complexité du système hémostatique, les expériences in vitro ne peuvent pas reproduire les interactions de la paroi du sang vers les vaisseaux ; Par conséquent, les études in vivo sont essentielles pour comprendre les mécanismes pathologiques de formation de thrombus. À cette fin, divers modèles de thrombose ont été développés chez la souris. Parmi eux, les lésions vasculaires induites par le chlorure ferrique (FeCl3) sont un modèle largement utilisé de thrombose occlusive qui rapporte l’activation et l’agrégation plaquettaires dans le contexte d’un système vasculaire fermé aseptique. Ce modèle est basé sur les lésions des cellules endothéliales induites par l’oxydoréduction, qui sont simples et sensibles aux médicaments anticoagulants et antiplaquettaires. Le temps nécessaire au développement d’un thrombus qui obstrue le flux sanguin donne une mesure quantitative des lésions vasculaires, de l’activation et de l’agrégation plaquettaires qui est pertinente pour les maladies thrombotiques. Nous avons considérablement affiné ce modèle de thrombose vasculaire induite par FeCl3, ce qui rend les données hautement reproductibles avec une variation minimale. Nous décrivons ici le modèle et présentons des données représentatives de plusieurs montages expérimentaux qui démontrent l’utilité de ce modèle dans la recherche sur la thrombose.

Introduction

La thrombose artérielle (caillot de sang) est une complication fréquente de nombreuses maladies systémiques associées à une inflammation chronique, y compris l'athérosclérose, le diabète, l'obésité, le cancer et les troubles rhumatologiques auto-immunes chroniques. Thrombus qui se produisent dans la tige de la circulation artérielle de l'activation plaquettaire inappropriée, l'agrégation et les mécanismes coagulatory ultérieurs, et sont impliqués dans les crises cardiaques, accidents vasculaires cérébraux et la perte de l'extrémité. La paroi du récipient est un système complexe qui comprend plusieurs types de cellules et elle est influencée par une multitude de facteurs extérieurs , y compris la contrainte de cisaillement, les cellules sanguines circulantes, des hormones et des cytokines, ainsi que l' expression des protéines anti - oxydantes dans la paroi du vaisseau. Expériences in vitro ne peuvent pas se répliquer cet environnement complexe et donc des études in vivo sur des modèles animaux sont essentiels pour permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les troubles thrombotiques.

Les souris ont démontré que simmécanismes ilaires aux humains en termes de la thrombose, l' athérosclérose, l' inflammation et le diabète 1,2. En outre, les souris transgéniques et knock-out peuvent être créés pour tester la fonction des produits spécifiques du gène dans un complexe physiologique ou de l'environnement pathologique. De telles études imitent la pathologie humaine et peuvent fournir des informations mécaniste importantes liées à la découverte de nouvelles voies et de thérapies, ainsi que de fournir des détails importants pour caractériser les effets des médicaments sur la thrombose.

Thrombus artériels pathologiques sont dues à une lésion endothéliale de couche ou d'un dysfonctionnement et l' exposition du flux sanguin vers la matrice subendothelial 3,4. Différents modèles de thrombose ont été développés pour induire ces dommages endothéliaux tels que les lésions mécaniques, une lésion par oxydation à base de Bengale composé photoréactif Rose et 5 blessure au laser. Dans ce spectre, le chlorure ferrique (FeCl 3) induite par une lésion vasculaire est un modèle largement utilisé de la thrombose. Ce réactif lorsqueappliquée sur la face externe des vaisseaux induit des dommages oxydatifs des cellules vasculaires 6-8, avec une perte de protection des cellules endotheliales à partir de plaquettes et les composants de la cascade de coagulation en circulation. Le modèle FeCl3 est simple et sensible à la fois des médicaments anticoagulants et antiplaquettaires, et a été réalisée sur la carotide et des artères fémorales, les veines jugulaires et mésentériques et les arterioles crémaster et veinules chez les souris, les rats, les cobayes et les lapins 6-15.

Un paramètre mesurable dans ce modèle est le temps écoulé de la blessure à l' occlusion complète du vaisseau, mesurée comme la cessation de l' écoulement sanguin avec un débitmètre doppler ou sous observation directe avec la microscopie intravitale 6,7,9. Une plage de temps comprise entre 5 et 30 min a été rapporté dans plusieurs études chez des souris C57BL6 7-10,16, ce qui suggère que FeCl 3 concentrations, les types d'anesthésie, les techniques chirurgicales, l' âge de la souris, fond génomique, la méthode de mesure de bflux lood, et d'autres variables environnementales ont des effets significatifs dans ce modèle. Cette grande variabilité rend difficile de comparer les études de différents groupes de recherche et peut détecter des différences subtiles difficiles.

Une vision de minimiser ces variabilités et établir une manière uniforme et reproductible dans un système de modèle in vivo, nous avons affiné le modèle d'artère carotide FeCl 3 induite par le fait que les données hautement reproductibles avec une variation minimale 6-10,16-19. Dans cet article, nous décrivons et partageons les compétences et présentons plusieurs exemples expérimentaux représentatifs qui peuvent bénéficier de ce modèle.

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Protocole

Toutes les procédures et les manipulations des animaux ont été approuvés par Institutional Animal Care et l' utilisation des comités (IACUC) de la Cleveland Clinic, conformément à la politique des États-Unis Service de santé publique sur les soins Humane et l' utilisation des animaux, et le NIH Guide pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparatifs:

  1. Dye Fluorescent pour l' étiquetage des plaquettes
    1. Préparer une solution 6G rhodamine, 0,5 mg / ml dans une solution saline et de stériliser la solution avec filtre de 0,22 um.
  2. Une solution de FeCl3
    1. Faire une solution mère fraîche de 30% FeCl 3 (anhydres, est égal à 1,85 M) dans de l' eau pure, et le filtre avec 0,45 um filtre. Préparer 5 ml fraîche solution de FeCl3 à la concentration désirée [par exemple, 2,5% (0,154 M), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) et 12,5% (0,771 M)] de la dilution de la solution de FeCl3 avec de l' eau i 30%na 6 cm boîte de culture de tissus et de garder le couvercle fermé.
      REMARQUE: Utilisation de la boîte de culture, il est plus facile de ramasser le papier filtre saturé avec FeCl3 solution que de le ramasser à partir d' un récipient étroit, comme un tube de 1,5 ml. FeCl3 est extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et une blouse de laboratoire, etc., équipement de protection individuelle, doit toujours être pris.
  3. Papiers filtres
    1. Couper le papier filtre à 1 mm x 2 mm de taille. Faire tremper suffisamment de morceaux de papier filtre de coupe dans la solution de FeCl 3 dans le même plat.
  4. Papavérine Hydrochloride Solution
    1. Préparer une solution de chlorhydrate de papaverine (25 mg / ml) dans de l'eau et de stériliser la solution avec filtre de 0,22 um.
  5. Gel d' agarose
    1. Préparer un gel d'agarose à 2% dans du PBS ou une solution saline à 6 puits une plaque de culture tissulaire, ~ 1 cm d'épaisseur, et cut à demi-cercle avec cm de diamètre ~ 3.

2. FeCl3 Induced carotidienne Arterial Injury Thrombose Modèle

  1. Interventions chirurgicales pour le modèle Thrombosis
    1. Utilisez 8 - souris C57BL6 12 semaines (ou d'autres souches que nécessaire). Anesthésier les souris avec le mélange de kétamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) par injection intrapéritonéale. Confirmer la profondeur de l'anesthésie par orteil pincement.
      NOTE: Ce montant de la kétamine / xylazine est suffisante pour maintenir l'animal en anesthésie stable et sans douleur (réponse aux pieds pincement) pendant au moins 1 h.
    2. Retirez la fourrure sur le cou et la poitrine avec une petite tondeuse électrique animal. Crème dépilatoire est pas nécessaire. Appliquer neutre pommade oculaire de pétrole sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
    3. Fixer la souris dans la position couchée sur le couvercle de 15 cm de la plaque de culture de tissu. Utilisez une longue bande (~ 10 cm) pour fixer hinmembres d et le bas du corps, et deux morceaux de petite bande (2 cm x 0,5 cm) pour fixer les pattes antérieures. Utilisez un fil de suture 4-0 pour envelopper les incisives, du ruban adhésif les deux extrémités de la suture sur le couvercle pour maintenir le cou de la souris droite (Figure 2).
    4. Placer la plaque avec la tête de la souris vers l'opérateur sous une source de lumière chirurgicale.
    5. Stériliser le site chirurgical avec un tampon d'alcool. Utilisez les micro-Adson Forceps pour maintenir la peau et d'utiliser une paire de ciseaux chirurgicaux pour faire une petite incision (2 - 3 mm).
    6. Maintenir la peau de l'incision avec la pince et insérer des ciseaux chirurgicaux avec mâchoires fermées dans l'incision. Poussez les ciseaux sous-cutanée vers le manubrium ou le menton, puis ouvrir les ciseaux pour libérer la peau de la couche sous-cutanée.
    7. Couper la peau avec des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision médiane du manubrium au niveau de l' os hyoïde (figure 3A et 3B). Carrément disséquer le fascia mince (ligne pointillée, en Figure 3B) entre les glandes sous - maxillaires avec une amende hémostatique et une pince Graefe (figure 3B et 3C; flèches bleues).
      NOTE: Le manubrium (flèche noire sur la figure 3C) et la trachée (T à la figure 3C) seront vus après cette étape.
    8. Tenir les tissus mous et la peau vu à droite de la manubrium avec la pince Graefe, insérez le hémostatique sous le fascia vers la position 2 heures (ligne jaune en pointillés sur la figure 3C), ouvrir les mâchoires de la pince hémostatique pour libérer le veine jugulaire du tissu environnant.
    9. Couper le fascia, des tissus mous et de la peau vers la position 2 heures (figure 3C) avec les ciseaux chirurgicaux pour exposer la veine jugulaire droite (Figure 3D, flèche).
    10. Dessinez environ 200 - solution 6G 300 ul de rhodamine en utilisant une seringue de 1 ml avec 22 aiguille G, puis le changementà 30 aiguille G.
      NOTE: Cela protège l'aiguille 30 G contre les dommages de sa pointe fine. dessin directement la solution rhodamine 6G avec l'aiguille 30 G ne sera pas endommager la pointe; toutefois toucher la paroi du récipient accidentellement causera des dommages, ce qui peut rendre difficile l'injection.
    11. Rincer l'aiguille de 30 G en poussant lentement la solution 6G rhodamine, assurez-vous pas de bulles d'air dans la seringue ou l'aiguille. Gardez 100 solution 6G ul de rhodamine pour injection.
    12. Bend 2 - 3 mm pointe de l'aiguille à un angle de 90 ° avec le porte-aiguille, qui permettra d' éviter d' insérer l'aiguille trop profond pour la veine jugulaire et rend l'injection plus facilement contrôlée (Figure 3D).
    13. Injecter la solution rhodamine 6G dans la veine jugulaire droite aux plaquettes de l'étiquette. Pour stabiliser la seringue et maintenir l'aiguille en position, tenez la seringue d'une main et l'aiguille avec la pince Graefe avec une autre main pendant le injection.Afinjection de ter, serrer le site d'injection avec la pince Graefe pour éviter les saignements.
    14. Ouvrir les mâchoires de la pince hémostatique et l'insérer sous les pinces Graefe pour serrer la paroi du vaisseau du site d'injection, puis ligaturer le site d'injection avec une suture 6-0.
      NOTE: Comme une alternative de l' étape 2.1.15, en appliquant une pression sur le site d'injection avec un doigt pendant 2 minutes va arrêter le saignement; Cependant, cette méthode présente un risque de causer des saignements si le caillot au niveau du site d'injection est retiré accidentellement plus loin.
    15. Carrément disséquer les tissus mous et fascia autour de la glande sous - maxillaire gauche avec le hémostatique et la pince Graefe et tirez la glande vers la position 7 heures (Figure 3E) pour exposer le muscle sterno gauche (flèche bleue dans la figure 3E).
    16. Carrément disséquer le fascia (Figure 3E, ligne pointillée) entre le muscle sterno gauche et le muscle omo - hyoïdien ou sternohymuscle oid (Figure 3E, flèche verte) situé sur le site gauche de la trachée avec le hémostatique.
    17. Passez une aiguille avec une suture de soie 6-0 (environ 15 cm de long) sous le milieu du muscle sterno (flèche bleue dans la figure 3E), mettre les deux extrémités de la suture ensemble et tirer la suture latéralement vers la position 10 heures .
      NOTE: Cette procédure doit être effectuée avec précaution pour éviter les blessures de la veine jugulaire gauche, qui est situé en dehors du muscle sterno.
    18. Carrément séparer le muscle sterno mince et / ou de muscle omo - hyoïdien pour exposer l'artère carotide (CA) (Figure 3F flèche) après avoir tiré loin du muscle sterno. Coupez le muscle sterno et / ou de muscle omo-hyoïdien que nécessaire. Utilisez le hémostatique pour séparer les tissus mous de CA sans toucher le CA.
      NOTE: CA est accompagné par le nerf vague, la structure blanche vu dans Figure 3G (flèche verte), et dans la plupart des cas , il est sous le muscle sterno mince et / ou de muscle omo - hyoïdien (entre les lignes en pointillés jaunes dans la figure 3F).
    19. Utilisez une pince fine pointe pour ramasser le fascia latéral autour du CA, tout en évitant le nerf vague et CA. Utilisez une autre pince fine pointe pour percer un trou sur le fascia entre le CA et le nerf vague.
    20. Passez le crochet à travers le trou et soulevez doucement le CA, puis placer la pince fine pointe sous la CA. Déplacer le crochet et pince dans des directions opposées le long de la CA pour dépouiller les tissus mous adventice. Gratuit au moins ~ 5 mm de longueur de CA (Figure 3H, flèche bleue) du tissu environnant.
    21. Pour bloquer la fluorescence de fond, appuyez sur la fin d'un plastique agitateur de café noir plat, recoupé l'agitateur de café dans une pièce de 3 mm, puis couper longitudinalement le long des arêtes de pliage pour obtenir deux morceaux de "U" en plastique (Figure 3H, vert flèche).
    22. Rincer un morceau de ce "U" en plastique avec une solution saline et maintenez - le avec une pince et le placer sous le CA tout en soulevant doucement le CA avec le crochet (Figure 3H, flèche verte). Appliquer immédiatement 2-3 gouttes de solution saline pour éviter le dessèchement du CA.
  2. En temps réel Enregistrement vidéo
    1. Transférer le couvercle de la souris et de la plaque ensemble pour la platine du microscope et placer dans une position appropriée sous la lentille d'eau 10X. Remplir l'espace entre la lentille et l'AC 10X avec du sérum physiologique.
    2. Démarrez l'application de logiciel d'enregistrement vidéo numérique, et de lancer un nouveau fichier et nommez-le en conséquence. Enregistrez les images des vaisseaux normaux et notez le numéro de l'image lorsque l'enregistrement vidéo est arrêté.
      NOTE: Référence du logiciel d'enregistrement vidéo dans l'ordinateur pour l' enregistrement. Nous utilisons un logiciel d'enregistrement vidéo numérique et les descriptions suivantes sont basées sur cette application.
      NOTE: Depuis tra mécaniqueuma peut blesser l'endothélium et conduire à la formation de thrombus 20, il est nécessaire de confirmer qu'il n'y a pas de blessure chirurgicale à la paroi du vaisseau avant la blessure FeCl 3. Il est également nécessaire de confirmer qu'il n'y a pas de reste de tissu autour de l'autorité de certification, ce qui peut constituer une barrière et d' atténuer l'effet de la lésion induite par le FeCl 3. Notez le numéro de l'image des enregistrements, il sera facile d'analyser les vidéos selon le temps écoulé plus tard.
    3. Déplacez la souris avec couvercle de la plaque sur la lentille 10X. Pliez un coin d'une serviette en papier pour faire une pointe fine et fine et l'utiliser pour éponger soigneusement la solution saline dans le CA (évitez de toucher CA), ainsi que dans d'autres endroits dans le domaine chirurgical. Ceci est important pour éviter la dilution de la solution de FeCl 3 utilisé.
    4. Utilisez une pince fine pointe et ramasser un morceau de papier filtre saturé avec une solution de FeCl3 et le placer directement sur ​​le CA et le garder sur place pendant 1 min.
      NOTE: To la visualisation de l' aide de la circulation sanguine et de la récolte des données précises, placez le papier filtre à proximité de l'extrémité distale de l'exposé CA (Figure 3I) et laisser un court segment sur ​​le site proximal (flèche verte dans la figure 3I) pour observer le flux sanguin à la fin phase (voir ci-dessous).
    5. Retirez le papier filtre (ce point de temps est défini comme étant le début de "après la blessure") et rincer le CA avec une solution saline (au moins 2 ml).
    6. Placez la souris avec plaque couvercle vers l'objectif 10X; observer le navire et commencer à enregistrer des images vidéo. Notez le numéro de l'image vidéo à la fin de la première minute d'enregistrement.
      NOTE: La formation de thrombus est identifié par l' accumulation des plaquettes fluorescentes, qui est observée dans les images vidéo en temps réel sur l' écran d'ordinateur ou sous microscope. images vidéo d'enregistrement immédiatement après avoir mis la souris en arrière sous le microscope. Continuer l'enregistrement à la fin de la première minute après le retrait du fpapier ilter. Observer le navire entier de l'extrémité distale vers les sites proximaux pour obtenir des informations sur la blessure, puis se concentrer sur la zone d'intérêt (est habituellement le centre de la zone lésée) pour plus d'imagerie.
    7. Enregistrez des images vidéo pendant 10 secondes toutes les minutes pendant les 10 premières minutes (par exemple, 2:55-3:05), puis 10 secondes toutes les minutes jusqu'à la fin de l'expérience. Notez les numéros de châssis lorsque chaque enregistrement est arrêté.
      NOTE: Les points du modèle d'extrémité sont: 1) lorsque le flux sanguin a cessé de> 30 sec; ou 2) si l'occlusion ne se voit pas à 30 minutes après la lésion. Dans ce cas, utiliser 30 min pour l'analyse statistique. Set Temps d'exposition de l'enregistrement vidéo en 10 msec au début, de sorte qu'il sera facile d'observer le flux sanguin dans le thrombus. Lorsque les thrombus deviennent grandes et la fluorescence saturent le capteur de l'appareil photo, il devient difficile d'identifier le flux de sang sur thrombus. Pour résoudre ce problème, déplacez le CE d'imagerienter sur le site indemne de proximal (Figure 3I, flèche verte) où le flux sanguin peut encore être clairement observé. Nous augmentons aussi le temps Expose à 15 ou 20 msec lors de la focalisation sur le site non-blessé proximale, de sorte que le flux sanguin peut être observé plus clairement. Lorsque le flux sanguin cessera, de nombreuses cellules plus grandes (leucocytes) commencent à rouler sur la paroi du vaisseau sur le site proximal du thrombus. Écoulement arrête habituellement dans les 2 - 3 min après l'apparition de grandes cellules. Notez le temps Exposer sur la feuille d'enregistrement si elle est modifiée. Cela prend habituellement environ 30 minutes de l'anesthésie à la fin de l'expérience, si les souris C57BL6 de type sauvage normaux ont été utilisés.
      ATTENTION NOTE: Ne pas utiliser le blanc agrégé plaquettaire caillot comme le signe de la cessation du flux sanguin, ce qui ne donnera pas une donnée précise et elle est affectée par le temps d'exposition. Le caillot blanc couvert la lumière du vaisseau ne signifie pas que le flux sanguin cessé (voir la vidéo représentant 1).
    8. A la fin de l'expérience, euthanasier les souris en utilisant une surdose de kétamine / xylazine (200/20 mg / kg), suivie par dislocation cervicale après avoir confirmé pas de souffle et le rythme cardiaque.

3. FeCl3 Induced artère mésentérique / Thrombose veineuse Modèle

  1. Anesthetize 8 - souris C57BL6 12 semaine mentionné dans la section 2.1.1. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
  2. Injecter solution papavérine (total de 0,4 mg / souris) par voie intrapéritonéale pour inhiber l'intestin péristaltisme.
  3. Retirez la fourrure sur le cou et l'abdomen avec une tondeuse électrique animal. Crème dépilatoire est pas nécessaire.
  4. Fixer la souris dans la position couchée sur le couvercle de 15 cm de la plaque de culture de tissu. Utilisez quatre morceaux de petite bande (2 cm x 0,5 cm) pour sécuriser toutes les jambes. Utilisez un fil de suture 4 -0 à enrouler autour des incisives, du ruban adhésif les deux extrémités de la suture sur le couvercle pour maintenir le cou droit (figure 2).
  5. Suivre les procédures 2.1.4 -2.1.15 pour exposer la veine jugulaire pour l'injection de rhodamine 6G aux plaquettes de l'étiquette.
  6. Effectuer une incision médiane à travers la peau de xiphoid à bas de l' abdomen à l' aide des ciseaux chirurgicaux (figure 4A). Décrochez le péritoine du milieu (aussi appelé linea alba, la figure 4A, flèche) avec une pince Graefe, qui est claire et a pas de vaisseaux sanguins, lever environ 2 - 3 mm de haut, confirment pas l' intestin sous la ligne de coupe, et couper le péritoine ouvert longitudinalement avec les ciseaux fins (figure 4B).
  7. Re-fixer les souris à la position latérale droite. Placer le gel d'agarose demi-cercle près de l'abdomen, et extérioriser doucement les intestins et l' étaler sur le dessus du gel avec la pince Graefe (Figure 4C). Utilisez les deuxièmes branches pour l'expérience de la thrombose (figure 4C, flèche).
    REMARQUE: Utilisez la pince hémostatique ou une pince Micro-Adson pour aider à extérioriser les intestins. Évitez de blesser lel'intestin et le récipient.
  8. Placer 5-6 gouttes du sérum physiologique pour garder l'humidité de l'intestin et des vaisseaux. Transférer la souris avec le couvercle de la plaque ensemble pour la platine du microscope et placer en position appropriée sous la lentille sèche 10X.
    REMARQUE: Utilisez un objectif à sec parce que la membrane jéjuno - iléal ne peut pas tenir la solution saline. Assurez-vous de déposer une solution saline sur les tissus exposés pour les garder humides.
  9. Tamponnez la solution saline autour de l'artère mésentérique et la veine avant le traitement.
  10. Utilisez une pince fine pointe pour ramasser un morceau de papier filtre saturé avec 12,5% d'une solution de FeCl 3 et le placer directement sur ​​l'artère mésentérique et la veine pendant 1 min (Figure 4D). Retirez le papier du filtre (ce point de temps est défini comme étant le début de "après une blessure") et rincer l'artère mésentérique blessés et de la veine avec une solution saline (au moins 2 ml).
  11. Placez la souris avec plaque couvercle arrière sous la lentille sèche 10X; observer les navires et commencer à recimages vidéo ord comme mentionné dans 2.2).
    NOTE: Les points de cette expérience d'extrémité sont: 1) lorsque le flux sanguin a cessé de> 30 sec; ou 2) si l'occlusion ne se voit pas en 30 min après une blessure, et dans ce cas utiliser 30 min pour l'analyse statistique.
  12. A la fin de l'expérience, euthanasier les souris en utilisant une surdose de kétamine / xylazine (200/20 mg / kg), suivie par dislocation cervicale après pas de souffle et le cœur battant sont confirmées.

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Résultats

Carotidienne Thrombose Modèle
Chez les souris avec C57BL6 fond, nous recommandons d' utiliser 7,5% FeCl 3 pour traiter la cuve pendant 1 min en tant que point de départ. Sous traitement de 7,5% FeCl 3, les frontières de la zone lésée et la paroi du vaisseau normal sont facilement identifiables au microscope (voir la vidéo en ligne 1), ce qui suggère que la couche endothéliale a été considérablement endomm...

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Discussion

Le FeCl 3 induite par le modèle est l' un des modèles de thrombose les plus largement utilisés, qui peut non seulement fournir des informations précieuses sur les modifications génétiques sur la fonction plaquettaire et la thrombose 7,8,16,19,31-33, mais peut aussi être un outil précieux pour l' évaluation des composés thérapeutiques et des stratégies pour le traitement et la prévention des maladies athérothrombotiques 11,17,34-37. Ici, nous avons montré nos modifications et amél...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) des National Institutes of Health sous les numéros de prix R01 HL121212 (PI : Sen Gupta), R01 HL129179 (PI : Sen Gupta, Co-I : Li) et R01 HL098217 (PI : Nieman). Le contenu de cette publication relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ciseaux chirurgicaux - Carbure de tungstèneFine Science Tools  ;14502-14couper et maintenir la peau
- Dentelée/Droite/12 cmOutils de science fine  ;11018-12Couper et maintenir la peau
Ciseaux Metzenbaum Fino - Carbure de tungstène/Courbé/Émoussé-émoussé/14,5 cmOutils de science fine  ;14519-14  ;   ;pour disséquer et séparer les tissus mous
Hémostat ultra fin - Lisse/Courbé/12,5 cmOutils de science fine  ;13021-12pour disséquer et séparer les tissus mous
Pince Graefe - Dentelée/Droite/10 cmOutils de science fine  ;11050-10pour disséquer et séparer les tissus mous
Dumont #5 Fine Forceps - Biology Tips/Straight/Inox/11 cmFine Science Tools  ;11254-20  ;Isoler le vaisseau du tissu environnant
Pince #5XL Dumont - Pointes Standard/Droite/Inox/15 cmOutils Scientifiques Fins11253-10Isoler le récipient du tissu environnant
Crochet émoussé - 12 cm/0,3 mm Diamètrela pointe Outils scientifiques fins.10062-12Isoler le vaisseau du tissu environnant
Castroviejo Micro Needle HoldersFine Science Tools  ;12061-02Porte-aiguilles
Fil de suture 4-0Fine Science Tools  ;18020-40Pour fixer les incisives à la plaque
Fil de suture 6-0Outils de science fine  ;18020-60Pour toutes les chirurgies et ligatures Aiguilles
suture KaltOutils scientifiques fins  ;12050-03
rhodamine 6G  ;Sigma83697-1GPour lebel plaquettes
FeCl3 (Anhydre)Sigma12321Pour induire des lésions vasculaires
Chlorhydrate de papavérineSigmaP3510Pour inhiber le péristaltisme intestinal.
Medline Instrument Chirurgical Stérilisation Vapeur Autoclave RubansMedline111625Pour fixer la souris à la plaque
Fisherbrand&trade ;   ; Filtres pour seringues - Stériles 0,22 & micro ; mFisher09-720-004Pour la stérilisation de solutions injectées à des souris Fisherbrand
&trade ;   ; Filtres pour seringues - Stériles 0,45 & micro ; mFisher09-719DPour filtrer la solution de FeCl3
Tampon de préparation à l’alcool stérileFisher06-669-62Pour stériliser le site chirurgical
Agarose  ;BioExpressE-3120-500Pour fabriquer
microscope fluorescent Leica DMLFSun microscope Leica
plate-forme GIBRALTAR et un système de platine X-Y avec plaque chauffante fixée.npi electronic GmbHhttp://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 logicielNorPixhttps://www.norpix.com/
Pince Micro-Adson pour de de un à platine gel, Intravital, une

Références

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
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