Évaluation rapide et spécifique de l'halogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes

Résumé

Ce protocole décrit l’enrichissement rapide des leucocytes à partir de petits échantillons de sang pour une détermination spécifique ultérieure de l’activité halogénante de la peroxydase dans les cellules. La méthode peut être appliquée à du matériel humain et non humain et peut contribuer à l’évaluation de nouveaux marqueurs inflammatoires.

Résumé

Dans cet article, un protocole pour l'enrichissement rapide et homogène des leucocytes à partir de petits échantillons de sang entier est décrit. Cette procédure est basée sur la lyse hypotonique des érythrocytes et peut être appliqué à des échantillons humains, ainsi que le sang d'origine non humaine. Le petit volume d'échantillon initial d'environ 50 à 100 ul rend cette méthode applicable au prélèvement de sang périodique de petits animaux de laboratoire. En outre, l'enrichissement des leucocytes est réalisé en quelques minutes et avec des efforts matériels faibles en ce qui concerne les produits chimiques et de l'instrumentation, ce qui rend cette méthode applicable dans les environnements de laboratoire multiples.

La purification normalisée des leucocytes est combiné avec un procédé hautement sélectif de coloration pour évaluer l' activité de la peroxydase halogénation des peroxydases de l' hème, la myéloperoxydase (MPO) et éosinophile peroxydase (EPO), à savoir la formation d'hypochloreux et de l' acide hypobromeux (HOCl et HOBr). Alors que FTU est fortement exprimé dans neutrophils, immunitaire de type cellulaire le plus abondant dans le sang humain, ainsi que dans les monocytes, l'enzyme lié à l'EPO est exclusivement exprimé dans les éosinophiles. L'activité d'halogénation de ces enzymes est traitée en utilisant la fluorescéine presque HOCl- et HOBr colorant spécifique aminophényl (CSA) et le substrat de la peroxydase primaire du peroxyde d'hydrogène. Lors de l'analyse ultérieure de cytométrie de flux de toutes les cellules positives à la peroxydase (neutrophiles, les monocytes, les éosinophiles) sont distinguables et leur activité de peroxydase d'halogénation peuvent être quantifiés. Etant donné que la coloration du CSA peut être combiné avec l'application de marqueurs de surface cellulaire, ce protocole peut être étendu pour traiter spécifiquement les sous-fractions de leucocytes. Le procédé est applicable à la détection de HOCl et HOBr la production à la fois chez l'homme et dans les leucocytes de rongeurs.

Étant donné le rôle immunologique largement et diversement discuté de ces produits enzymatiques dans les maladies inflammatoires chroniques, ce protocole peut contribuer à une meilleure compréhension de lapertinence immunologique de peroxydases hème leucocytaires dérivés.

Introduction

Les leucocytes polynucléaires (PMN, également appelés granulocytes et monocytes) représentent les composants cellulaires importants du système immunitaire inné du ^1,2 sanguin. Elles contribuent à la première ligne de défense contre les agents pathogènes ainsi qu'à l'activation du système immunitaire acquis , et l'initiation d'une réponse inflammatoire systémique ^2-4. Pourtant , en particulier des neutrophiles, le type de granulocytes le plus abondant, et monocytes contribuent également de manière significative à la réglementation et à la fin des événements inflammatoires aigus ^5. Par conséquent , ces cellules peuvent é....

Protocole

Tous les échantillons de sang humain ont été obtenus chez des volontaires sains, et le protocole d'enrichissement leucocytaire appliqué suit les lignes directrices de l'éthique commission de la Faculté de médecine de l'Université de Leipzig. Les expériences avec le sang de rat ont été approuvés par le comité d'éthique local responsable (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), selon les directives allemandes sur le soin des animaux et l'utilisation.

1. Configuration expérimentale

NOTE: Comme la procédure de lyse hypotonique de l'épuisement des érythrocytes à partir des échantillons de sang e....

Résultats

Comme indiqué précédemment le procédé décrit ci - dessus avéré être applicable aussi bien aux humains et aux matières non humain ^32. En outre, comme indiqué pour les souris présentant des symptômes asthmatiques la coloration APF peut être un outil approprié pour détecter des différences dans l'état pro-inflammatoire systémique. Par conséquent , dans une étude ultérieure , nous avons utilisé ce protocole pour évaluer de façon répétée l'activité d'halogénation du MPO.......

Discussion

Que les neutrophiles sont les plus abondants dans les leucocytes du sang humain l'isolement de cellules peroxydase positives concentre souvent uniquement sur ​​ces cellules et comprend une séparation des neutrophiles à partir d' autres leucocytes par centrifugation sur gradient de densité ^38. Pourtant , comme les neutrophiles sont beaucoup moins abondantes dans les échantillons sanguins murins ³⁹ pour les méthodes plus complexes ces dernières doivent être utilisées ^40. Par ailleu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériaux/Équipements
Tubes de centrifugation de 15 ml	VWR/Corning	734-0451-Tubes
d’échantillons de 1,5 ml	VWR/Eppendorf	211-2130DE
Pipettes pour des volumes allant jusqu’à 5 ml	Eppendorf	par ex. , 3120000070	Nous utilisons des pipettes Eppendorf Resarch plus avec des volumes réglables dans la plage 1-10 & micro ; l, 10-100 et micro ; l, 100-1 000 et micro ; l an 500-5 000 & micro ; l
banc à flux laminaire	Thermo Electron Corperation	HeraSafe-Vortex
mélangeur	Cintreuse & Hobein AG	Vortex Genie	2-Centrifugeuse
table	Kendro Laboratory Products	Laborfuge 400R	La centrifugeuse doit pouvoir être utilisée à 450 x g
Petite centrifugeuse	Eppendorf	5415D	La centrifugeuse doit pouvoir être utilisée à 400 x g
Incubateur	Heraeus	cytoperm 2	Réglages : 37 ° ; C, 95 % d’humidité, 5 % de teneur en CO2
spectrophotomètre UV-Vis	Varian	Cary 50 bio	Un spectre compris entre 200 et 300 nm doit être enregistré. Ainsi, des cuvettes en quartz doivent être appliquées Cytomètre
flux	Becton, Dickinson	BD Facs Calibur	On peut utiliser n’importe quel cytomètre en flux équipé d’un laser adapté à l’excitation de la fluorescéine (par exemple , laser argon 488 nm)
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Chemicals
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	amresco	K812	, prête à l’emploi
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	comprimés à résoudre dans 200 ml d’eau milliporeuse
Solution saline équilibrée Hanks (HBSS) avec Ca2+	Sigma-Aldrich	H1387	970 mg/100 ml, vérifier soigneusement et ajuster la valeur du pH à 7,4
Acide chlorhydrique	Merck Millipore	1.09057.1000	1 M solution
Hydroxyde de sodium	Riedel-deHaë ; n	30620	Granulés solides. Pour une solution à 1 M, résoudre 4 g/100 ml d’eau Millipore
Aminophénylfluorescéine	Cayman	10157	solution à 5 mg/ml (11,81 mM) dans de l’acétate de méthyle, des aliquotes (par exemple 100 & micro ; l) doit être préparé et stocké à -20 ° ; C
Peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich	H1009	Cette solution mère à 30 % correspond à une concentration d’environ 8,8 M. D’autres dilutions doivent être fraîchement préparées dans de l’eau distillée immédiatement avant l’utilisation et quantifiées par des mesures d’absorbance
Hydrazide d’acide 4-aminobenzoïque (4-ABAH)	Sigma-Aldrich	A41909	Une première solution mère de 1 M doit être préparée dans du DMSO, une seconde de 100 mM par dilution 1:10 dans des produits chimiques HBSS
DMSO	VWR	23500.26	-

de en solution stérile