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Article de méthode

Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

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DOI :

10.3791/54497

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28 septembre 2016

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1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

Dans cet article

Résumé

Le protocole suivant décrit la préparation et l’utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d’oxydation du glucose et des acides gras dans le cœur isolé du rat actif. Les méthodes utilisées pour l’analyse des échantillons et l’interprétation des données sont également abordées.

Résumé

Le coeur de mammifère est un grand consommateur d'ATP et nécessite un apport constant de substrats énergétiques pour la contraction. Sans surprise, les altérations du métabolisme du myocarde ont été associés au développement d'un dysfonctionnement contractile et l'insuffisance cardiaque. Par conséquent, démêler le lien entre le métabolisme et la contraction devrait faire la lumière sur certains des mécanismes qui régissent l'adaptation cardiaque ou maladaptation dans les états pathologiques. L'isolement de travail de préparation de coeur de rat peut être utilisé pour suivre simultanément et en temps réel, la fonction contractile cardiaque et le flux d'énergie fournissant des substrats dans des voies métaboliques oxydatives. Le présent protocole vise à fournir une description détaillée des méthodes utilisées dans la préparation et l'utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d'oxydation du glucose et des acides gras, l'énergie principale fournissant des substrats du cœur. Les méthodes utilisées pour l'analyse de l'échantillon et l'interprétation des données sont également discutés.En bref, la technique est basée sur la fourniture de 14 C- glucose radiomarqué et un acide gras à longue chaîne radiomarqué 3 H- à un cœur battant ex vivo par perfusion cristalloïde normothermique. 14 CO 2 et 3 H 2 O, fin des sous - produits de les réactions enzymatiques impliquées dans l'utilisation de ces substrats énergétiques fournissant, sont ensuite quantitativement récupérées à partir de l'effluent coronaire. Avec la connaissance de l'activité spécifique des substrats radiomarqués utilisés, il est alors possible de quantifier individuellement le flux de glucose et d'acide gras dans les voies d'oxydation. la fonction contractile du cœur isolé peut être déterminée en parallèle avec l'appareil d'enregistrement approprié et directement corrélé aux valeurs de flux métaboliques. La technique est très utile pour étudier la relation métabolisme / contraction en réponse à diverses conditions de stress telles que des altérations de pré et après la charge et de l'ischémie, un médicament ou un circulafacteur ting ou après la modification de l'expression d'un produit génique.

Introduction

Pertinence clinique

Au coeur des mammifères, il existe une forte relation positive entre le flux de substrats par les voies métaboliques oxydatives, la génération d' ATP et le travail cardiaque 1. Au cours des deux dernières décennies, l'enquête sur le lien complexe entre le métabolisme et la fonction cardiaque a conduit à reconnaître que des altérations du métabolisme cardiaque sont une cause de dysfonctionnement contractile et le remodelage structurel éventuellement pathologique dans le cadre de différents types de maladies cardiaques 2-4. Par conséquent, il est prévu que notre compréhension des mécanismes qui régissent le remodelage métabolique du cœur souligné conduira à l'identification de cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement de l' insuffisance cardiaque 5-7. La récente publication d'une déclaration scientifique de l'American Heart Association sur «l'évaluation cardiaque du métabolisme», souligne l'intérêt croissant de la communauté scientifique pour tson domaine de recherche 8. Mais alors que les avancées technologiques en imagerie cardiaque permettent maintenant d'une évaluation rapide et précise de la morphologie et de la fonction cardiaque, l'étude in vivo du métabolisme cardiaque reste limitée et lourde: résonance magnétique (RMN) et nucléaire tomographie par émission de positons (TEP) peut être utilisés pour suivre le métabolisme du phosphate de haute énergie cardiaque et l' activité du cycle de Krebs, mais ces techniques sont en proie à des coûts d'exploitation élevés et par leur incapacité à déterminer la contribution des différents substrats au métabolisme oxydatif dans des conditions stables 9 .Pour cette date , l'ex vivo travail de préparation cardiaque représente la technique seule et unique disponible pour étudier, simultanément et en temps réel, la fonction contractile et flux de substrats dans des voies métaboliques oxydatives 7,9. Le protocole suivant a pour but de fournir des lignes directrices pour la préparation et l'utilisation des réactifs utilisés pour déterminer le rates de substrats utilisation dans le coeur de rat de travail isolé.

Le Coeur Appareil Rongeur de travail isolé

Bien que la technique est vieille presque un demi-siècle, le travail isolé préparation de coeur de rat reste une méthode de choix pour la recherche cardiovasculaire. Comme pour la préparation cardiaque Langendorff, le cœur de rongeur de travail offre un moyen relativement simple, fiable et peu coûteux pour mesurer une large gamme de paramètres cardiaques, indépendamment des effets de confusion d'autres organes, neurohormonales et d'autres facteurs qui circulent. Mais contrairement au coeur Langendorff perfusé, le cœur de travail continue d'effectuer le travail cardiaque quasi-physiologique, une condition préalable à la génération de flux métabolique oxydative à des niveaux qui sont pertinents pour les conditions in vivo. Ceci est réalisé en fournissant le tampon de perfusion dans le ventricule gauche (VG) par l'intermédiaire d'une canule reliée à l'oreillette gauche, et que le LV se remplit et se contracte, letampon est éjecté à travers la ligne aortique contre une pression hydrostatique de postcharge déterminée. La conception de l'appareil de perfusion décrit initialement par Neely et ses collègues 10 a ensuite été améliorée par Taegtmeyer, Hems et Krebs 11, mais a très peu changé depuis. Comme décrit dans l'appareil d' origine, la fonction contractile peut être évaluée grâce à la détermination du débit cardiaque, sans utiliser des cylindres de plus de diplômés et un chronomètre pour mesurer aortique et coronaire flux 10,11. Plusieurs fournisseurs offrent maintenant des systèmes complets coeur de perfusion de rongeurs de travail. Ces appareils disponibles dans le commerce peut être acquise avec flowprobes, transducteurs de pression, un cathéter pression-volume et tout l'équipement nécessaire à l'acquisition de données fonctionnelle cardiaque et d'analyse. Les vendeurs offrent de nombreuses sessions de documentation et de formation pour familiariser le nouvel utilisateur avec leur équipement. Plusieurs articles de revue également les protocoles de détail sur le instrum travail cardiaqueentation et sur l'utilisation de cathéters pour mesurer la fonction cardiaque chez les rongeurs 12-15. Pour cette raison, nous allons brièvement parler de la mise en place de l'appareil de perfusion et de l'équipement d'enregistrement. Le présent protocole vise plutôt à compléter les informations déjà disponibles avec une description des méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour mesurer simultanément les taux de glucose et de l'oxydation des acides gras à longue chaîne, les deux substrats énergétiques fournissant majeurs dans le cœur normal. Nous décrivons ici toutes les étapes impliquées dans l'utilisation des substrats énergétiques radiomarqués pour l'évaluation du métabolisme oxydatif du myocarde, de la préparation des réactifs et des tampons à la récupération et le traitement des échantillons, à l'analyse des données.

Principes de la méthode

Cardiomyocytes génèrent la plus grande partie de leur énergie pour la contraction de la phosphorylation oxydative d'acides gras (principalement des acides gras à longue chaîne) et des glucides (glucose et de lactate). Le cœur a très limité des réserves énergétiques et repose sur un approvisionnement constant de ces énergies fournissant des substrats de la circulation. Le catabolisme du glucose par la voie glycolytique donne pyruvate, qui est ensuite décarboxylé par le complexe pyruvate déshydrogénase de la membrane mitochondriale interne. Les acides gras à longue chaîne, extraits de l'albumine circulante ou des triglycérides de lipoprotéines sont d'abord activés dans des molécules d'acyl-CoA dans le cytosol et ensuite transporté à l'intérieur de la matrice mitochondriale par l'intermédiaire de la navette carnitine pour entrer dans la voie bêta-oxydation. Les molécules d'acétyl-CoA produites par le catabolisme du glucose et des acides gras alimentent le cycle de Krebs pour générer les équivalents réducteurs (NADH et FADH 2) qui sont utilisés par la chaîne de transport d'électrons pour créer la force proton motrice à travers la membrane mitochondriale interne et générer l'ATP par l'activité de l'ATP synthase. L'eau et le dioxyde de carbone sont les sous-produits d'extrémité deles réactions enzymatiques qui se déroulent à l'intérieur du cycle de Krebs. La fourniture de 14 C et 3 H- substrats radiomarqués (tels que le glucose 14 C-radiomarquée et l' acide oléique radiomarqué 3 H) au travail cardiaque isolé sera par conséquent conduire à la production de 14 CO 2 et de H 2 O 3 qui peut être quantitativement récupéré de l'effluent coronaire. La collecte de 14 CO 2 est réalisée en maintenant le cœur isolé perfusé dans une chambre étanche et en récupérant immédiatement l'effluent coronaire à sa sortie du coeur. Une petite colonne d'échange d'anions est utilisée pour séparer et récupérer 3 H 2 O dans l'effluent coronaire. La radioactivité des échantillons traités est mesurée avec un compteur à scintillation liquide, et avec la connaissance de l'activité spécifique des substrats radiomarqués utilisés, il est alors possible de quantifier individuellement le flux de glucose et d'acide gras dans laoxydation pathways 16,17.

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Protocole

NOTE: Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément à la politique du Service de santé publique sur le NIH Human Care et l'utilisation des animaux et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université du Mississippi Medical Center. Toutes les procédures impliquant l'utilisation de radioisotopes ont été approuvés et réalisés selon les lignes directrices établies par le bureau de l'Université du Mississippi Medical Center de sûreté radiologique.

1. Préparation du stock tampon Solutions et réactifs

  1. Krebs-Henseleit (KH) du stock régulateur Solutions
    1. Préparer 2 L d'une solution saline concentrée 20x mère contenant (en mol / L) 2,37 NaCl, 0,0948 KCl, 0,0236 KH 2 PO 4, et 0,0236 MgSO 4 * 7H 2 O. Filtrer sur une unité et un magasin de filtration de la taille des pores de 0,45 um à température ambiante pendant 1 mois.
    2. Préparer 2 litres d'une solution concentrée 20X (0,5 mol / L) de NaHCO 3. La solution peut êtrestocké à température ambiante pendant une période de temps indéfinie.
    3. Préparer 250 ml d'une / L solution stock 1 mol de CaCl 2. Filtrer sur une unité et un magasin de filtration de la taille des pores de 0,45 um à température ambiante pendant 1 mois.
  2. Conversion des Anion Résine Exchange à partir du formulaire Chloride au formulaire Hydroxide
    1. Laver la résine échangeuse d'anions en le remettant en suspension dans 1 L d'eau ultrapure. Laisser la résine pour régler et verser l'excès d'eau. Répétez cette étape 4 fois plus.
    2. Verser la résine dans un porte-filtre sous vide de microanalyse de verre monté sur un flacon de filtration.
    3. Convertir la résine à la forme hydroxyde en faisant passer lentement à travers 22 volumes de 1 N NaOH. Mélanger la suspension de façon intermittente avec une spatule en acier inoxydable.
    4. Laver la résine avec de l'eau ultrapure jusqu'à ce que le pH tombe en dessous de 9,0. Vérifier le pH régulièrement par immersion d'une bande d'essai de pH près de la surface de la suspension de résine. Couvrir et conserver la résine avec de l'eau ultrapure dans un bobouteille en verre rosilicate et protéger de la lumière. Ne pas laisser la résine sécher avant de l'utiliser.
      NOTE: En cas de stockage correctement, la résine va durer au moins 3 mois.
  3. Acid-albumine Solution 8x concentré Stock oléique
    1. Dans un ballon à 4 L Erlenmeyer, mélanger 200 ml de la solution mère 20x concentrée de sel et 200 ml de concentré NaHCO3 solution 20x avec 3,6 L d' eau ultrapure.
    2. En utilisant un tube de dispersion de gaz comprenant un cylindre fritte, le gaz de la solution pendant 15 min avec un mélange de dioxyde de carbone à 5% et 95% d'oxygène pour stabiliser le pH.
    3. Verser 470 ml de tampon dans un bécher de 1 L de verre. Ajouter 8,75 ml de la / L CaCl2 solution stock 1 mol au tampon 3530 ml restant dans le ballon 4 L Erlenmeyer et mettre de côté.
    4. Ajouter 40 g de sans acide gras BSA à 1 L bêcher en verre et remuer avec une barre d'agitation jusqu'à dissolution.
    5. Dans un tube conique de 15 ml, la préparation de 4 ml de 50% (v: v) une solution d'éthanol dans de l'eau ultrapure. Ajouter 487 mg sodium oléate et vortex jusqu'à ce que la poudre est entièrement dissous.
      REMARQUE: Certains chercheurs utilisent de l'acide palmitique à la place de l'acide oléique dans le tampon de perfusion. Une solution stock d'acide palmitique-albumine peut être préparé en suivant la même procédure. Toutefois, il est recommandé de chauffer la solution à 70 ° C pour obtenir la solubilisation complète du palmitate de sodium.
    6. Ajouter goutte à goutte une solution d'oléate à la solution de BSA dépourvue d'acides gras sous agitation constante et attendre 10 minutes supplémentaires pour le complexe acide oléique-BSA à se former.
      REMARQUE: La solution doit avoir une couleur jaune clair et être dépourvue de particules visibles. La présence d'un précipité ou les particules insolubles peut indiquer la conjugaison incomplète de l'acide gras à la BSA. Si cela se produit, la solution doit être jeté et le processus a commencé encore.
      NOTE: palmitate précipitera si elle est autorisée à siéger dans une pipette et ne peut être ajouté goutte à goutte. La solution agitée de BSA peut être chauffé à 37 ° C pour faciliter binding d'acide palmitique. Ne pas surchauffer car cela peut provoquer la dénaturation et l'agrégation des BSA.
      ATTENTION: Les prochaines étapes de ce protocole implique la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les consignes d'élimination de la sécurité et des déchets fixés par le bureau de sécurité de rayonnement de l'institution.
    7. Ajouter 160 pi (0,8 mCi) [9,10 3 H] d'acide oléique à la solution d'agitation de l' acide oléique-BSA et agiter pendant encore 10 min.
    8. Ajouter 2,5 ml de la / L CaCl2 solution stock 1 mol à la solution d'agitation de l' acide oléique-BSA.
    9. Couper environ 1,2 m de tuyau de membrane de dialyse et rincer à l'intérieur et à l'extérieur avec de l'eau du robinet. Frotter le tube de dialyse vigoureusement sous l'eau du robinet pendant 10 à 15 min pour éliminer le revêtement de glycérol de la membrane. Vous pouvez également retirer le revêtement par trempage du tube de dialyse dans l'eau chaude pendant 1 heure avant utilisation. Finition par rinçage du tube de dialyse avec ultrapure water.
    10. Solidement attacher une extrémité du tube de dialyse. Remplir avec la solution acide oléique-BSA et attacher l'autre extrémité du tube de dialyse.
    11. Placer le tube de dialyse rempli dans le ballon 4 L Erlenmeyer de tampon KH et permettre à dialyser une nuit à 4 ° C sous agitation douce avec un barreau d'agitation.
    12. Le lendemain, retirer la solution concentrée d'acide-BSA 8x oléique du tube de dialyse. Utiliser la solution acide oléique-BSA immédiatement pour perfusion ou aliquote et conserver à -20 ºC. aliquotes congelés sont stables pendant au moins 2 mois. Évitez de multiples cycles de gel-dégel, car cela pourrait compromettre la solubilité du complexe acide oléique BSA.
      REMARQUE: Utilisez uniquement l'eau ultrapure (résistivité de 18,2 MΩ.cm à 25 ° C, le carbone organique total <10 ppb, micro-organismes ≤ 1 UFC / ml, les particules dont la taille est plus de 0,22 um ≤1 / ml) pour préparer les réactifs et tampons utilisé pour le coeur perfusion. La conversion de la résine échangeuse d'anions à partir de son chlorure pourm de la forme hydroxyde peut être évité par l' achat direct de la forme d'hydroxyde à une dépense supplémentaire (voir tableau des matériaux). En plus de l'oléate ou le palmitate, tout autre type d'origine naturelle d'acides gras peuvent également être utilisés, tant que la version tritiée de l'acide gras est disponible pour suivre son oxydation.

2. Préparation du tampon Perfusion

  1. Dans un ballon à 4 L Erlenmeyer, mélanger 200 ml de la solution mère 20x concentrée de sel et 200 ml de concentré NaHCO3 solution 20x avec 3,6 L d' eau ultrapure. Gaz la solution pendant 15 min avec un mélange de dioxyde de carbone de 5% et de l' oxygène à 95%, puis ajouter 10 ml de la / L CaCl2 solution stock 1 mol pour régler la concentration de Ca libre 2+ à 2,5 mmol / L.
    ATTENTION: Les étapes suivantes impliquent la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les règles de sécurité et d'élimination des déchets fixés par le ra de l'institutionbureau de la sécurité de diation.
  2. Transfert 1.750 tampon L KH à un 2 L bouteille en verre borosilicate. Ajouter 250 ml de la solution concentrée 8x acide oléique-BSA, 1,802 g de D-glucose, 400 ul de l' insuline à 0,4 U / ml et 200 pi (0,2 mCi) [U- 14 C] glucose. Inversez la bouteille pour mélanger. Cela donnera à 2 L de tampon de perfusion complet contenant de l'acide oléique (0,4 mmol / L), D-glucose (5 mmol / L) et de l'insuline (40 uU / ml).
    REMARQUE: Un volume de 2 litres est suffisante pour perfuser un coeur de rat adulte travaillant dans des conditions de non-recirculation pendant au moins 60 min.
  3. Utiliser une partie de la mémoire tampon KH non radioactif pour remplir deux plats de dissection et de mettre sur la glace pour refroidir.

3. Préparation de l'appareil de perfusion

NOTE: L'enquêteur peut choisir d'utiliser un appareil de perfusion sur mesure telle que celle décrite par Taegtmeyer, Hems et Krebs 11, ou l' un des systèmes disponibles dans le commerce. Les systèmes de perfusion sont typiquement composés de lales éléments décrits à la figure 1 ci - dessous. Outre le tube et la verrerie, le reste de l'équipement d'enregistrement est facultative et son utilisation dépendra des besoins de l'enquêteur d'aborder la question expérimentale posée. Néanmoins, nous recommandons l'utilisation de microélectrodes d'oxygène pour déterminer la concentration en O 2 dans l'entrée de la mémoire tampon et la sortie de la circulation coronaire (figure 1). Cela aidera le contrôle de l'enquêteur que le cœur est fourni avec une quantité appropriée d'oxygène, et que l'apport d'oxygène ne varie pas entre les expériences. En outre, la détermination de la différence d'oxygène "artérioveineuse" peut être utilisé pour calculer la consommation d'oxygène du myocarde et efficacité cardiaque 16,18.

  1. Allumez le bain d'eau circulant et réglé à 37 ° C pour réchauffer l'appareil de perfusion.
  2. Allumez l'ordinateur et le système d'acquisition de données qui seraêtre utilisé pour mesurer la fonction cardiaque.
  3. Connecter les appareils d'enregistrement (de cathéter de pression, pression-volume cathéter, microélectrodes d'oxygène, débitmètres, etc.) au système d'acquisition de données et d' effectuer l' étalonnage des instruments en suivant les instructions du fabricant.
  4. Remplir le réservoir tampon avec de l'eau ultrapure. Allumez la pompe péristaltique et rincer l'eau à travers tous les tubes et verrerie pour rincer le système. Éteignez la pompe péristaltique et assurez-vous qu'aucune eau reste dans le tube et / ou la verrerie, car cela peut affecter la concentration du tampon de perfusion et la préparation cardiaque.
  5. Connecter un nouveau filtre en fibre de verre de 1,0 um au système. Raccorder le réservoir de gaz contenant un mélange de dioxyde de carbone à 5% et 95% d'oxygène à la chambre d'oxygénation.
    ATTENTION: Les étapes suivantes impliquent la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les règles de sécurité et d'élimination des déchets fixés par l'institutionradioprotection du bureau ».
  6. Remplir le réservoir tampon avec un tampon de perfusion. Allumez la pompe et assurer le remplissage de tous les tuyaux et verrerie avec le tampon de perfusion. Exécuter le tampon de perfusion à travers l'appareil de perfusion dans le mode de remise en circulation et oxygéner pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
  7. Étroitement fixer le tube d'une seringue de 20 ml sous la chambre cardiaque pour récupérer l'effluent coronaire. Branchez la pointe de la seringue vers le haut d'un robinet à trois voies. Connectez le bras latéral à une seringue de 3 ml. Connectez le bras inférieur via un tube à un conteneur pour déchets radioactifs liquides.
    NOTE: Lors de l'utilisation du complexe d'acide gras-BSA, oxygénation du tampon de perfusion ne peut pas être réalisée par barbotage direct avec un tube de dispersion de gaz car cela provoquerait un moussage excessif de la solution. Utiliser un oxygénateur à membrane (figure 1) ou d' une chambre d'oxygénation du flux de feuilles à cet effet. Il est fortement recommandé de vérifier qu'un niveau approprié of oxygénation est atteinte en plaçant un micro - électrode à oxygène dans le circuit de perfusion (Figure 1).

4. Rat Isolation cardiaque et Cannulation

  1. Peser rat sur une échelle.
  2. Préparer une seringue avec une dose anesthésique de 150 mg / kg thiobutabarbital hydrate de sel de sodium et une seringue à tuberculine avec 200 unités USP d'héparine.
  3. Injecter thiobutabarbital IP et attendre que l'animal à perdre conscience. D' autres agents d'induction peuvent être utilisés aussi longtemps que cela ne va pas interférer avec l'objectif de l'expérience (voir le choix de l'anesthésique dans la section ci - après).
  4. Vérifier le niveau approprié de l'anesthésie en confirmant l'absence de pincement de l'orteil réflexe. Assurez-vous de maintenir une bonne profondeur de l'anesthésie pour assurer que l'animal ne ressent pas la douleur pendant la procédure.
  5. Une fois que le rat est totalement inconscient et ne répond pas aux pincement de l'orteil, placez-le sur le dos sur la table d'opération et secmembres ure avec du ruban adhésif ou des broches.
  6. Clip de la libre abdomen des cheveux et effectuer une incision médiane de l'abdomen. Ne pas ouvrir la cavité thoracique à ce stade encore. Déplacer l'estomac et de l'intestin côté pour révéler la veine cave inférieure. Injecter l'héparine directement dans la veine cave inférieure et attendre 5 à 10 secondes avant de poursuivre.
  7. À l'aide de ciseaux couper le diaphragme et les parois de la cage thoracique afin d'exposer le contenu de la cavité thoracique.
  8. Délicatement saisir le coeur entre le pouce, l'index et le majeur et l'accise le cœur et les poumons ensemble. Couper au niveau de l'aorte descendante, en faisant attention à ne pas endommager la crosse aortique et l'aorte ascendante dans le processus. transférer immédiatement le cœur et les poumons à l'un des plats de dissection remplis avec le tampon KH glacé.
  9. Après le cœur cesse de battre, transférer dans le deuxième plat de dissection et couper les gros morceaux de tissu pulmonaire attachés tout en gardant le cœur immergé dans un tampon KH glacé. Couper la descenteing aorte juste au-dessus de l'arc aortique.
    ATTENTION: Les étapes suivantes impliquent la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les consignes d'élimination de la sécurité et des déchets fixés par le bureau de sécurité de rayonnement de l'institution.
  10. Rincer la ligne aortique de l'appareil de perfusion pour remplir la canule aortique avec un tampon chaud et pour éliminer toute l'eau ou l'air qui peuvent encore être présents dans le tube. Laisser le tampon de perfusion au goutte à goutte de la canule aortique pour réduire au minimum le risque d'embolie gazeuse au moment où le coeur est attaché à la canule.
  11. L'utilisation de deux micro pince de dissection ouvrir soigneusement l'aorte et faites glisser le coeur vers le haut sur la canule aortique. Fixer l'aorte sur la canule avec un micro pince et initier Langendorff perfusion du cœur. Observer le cœur commence à battre et expulser tout le sang restant dans la vasculature coronaire dans les secondes qui suivent le début de la perfusion.
    NOTE: Il est très important d'effectuer les étapes 4.6 à 4,10 aussi vite que possible pour éviter les lésions ischémiques irréversibles au cœur. Avec l'expérience, toute la procédure devrait prendre entre 1 et 2 min. Lorsque vous faites glisser l'aorte sur la canule, veillez à ne pas passer la racine aortique, car cela pourrait entraîner une hypoperfusion myocardique et des dommages à la valve aortique.
  12. Attachez l'aorte à la canule aortique avec une suture de soie 3-0 et enlever le micro clip. Repérez la veine pulmonaire. Il peut être nécessaire de couper les tissus non-cardiaques pour le trouver, mais ne pas couper trop de tissus non-cardiaques, car ils servent à attacher l'oreillette gauche à la canule.
  13. Rincer la ligne auriculaire gauche de l'appareil de perfusion pour remplir la canule auriculaire avec un tampon chaud et pour éliminer toute l'eau ou l'air qui peuvent encore être présents dans le tube. Soyez particulièrement prudent pour éliminer toute bulle d'air de l'appareil pour minimiser le risque d'embolies d'air au moment où le cœur est attaché à la canule.
  14. L'utilisation de deux micro-dissection forceps saisir délicatement l'ouverture de la veine pulmonaire et faites glisser le coeur vers le haut sur la canule auriculaire. Il peut être nécessaire de repositionner le coeur en faisant tourner doucement la canule auriculaire et / ou de l'aorte pour réaliser cette étape. Dans tous les cas, veiller à ce que la procédure n'impose pas une contrainte excessive sur le cœur et provoque la flexion de l'aorte. Attachez l'oreillette gauche à la canule auriculaire avec une suture 3-0 en soie.
  15. Ouvrez la ligne auriculaire et passer simultanément la ligne aortique du mode Langendorff au mode de travail. En cas de fuite de mémoire tampon sur de l'oreillette gauche, fermer la ligne auriculaire, basculer en arrière de la ligne de l'aorte à perfusion de Langendorff, et utiliser une autre suture 3-0 en soie pour attacher l'oreillette gauche de manière plus sécurisée à la canule.

5. Mesure de la fonction cardiaque et de prélèvement d'échantillons

REMARQUE: La détermination des flux métaboliques nécessite la connaissance du débit coronaire (CF). Comme cela est décrit ci-dessous, les valeurs de débit coronarien peuvent êtreobtenu par la simple utilisation d'un chronomètre. En outre, la mesure du flux aortique (AF) avec la même méthode permet la détermination du débit cardiaque (CO = CF + AF), qui peut ensuite être utilisé pour calculer la puissance cardiaque (CP) comme une mesure générale de la fonction cardiaque en appliquant la formule CP = CO (m 3 / s) * Postcharge (Pa). Une autre méthode disponible pour l'évaluation de la fonction cardiaque repose sur la mesure en temps réel de la pression d'impulsion d'un transducteur de pression (figures 3 et 4). Bien que facultative, les mesures les plus précises et détaillées de la fonction et de l'hémodynamique contractile cardiaque, y compris la détermination de la gauche systolique ventriculaire et les fonctions diastolique, seront atteints avec l'utilisation d'une pression-volume (PV) conductance cathéter. Cette section décrit brièvement le cathétérisme du cœur isolé. Des informations supplémentaires concernant l'étalonnage des cathéters PV et l'analyse des données avec un logiciel statistique peut êtretrouvé dans les références 14,15.
ATTENTION: Les étapes suivantes impliquent la manipulation de matières radioactives. Porter des EPI appropriés et suivre les consignes d'élimination de la sécurité et des déchets fixés par le bureau de sécurité de rayonnement de l'institution.

  1. Si l'expérience comprend la mesure directe de la fonction VG avec un cathéter, percer le sommet LV avec une aiguille 26 G et d'introduire le cathéter par l'intermédiaire de la ponction.
  2. Lors de l'utilisation d'un cathéter de pression-volume, positionner soigneusement le cathéter de telle sorte que son axe soit aligné avec l'axe longitudinal LV, l'électrode distale juste en dessous de la valve aortique et adjacente à la frontière endocardique et l'électrode proximale juste à l'intérieur de la paroi ventriculaire.
  3. Sceller le coeur dans la chambre cardiaque chemisé d'eau et de surveiller les paramètres fonctionnels cardiaques avec le logiciel d'acquisition de données. Commencer l'enregistrement après les paramètres cardiaques de base ont été stables pendant plus de 5 min.
  4. Déterminer le débit coronaire par meaSuring le temps nécessaire pour remplir le tube de seringue de 20 ml fixé sous la chambre de coeur. Après la mesure, ouvrir le robinet à trois voies pour vider l'effluent coronaire dans le conteneur de déchets liquides radioactifs.
    NOTE: Les mesures de débit peuvent également être effectuées à l'aide d'un débitmètre et flowprobes.
  5. Utiliser la seringue de 3 ml fixée au bras latéral du robinet à trois voies pour récupérer ~ 2 ml d'effluent lorsqu'il sort coronaire du coeur. Transférer 0,5 ml de l'effluent coronaire dans un tube 2 ml capless microcentrifugeuse et procéder immédiatement à la détermination des taux d'oxydation du glucose (section 6 ci-dessous).
  6. Transférer le reste de l'échantillon d'effluent coronaire (~ 1,5 ml) dans un tube à centrifuger étiquetés de façon appropriée et de les stocker sur la glace.
  7. Répétez les étapes 5/4 à 5/6 à intervalles réguliers (par exemple tous les 5 ou 10 minutes) jusqu'à la fin de l'expérience de perfusion.
  8. Si l'on utilise un cathéter de pression-volume, injecter un bolus de 10 pl d'une solution saline hypertonique (15%)dans la ligne auriculaire et juste avant la canule auriculaire avant de conclure l'expérience. Utiliser cette injection d' un bol pour calculer la conductance parallèle (V p), ce qui est critique pour la détermination précise du volume cardiaque 15.
  9. Décachetez la chambre cardiaque et retirer le cathéter du LV si l'on a utilisé dans l'expérience. Récupérer le coeur en utilisant l'une des options suivantes:
    1. S'il n'y a pas besoin d'isoler des zones spécifiques du cœur pour les analyses en aval et si l'appareil de perfusion permet, des lignes à la fois auriculaire et de l'aorte à proximité et immédiatement geler-pince le cœur sur ses canules à l'aide de pinces Wollenberger pré-refroidi dans de l'azote liquide.
    2. Vous pouvez également couper le cœur au large des canules et déposez-le dans le tampon KH glacé. sécher rapidement le coeur sur une serviette en papier et de mesurer son poids humide. Le cœur peut alors être disséqué et des échantillons de tissus collectés pour des mesures spécifiques. Congeler le tissu restant en utilisant Wollenberger tongs préalablement refroidi dans de l'azote liquide.
  10. Stocker le tissu cardiaque congelé à -80 ° C jusqu'à la détermination du poids sec (Voir la section 8. Calculs).

6. Détermination du glucose myocardique Oxydation Tarifs

Remarque: Le procédé consiste en la récupération quantitative de 14 CO 2 dans l'effluent coronaire avec une solution de piégeage d'hydroxyde de hyamine. Le 14 CO 2 dissous en H 14 CO3- est récupéré suivant l' acidification du tampon avec de l' acide perchlorique. Les échantillons doivent être traitées immédiatement après leur récupération que la diffusion passive de gaz entre l' air et l' échantillon se traduira par une perte de 14 CO 2 au fil du temps. Les flacons de scintillation doivent être hermétiquement scellés par les bouchons de douille en caoutchouc pour empêcher la perte de 14 CO 2 après l' ajout d' acide perchlorique. Si nécessaire, parafilm peut être utilisé pour fixer les bouchons de manchon en caoutchouc à laflacons (figure 2).

  1. Ajouter 1 ml de 10x concentrée d'hydroxyde de hyamine à des flacons à scintillation en verre (une fiole pour chaque échantillon + deux flacons supplémentaires pour la détermination de l'activité de fond).
    ATTENTION: Hydroxyde de hyamine est hautement toxique et provoque de graves brûlures. Consulter la fiche signalétique de ce produit pour la manipulation et le stockage approprié.
  2. Utiliser des pinces délicatement transférer le tube capless microcentrifugeuse de 2 ml contenant l'échantillon d'effluent de 0,5 ml coronaire à un flacon pré-rempli avec l'hydroxyde de hyamine. En utilisant 0,5 ml de tampon de perfusion pour la détermination de l'activité de fond.
  3. Boucher le flacon avec un bouchon à manchon en caoutchouc. Parafilm peut être utilisé pour assurer l'étanchéité du flacon. En utilisant une seringue de 1 ml et une longue aiguille 23 G, injecter 200 pi d'acide perchlorique (60% w: w%) à travers le bouchon de manchon en caoutchouc et directement dans le tube 2 ml de capless.
    NOTE: L'effluent coronaire devrait devenir blanc en raison de la précipitation de BSA.
  4. Que les flacons spendant la nuit.
    ATTENTION: L' acide perchlorique est très corrosif, peut agir comme un comburant et / ou causer un risque d'explosion. Consulter la fiche signalétique de ce produit pour la manipulation et le stockage approprié.
  5. Le lendemain, retirez les bouchons de manchon en caoutchouc. récupérer soigneusement chaque tube capless 2 ml avec des pincettes et laver le fond du tube sur le dessus du flacon ouvert avec 1 ml de cocktail de scintillation pour récupérer tous de l'hydroxyde de hyamine. Jeter le tube capless dans un conteneur de déchets radioactifs étiquetés de manière appropriée.
  6. Ajouter un 9 ml de cocktail de scintillation supplémentaire par flacon. Ajouter 0,5 ml de tampon de perfusion directement à deux flacons remplis avec 10 ml d'un cocktail de scintillation liquide pour la détermination de l'activité spécifique. Agiter les flacons vigoureusement à la main et attendre au moins 6 heures pour permettre aux bulles d'air de se dissiper avant de mesurer dans un compteur à scintillation liquide fixé de manière appropriée pour des expériences sur l'étiquette double.
    REMARQUE: Utilisez des flacons en verre transparent pour visualiser le necedle lorsque percer les bouchons de manchon en caoutchouc. Ne pas laisser tomber l'acide perchlorique dans l'hydroxyde de hyamine car cela va ruiner la réaction. L' ajout des acides perchlorique libère le 14 CO 2 de l'effluent coronaire dans l'air. Bien que les flacons doivent être hermétiquement fermés et tout le 14 CO 2 doivent être pris au piège dans le hyamine d'hydroxyde, il est recommandé d'effectuer cet essai sous la hotte chimique.

7. Détermination de Myocardial oléate Oxydation Tarifs

Remarque: La méthode est basée sur la séparation et la récupération quantitative de 3 H 2 O dans l'effluent coronaire en utilisant une résine échangeuse d'anions forte. Contrairement à la récupération de 14 CO 2, il n'y a pas de problème de stabilité de l' échantillon et l'effluent coronaire peut être conservé sur la glace ou stocké dans le congélateur avant d' effectuer le test.

  1. Préparer des colonnes de résine échangeuse d'anions (par exemple une colonne + two colonnes supplémentaires pour la détermination de l'activité de fond) en remplissant la pointe des tubes de seringue 3 ml avec de la laine de verre. Ajouter la suspension de résine / eau avec une pipette de transfert jusqu'à ce que la résine atteigne la marque de 2 ml sur le tube de seringue.
  2. Laver la résine en faisant passer 2 ml d'eau ultrapure à travers la colonne. Répétez cette étape deux fois plus.
  3. Placez des flacons de scintillation ouverts sous les colonnes et charger 0,5 ml d'effluent coronaire par colonne. Charger 0,5 ml de tampon de perfusion pour la détermination de l'activité de fond.
  4. Laver les colonnes successivement avec 0,5, 1 et 2 ml d'eau ultrapure. Une fois l'élution se fait, jeter les colonnes dans un conteneur de déchets radioactifs étiquetés de manière appropriée.
  5. Ajouter cocktail de scintillation 13 ml de liquide par flacon à scintillation. Ajouter 0,5 ml de tampon de perfusion directement à deux flacons remplis avec 13 ml d'un cocktail de scintillation liquide pour la détermination de l'activité spécifique. Agiter les flacons vigoureusement et attendre au moins 6 heures avant de mesurer dans un sci liquidentillation contre convenablement mis en place pour des expériences sur l'étiquette double.

8. calculs

  1. Si pas déjà fait, de déterminer le poids humide de l'ensemble perfusé cœur.
    NOTE: Ne laissez pas le tissu congelé à décongeler si les analyses moléculaires et biochimiques doivent être effectuées ultérieurement sur le tissu restant.
  2. Déterminer le poids humide d'un échantillon de tissu de l'ensemble perfuse-coeur (utiliser environ 15 à 30% de l'ensemble du coeur). Placer l'échantillon de tissu dans un four réglé à 50 ° C pendant la nuit et de mesurer son poids sec. Utilisez le poids humide / poids sec de l'échantillon de tissu pour déterminer le poids sec de tout le cœur en grammes (g de poids sec.).
  3. Pour chaque point x de temps exprimer la valeur de coronariennes CF d'écoulement x en ml / min.
  4. Détermination de la vitesse d'oxydation du glucose
    1. Moyenne , les deux désintégration / min (dpm) les valeurs mesurées pour l'activité de fond de 14 C à détermiNE le facteur de correction 14C dpm ba.
    2. Déterminer le 14 C la valeur de l' activité spécifique 14C dpm sa moyenne.
    3. Déterminer la radioactivité spécifique du glucose dans dpm / pmol (F Glu) en appliquant la formule
      figure-protocol-1
      REMARQUE: où n Glu (pmol) = C - Glu (pmol / L) * volume de l' échantillon (L) = 2,5 lors de l' utilisation du glucose à 5 mmol / L et un échantillon de 0,5 ml.
    4. Déterminer pour chaque point x le taux de production de 14 CO 2 en dpm / min (A) de temps en appliquant la formule
      figure-protocol-2
      NOTE: Lorsque Vol x (ml) = 0,5
    5. Diviser A par la valeur déterminée du poids du cœur sec pour obtenir le taux normalisé de production de 14 CO 2 (A Norm ) en dpm / min par g de poids sec.
    6. Appliquer la formule GO = A Norm / F Glu pour obtenir le taux d'oxydation du glucose (GO) en pmol de glucose / min par g de poids sec.
  5. Détermination du taux d'oxydation oléate
    1. Calculer la moyenne des dpm / min (deux) , les valeurs mesurées de désintégration pour l'activité de fond de 3 H pour déterminer le facteur de correction 3H dpm ba.
    2. Déterminer la 3 H valeur de l' activité spécifique 3H dpm sa moyenne.
    3. Déterminer la radioactivité spécifique de l' oléate en dpm / pmol (F Ol e) en appliquant la formule
      figure-protocol-3
      NOTE: Lorsque n Ole (pmol) = C Ole (pmol / L) * volume d'échantillon (L) = 0,2 en utilisant oléate à 0,4 mmol / L et un échantillon de 0,5 ml.
    4. Déterminer pour chaque time point x le taux de production de 3 H 2 O en dpm / min (B) en appliquant la formule
      figure-protocol-4
      NOTE: Lorsque Vol x (ml) = 0,5
    5. Diviser B par la valeur déterminée du poids du cœur sec pour obtenir le taux normalisé de production de 3 H 2 O (B Norm) en dpm / min par g de poids sec.
    6. Appliquer la formule OO = B Norm / F Ole pour obtenir le taux d'oxydation de l' oléate (OO) en pmol d'oléate / min par g de poids sec.

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Résultats

Deux expériences représentatives sont décrites dans les figures ci-dessous. Dans les deux cas, le coeur d'un homme âgé de 16 semaines chez le rat Sprague Dawley a été isolé et perfusé dans le mode de fonctionnement avec un tampon KH préparé selon le protocole précédent. Dans chaque expérience, le cœur a été soumis à une condition de stress pour affecter le travail cardiaque. la fonction contractile cardiaque a été évaluée par enregistrement continu de la pression d'impulsion par ...

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Discussion

Le protocole précédent décrit en détail les méthodes pour quantifier simultanément le flux du substrat à travers l'oxydation du glucose et de l'oxydation des acides gras dans le coeur de rat isolé de travail. Les mesures peuvent ensuite être superposées aux paramètres fonctionnels cardiaques enregistrés pour déterminer la relation entre les substrats du métabolisme et du travail cardiaque sous base et le stress des conditions (changement dans la charge de travail, l' ischémie-reperfusion, etc ...). ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions R00 HL112952 (à R. H.), R01 HL108618 (à J.P.G.), P01 HL051971 et P20 GM104357. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de sodium (NaCl)Fisher ScientificBP358
Chlorure de potassium (KCl)Fisher ScientificBP366
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)Fisher ScientificP284
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4*7H2O)Fisher ScientificM63
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)Fisher ScientificS233
Chlorure de calcium (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
AG 1-X8 résine, forme chlorure, 100 - 200 mailles sèches, 500 gBio-Rad1401441Cet article peut être remplacé en achetant directement la forme d’hydoxide. (voir référence ci-dessous), mais cela coûtera presque 8 fois plus
résine AG 1-X8, forme hydroxyde, 100 - 200 mailles sèches, 100 gde Bio-Rad1432445L’achat de cet article permet de contourner la conversion de la résine échangeuse d’anions de la forme chlorure à la forme hydroxyde (Voir section 1.2 du protocole)
Porte-filtre sous vide de microanalyse en verreFisher Scientific09-753-2
Hydroxyde de sodium (NaOH)Fisher ScientificS318Corrosif. Consultez la fiche signalétique du produit pour la manipulation et le stockage appropriés.
Tube de dispersion de gaz avec cylindre frittéFisher Scientific11-138B
Probumin Sérum bovin Albumine Sans acides gras, poudreEMD Millipore820027Nous recommandons l’utilisation d’un BSA dégraissé au charbon de bois, car d’autres processus de purification tels que le fractionnement à froid de l’éthanol peuvent laisser des résidus toxiques pour le cœur.
Oléate de sodiumSigma-AldrichO7501
Acide oléique, [9,10-3H(N)]-PerkinElmerNET289005MCMatière radioactive. Suivez les lignes directrices du bureau de radioprotection de votre établissement pour les commandes et les manipulations.
Tube à membrane de dialyse, 29 mm de diamètre,Fisher Scientific08-667E
D-(+)-GlucoseSigma-Aldrich,G7021
Glucose, D-[14C(U)]-PerkinElmerNEC042B005MCMatière radioactive. Suivez les lignes directrices du bureau de radioprotection de votre établissement pour les commandes et les manipulations.
Humulin R U-100Eli Lilly and CompanyNDC 0002-8215-01 (HI-210)
Hydrate d’inactineSigma-AldrichT133Substance contrôlée inscrite à l’annexe III de l’USDEA
3-0 Silk Black BraidRoboz SurgicalSUT-15-3
10x Hyamine HydroxidePerkinElmer6003005Hautement toxique et provoque de graves brûlures. Consulter la fiche signalétique du produit pour une manipulation et un stockage appropriés
Flacons en verre à scintillation de 20 mlFisher Scientific03-341-25FUtiliser des flacons en verre pour la récupération quantitative des 14CO2
20 ml Flacons à scintillation en PEHDFisher Scientific03-337-23BUtiliser des flacons en PEHD pour la récupération quantitative des 3H2O
Rouge Bouchons à manchon en caoutchoucFisher Scientific14-126DDFit Flacons à scintillation de 20 ml ; Aiguille
réutilisable BD PrecisionGlide 23G x 40 mmBD305194Permet d’injecter de l’acide perchlorique à travers le bouchon du manchon en caoutchouc du piège CO2
Acide perchlorique, 60 %Fisher ScientificA228Hautement corrosif et peut agir comme un oxydant et/ou provoquer un risque d’explosion. Consulter la fiche signalétique du produit pour une manipulation et un stockage appropriés
Ultima Gold, Scintillation CocktailPerkinElmer6013327
Laine de verreFisher ScientificAC38606
Decon Dri-Clean Détergent en poudreFisher Scientific04-355Pour le nettoyage de la verrerie, des pièces en plastique et des tubes
Alconox Tergazyme Détergent à énergie enzymatiqueFisher Scientifique16-000-115Pour le nettoyage des surfaces « difficiles d’accès » (tubes, verrerie) contaminées par des résidus d’acides gras-BSA
de ,, ,

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