Le modèle Rongeur de non-artéritique neuropathie optique ischémique antérieure (de rNAION)

Résumé

Le rapport suivant décrit comment reproduire le modèle de rongeur de la neuropathie optique ischémique antérieure non artéritique (rNAION), en utilisant les paramètres appropriés de colorant, de lentille de contact et de laser. Nous révélons également les étapes appropriées pour évaluer la lésion de rNAION in vivo.

Résumé

La neuropathie optique ischémique antérieure non artéritique (NAION) est une lésion ischémique focale du nerf optique qui affecte 1/700 individus tout au long de leur vie. NAION entraîne un œdème du nerf optique, une perte sélective des neurones des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) et une atrophie du nerf optique. Un modèle de NAION chez le rongeur qui exprime la plupart des caractéristiques et des séquelles de NAION a été développé, qui s’applique à la fois aux rats et aux souris. Ce modèle utilise une application laser focale de longueur d’onde de 532 nm pour éclairer un colorant photoactif, Rose Bengal (RB), afin de provoquer des lésions capillaires et des fuites au niveau du nerf optique antérieur ciblé (la région laminaire). Après l’induction de rNAION, il y a une ischémie précoce du nerf optique, un œdème du nerf optique et une inflammation intraneurale, suivis d’une RGC sélective et d’une perte axonale. Étant donné que le nerf optique est un faisceau de substance blanche du SNC, le modèle rNAION est applicable aux études mécanistes de l’ischémie sélective de la substance blanche, ainsi qu’aux analyses neuroprotectrices et aux mécanismes à court et à long terme de la réponse gliale et neuronale à l’ischémie.

Introduction

Antérieure non - artéritique neuropathie optique ischémique (NOIAN) est une lésion ischémique focal de la partie antérieure du nerf optique (ON) ^1. NOIAN est la cause la plus fréquente de soudaine nerf optique perte de vision liée chez les personnes âgées de plus de 50 ^2. Le mécanisme est considéré comme un syndrome du compartiment qui se traduit par un œdème intraneurale, et provoque une compression des capillaires alimentant les axones dans le nerf optique ^3.

Depuis l'ON est en fait un système nerveux (CNS) tractus central, le NOIAN rongeur (rNAION) modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes et les réponses aux isolés du SNC substance blanche coups. Le modèle rNAION peut donc être utile à disséquer de nombreux problèmes associés à l'AVC dommages liés à la substance blanche. Il peut être utilisé pour évaluer les différentes stratégies et agents neuroprotecteurs en blanc coup de matière.

L'une des caractéristiques les plus attrayantes du modèle est qu'il est, Une procédure non invasive indolore. La puissance du laser peut être ajusté pour produire divers degrés d'altération ischémique. Une autre caractéristique est qu'il repose sur les radicaux superoxydes laser induit endommager l'endothélium capillaire, produisant un dysfonctionnement capillaire progressive. Il est ce dysfonctionnement et progressive oedème qui est censé être remarquablement similaire au mécanisme qui provoque NOIAN. La recherche a montré qu'il ne provoque pas la coagulation capillaire directe, mais fonctionne à travers au moins deux mécanismes: superoxyde mort induite et le décapage d'une partie du capillaire des cellules endothéliales ⁴ et NFkB (facteur nucléaire kappa-chaîne légère-activateur des cellules B activées ) associée à la régulation inflammatoire dans l' endothélium restante, avec une augmentation du transport du fluide à travers les membranes cellulaires dans l'interstitium ^5. La fermeture des capillaires du nerf optique et la compression causées par la suite de l'accumulation de liquide interstitiel dans la tête du nerf optique ischémie. Une image schématique est représenté dansLa figure 2. Le modèle rNAION peut être utilisé dans les deux espèces de rats et de souris ^6,7, et on peut faire varier le niveau de sa gravité, d'une lésion bénigne à une destruction complète, mais sans douleur du nerf optique et la rétine, par exemple comme l'occlusion de l'artère centrale de la rétine (CRAO).

Protocole

Ce protocole a été approuvé par l'Université du Maryland Comité d'utilisation des institutions de protection des animaux et (IACUC, Baltimore, MD, USA)

1. Experimental Set-up

1. Faire une coutume conçue lentilles de contact à partir d'une qualité optique claire circulaire de 7 mm de diamètre en plexiglas, d'une épaisseur de 3 mm. Couper les lentilles circulaires avec une perceuse à colonne. Utilisez un foret standard pour rendre la courbe intérieure, et enfin polir les courbes extérieures et intérieures à l'aide d'un polissoir de lentilles de contact des grains ultrafine (1000/3000).
2. Préparer 2,5 mM Rose Bengale (RB) de pH 7,4 tampon phosphate salin (PBS) à l'avance, le filtre stériliser avec un filtre à seringue de 0,45 micron et stocker 1 ml aliquotes à -20 ° C dans un récipient étanche à la lumière pour un maximum de 6 mois.
   NOTE: L'utilisation d'animaux mâles consanguines albinos, tels que Sprague Dawley minimise les différences de réponse dépendant des souche, permet une facilité accrue de l'induction et réduit la variabilité qui peut se produire avec oestrus cycling femelle.
3. Mettre en place la fréquence doublée néodyme-grenat d'yttrium aluminium (Fd-YAG) du laser médical ophtalmique, qui génère une lumière laser de 532 nm. Monter le laser sur une lampe à fente ophtalmique Haag-Streit en utilisant un adaptateur laser ophtalmique standard. Ce dispositif disponible dans le commerce permet la visualisation simultanée de l'application localisée des yeux et laser de l'animal. Le laser médical a également un faisceau de visée pour la focalisation et centration appropriée en utilisant même taille de la tache que l'induction laser. les paramètres de puissance de laser sont les suivants:
   1. Pour rat rNAION induction: utiliser 500 um tache de taille / 50 laser mW / 1000 msec / 1000 intervalle msec.
   2. Pour la souris rNAION induction: changer la taille de la tache à 300 um pour les plus petits disque optique et de laisser d'autres paramètres le même que le réglage du rat.
   3. utiliser systématiquement un dispositif de mesure de puissance laser pour assurer la puissance de sortie du laser.

2. Procédure expérimentale

1. Allumez la puissance du laseret mettre en place le paramètre laser approprié. Chauffer le laser pendant au moins cinq minutes avant utilisation.
2. Peser l'animal pour déterminer la dose appropriée pour la kétamine / xylazine et RB colorant. Anesthésier l'animal par injection intraperitoneale de 1 ml / kg de mélange de 80 mg / ml de kétamine et 4 mg / ml de xylazine.
3. Laissez l'animal dans une cage chauffée jusqu'à entièrement anesthésié. Vérifiez aucune réponse à des stimuli aversifs (queue ou d'un orteil pincement). Vérifier les animaux pour la profondeur de l'anesthésie toutes les 10 min.
4. Dilater les élèves de l'animal avec 1% tropicamide et anesthésier la surface de l'œil avec 0,5% proparacaine. Si l'utilisation d'animaux pigmentés, tels que Long Evans, 2,5% des gouttes oculaires néosynéphrine va augmenter la dilatation des pupilles.
5. Utilisez des ciseaux pour couper les moustaches à proximité de la bouche sur le côté pour être incités à ne pas bloquer la vue.
6. Mettre une goutte de 1% de méthylcellulose ou d'une autre goutte de couplage ophtalmique à l'intérieur de la lentille de contact sur mesure, et ensuite appliquer la lentille sur til oeil de rat.
7. Placer l'animal sur une plate-forme adaptée à la hauteur de la lampe à fente. Fixer la tête de l'animal à un angle de 45 °, de sorte que l'oeil est perpendiculaire à la lampe à fente et le faisceau laser.
8. Visualisez l'oeil à travers la lampe à fente ophtalmique. Assurez-vous que le faisceau de visée est la bonne taille ainsi que ciblée et centrée directement sur le nerf optique visualisé. Photographie du fond de la rétine à l'aide d'un appareil photo numérique à haute ASA (1200 - 2000) vitesse monté sur l'une des pièces de l'oeil de la lampe à fente avec un adaptateur personnalisé.
   REMARQUE: La capacité de voir les vaisseaux choroïdiens révèle la transparence de la rétine. Ceci est un signe important afin d'être en mesure de détecter l'ischémie rétinienne plus tard, ce qui peut confondre l'interprétation si elle se produit. rNAION est une ischémie du nerf optique, qui se traduit par une perte isolée RGC, alors que les résultats de l'ischémie rétinienne en dommages à la rétine qui affecte toutes les cellules des couches rétiniennes internes.
9. Eventuellement, autre image de la rétine etnerf optique à l' aide d' un domaine-optique spectrale cohérence tomographe (SD-OCT ⁸⁾ pour évaluer l'œil induit non. Numériser en face (figure 3B), ainsi que 7 scans en coupe à travers la rétine (figure 3C). Le SD-OCT imagerie utilise la même lentille de contact utilisée pour l'induction laser.
10. Injecter 1 ml / kg par voie intraveineuse RB par veine de la queue, et attendre pendant 30 secondes, puis d'activer la puissance du laser. Cette temporisation permet au BO de distribuer uniformément dans toute la circulation. Nous utilisons une impulsion laser de 50 mW à un sec / impulsion. énergies supérieures (≥ 60 mW) peuvent endommager la rétine ou de provoquer une ischémie vasculaire rétinienne.
    Attention: Assurez - vous que tout le monde a une paire de lunettes de filtrage de sécurité laser de la longueur d' onde de blocage approprié pour empêcher la lumière laser parasite entrant dans l'œil de l' enquêteur.
    REMARQUE: L'administration du laser doit être administré rapidement après l'injection IV RB étant donné que le colorant est rapidement éliminé de la circulation sanguine. Plus l'induction laser, le plus sévère du nerf optique ischémie. En général, les animaux sont donnés 7 - 12 impulsions par seconde dans une succession rapide. Le contact de la lumière laser avec le colorant circulant donne les vaisseaux du nerf optique une belle lueur d' or qui peut être vu à travers la lampe à fente (figure 4B). Cela prouve que le colorant a été injecté par voie systémique et distribué dans le flux sanguin. Si la lueur est faible, ou pas du tout (figure 4A), le colorant n'a pas été injecté par voie intraveineuse. Dans ce cas, ne pas donner une seconde injection immédiatement, puisque l'animal aura besoin de récupérer pendant au moins deux jours avant réinjection.
11. Immédiatement après l'induction, retirer la lentille de contact. Couvrir les deux yeux avec ophtalmique antibiotique triple (Neosporin / polymyxine / bacitracine) pommade avec la dexaméthasone, et placez l'animal sur un coussin chauffant à 37 ° C dans une seule cage logé sous observation jusqu'à ce que la récupération complète.
    1. Nettoyez la lentille de contact avec distillée water et essuyez avec un chiffon de nettoyage non abrasif pour une utilisation future.
    2. Deux jours après l'induction d' évaluer le nerf optique oedème à la fois par la photographie de fundus de couleur et SD-OCT analyse ^8.
       NOTE: En comparant le degré de nerf optique oedème donne une estimation de la gravité du nerf optique ischémie. A deux jours, la marge du nerf optique disque est floue, et les veines rétiniennes sont légèrement dilaté, par rapport à l'oeil (induite par non) controlatéral. Effectuer électrorétinogramme (ERG) et flash visuel potentiel évoqué (VEP ¹¹⁾ à deux et quatre semaines après l' induction pour l' analyse de l' électrophysiologie.

Résultats

La visualisation des lentilles de contact activé centrale de la rétine (figure 1). Le spot laser focale illumine le disque optique à l'arrière de la rétine (figure 2). La rétine induite non normale est représentée en image par une lampe à fente bio-microscope (figure 3A) et par SD-OCT (figure 3B et 3C). Lors de l' induction par laser, en l' absence de colorant est présent dans la circulation, la lumière...

Discussion

Bien qu'il existe un certain nombre de modèles de lésions du nerf optique (optique écrasement du nerf ^12, section du nerf optique ^13, et PION ^14), le modèle de rNAION est humain, adaptable à des rats et des souris. Il ressemble plus à l'état clinique humain de NOIAN. Cette condition comprend antérieure progressive du nerf optique œdème, un syndrome du compartiment de nerf optique antérieure, l'ischémie focale axonale, isolé cellules ganglionnaires de la rétine des lésions axo...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Laser 50 mW 532 nm	Laser ophtalmique standard	Iridex
0 - 100 mW Laser 532 nm	Technologies		Substitut de l’iridex
Adaptateur de lampe à fente laser	Iridex		SMA Adaptateur couplé pour la sortie laser
Compteur laser cohérent Fieldmate avec capteur à thermopile	Cohérent		autres également appropriés
Examen ophtalmique Lampe à fente biomicroscope	Divers		Haag-Streit est le meilleur ; versions moins chères disponibles sur ebay
Rose Bengal	Sigma	330000-1G	Agent photoducteur
Fundus Lentille de contact ou verre couvre-slip	custom/Cantor and Nissel (Royaume-Uni)		Lentille plastique planoconvexe conçue sur mesure pour l’examen de la vue et l’induction
Tropicamide 1 %
Pâte à polir	Tamiya Tamiya, INC	87068	de contact de polissage
2,5 % Hypromellose (Goniovisc)/1 % Méthycellulose	HUB Pharmaceuticals	agent de couplage pour
2,5 % Néosynéphrine Gouttes ophtalmiques	Alcon labs		Agent dilatateur de la pupille
Tropicamide 1 %	Alcon labs		agent dilatateur de la pupille
0,5 % Proparacaïne	Alcon labs		topique Anesthésique
30 G seringue à insuline à aiguille fusionnée	Divers	Divers	pour l’injection intraveineuse de rose bengale
Pommade antibiotique ophtalmique avec dexaméthasone ajoutée (pommade antibiotique triple)	Divers		Divers Appliquer après induction pour minimiser les cicatrices cornéennes
Heidelberg Corporation Domaine spectral-Tomographe par cohérence optique	Heidelberg Mesures	de base et post-induction de la Corporation for Optical Coherence ; non essentielles pour l’induction

Laserglow lentille lentilles de contact