Une méthode non-invasive et technique non-intensif pour Induction et phénotypage of Experimental pneumonie bactérienne chez les souris

Summary

Plusieurs procédés ont été décrits dans la littérature pour la modélisation de la pneumonie bactérienne chez les souris. Nous décrivons ici un peu coûteux, un procédé rapide et non invasif destiné à induire une pneumonie par aspiration ( par exemple, inhalation) , d'un inoculum bactérien pipeté dans l'oropharynx. méthodes en aval pour l'évaluation de la réponse immunitaire innée pulmonaire sont également détaillées.

Abstract

Bien que la pneumonie communautaire reste un problème majeur de santé publique, des modèles murins de la pneumonie bactérienne ont récemment facilité les avancées précliniques importantes dans notre compréhension de la pathogenèse cellulaire et moléculaire sous - jacent. Modèles in vivo de souris capturent la physiologie intégrée et de la résilience de la réponse de défense de l' hôte en d' une manière non révélée par, ex vivo approches simplifiées alternatives. Plusieurs procédés ont été décrits dans la littérature pour l'inoculation des bactéries intra-pulmonaire chez la souris, y compris la pulvérisation en aérosol, l'administration intranasale, par voie buccale endotrachéale canulation dans des conditions «aveugle» et visualisé et transcutanée endotrachéale canulation. Toutes les méthodes ont leurs mérites et les limites relatives. Ici, nous décrivons en détail un procédé non invasif sur le plan technique non intensif, peu coûteuse et rapide pour la délivrance intratracheale de bactéries qui implique l' aspiration ( par exemple, inhalation) , par la sourisd'un inoculum infectieux pipeté dans l'oropharynx sous anesthésie générale. Cette méthode peut être utilisée pour l'administration pulmonaire d'une grande variété d'agents biologiques et chimiques non-caustique, et il est relativement facile à apprendre, même pour les laboratoires ayant une expérience minimale préalable avec les procédures pulmonaires. En plus de décrire la méthode de pneumonie par aspiration, nous fournissons également des procédures étape par étape pour le dosage de l'subséquente in vivo la réponse immunitaire innée pulmonaire de la souris, en particulier, des méthodes pour quantifier la clairance bactérienne et la réponse immunitaire cellulaire des voies respiratoires infectées. Cette approche intégrée et simple d'évaluation de la pneumonie permet une évaluation rapide et robuste de l'effet des manipulations génétiques et environnementaux sur l'immunité innée pulmonaire.

Introduction

Pneumonie communautaire demeure la principale cause de décès par infection aux Etats - Unis, avec peu de changements dans les taux de mortalité au cours des 40 dernières années , en dépit des améliorations en matière de vaccination et des stratégies antibiotiques ^1,2. Malgré l'absence de progrès sensibles au niveau de la santé publique, au cours des dernières années, des progrès considérables ont été réalisés dans notre compréhension de la pathogenèse moléculaire et cellulaire de la pneumonie, avec un grand nombre de ces avancées rendues possibles par l'utilisation de modèles de souris de l'infection pulmonaire. La traçabilité génétique de la souris, la similitude du murin et le système immunitaire humain et la vaste gamme de réactifs immunologiques murins ciblés qui sont devenus disponibles dans le commerce ont ainsi facilité des progrès rapides du champ.

Des modèles de souris de la pneumonie bactérienne décrite dans la littérature ont généralement compté sur l'un des quatre itinéraires techniques pour pathogène inoculation: i) aérosolisation; ii) intrlivraison anasal; iii) la livraison par voie orale; et iv) l' injection intra - trachéale chirurgicale (ie, trachéotomie) ^3. Toutes les voies d'infection ont des avantages et des inconvénients ^3. En particulier l'exposition, relative des voies respiratoires supérieures, le potentiel pour le mélange de la flore oronasaux, les exigences pour l'anesthésie générale, la variabilité de l'inoculum livré au poumon distal, la distribution lobaire des agents pathogènes livrés, les exigences d'expertise technique, et de la morbidité procédurale varient considérablement entre ces approches.

Communément techniques utilisées d'infection pérorales comprennent endotrachéale (translaryngée) canulation soit par un (non visualisées) approche «aveugle», ou sous visualisation directe laryngé ^3-5. Les deux méthodes, tandis que robuste, nécessitent une formation et portent aussi le risque de traumatisme des voies respiratoires supérieures. Dans le présent rapport, nous décrivons une méthode techniquement non intensive, non-invasive, peu coûteuse et rapide de l'infection par voie orale, wdit bactéries (Klebsiella pneumoniae dans l'exemple fourni) pipetés dans l'oropharynx d'une souris anesthésiée sont livrés aux poumons par aspiration (inhalation). Nous et d' autres ont utilisé la technique de la pneumonie par aspiration avec succès ^6-9. Cette méthode poumon-livraison polyvalent et facile à apprendre peut être étendue à la prestation de nombreux agents non caustiques supplémentaires pour les poumons, y compris les cytokines et d' autres protéines, des molécules d'agents pathogènes associés (par exemple, lipopolysaccharide), les cellules ( par exemple, le transfert adoptif), et les toxines (par exemple, la bléomycine). En plus de discuter des considérations techniques importantes, nous décrivons également une approche intégrée, quantitative pour évaluer la réponse de l' hôte à la suite de la pneumonie, y compris la mesure en aval de la clairance bactérienne (c. -à- unité formant colonie [CFU] quantification dans les poumons et périphériques organes) et leucocytaire l'accumulation dans l'espace aérien.

Protocol

Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la Loi sur la protection des animaux et de la politique US Public Health Service sur Humane soin et l'utilisation des animaux de laboratoire après examen par le soin des animaux et l'utilisation du Comité des NIEHS.

1. Préparation de K. pneumoniae Culture

Attention: Effectuer toutes les étapes d'un niveau de biosécurité 2 (NSB2) hotte ou autre zone désignée de NSB2 et jeter les déchets conformément aux directives de BSL2 institut.

1. Pour la croissance de la suspension de K. pneumoniae, décongeler un stock de glycérol de bactéries et ensemencer une culture de travail en transférant 1 ml de K. pneumoniae actions à 50 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) dans un flacon de 500 ml ou plus.
2. Faire des stocks de glycérol en ajoutant 900 pi de phase logarithmique culture K. pneumoniae de 100 pl de glycerol stérile et congélation à -20 ° C ou -80 ° C. Pour le stockage à long terme, -80 ° C est recommandée.
3. bactéries Culture de sTep 1.1 en secouant ballon pendant la nuit (14-18 h) à 37 ° C à 200-225 rpm.In afin de promouvoir la croissance en phase logarithmique, diluer 1-5 ml de cette culture d'une nuit dans un flacon contenant 50 ml de TSB le matin et placer en arrière à 37 ° C avec agitation pendant ~ 2,5 heures.
4. Transférer 1 ml de K. culture pneumoniae de la dernière étape dans un tube de 1,5 ml et centrifuger à 7500 g pendant 2 min. Une pastille blanche doit être visible. Retirer le surnageant sans perturber le culot, resuspendre doucement les bactéries à la pipette dans 1 ml de solution saline stérile, et tourner à nouveau à 7500 xg pendant 2 min.
   1. Effectuez cette étape de lavage 2x, ce qui porte jusqu'à la finale, culot lavé dans 1 ml de solution saline stérile.
5. Effectuer des dilutions en série log-sage de cette inoculum soignée. Par exemple, ajouter 400 ul de l'inoculum dans 3,6 ml de solution saline stérile en série pour faire une série de 10 ^-1 -10 ^-9 dilution.
6. Déterminer la DO ₆₀₀ de K. lavé pneumoniae en plaçant 1 ml de1:10 et 1: 100 dilutions dans des cuvettes jetables et mesure de la DO _600, obturateurs d' abord avec une solution saline stérile. Mesurer les doublons pour assurer l'exactitude. Une _DO600 de 1,0 est à peu près équivalente à 4-7 x 10 ⁸ UFC / ml. A noter que la relation entre le diamètre extérieur et CFU / ml peut ne pas être linéaire.
   1. Utilisez la DO ₆₀₀ des dilutions pour calculer la concentration de K. pneumoniae, l' application de la DO: conversion UFC / ml ci - dessus, et tenant compte de la dilution.
7. Utilisez le K. concentration pneumoniae pour préparer la dose d' inoculum de CFU souhaitée dans un
8. En outre plaque 100 pl de 10 ^-6 -10 ^-9 dilutions et 100 pi de sérum physiologique stérile sur de la gélose trypticase soja (TSA) des plaques individuelles à TA. Incuber à 37 ° C pendant la nuit et d'énumérer les colonies bactériennes afin de calculer la concentration exacte qui a été utilisé dans l'expérience et de contrôler la contamination.
   NOTE: la concentration bactérienne réelle du inoculum final peut être de ± 500 UFC / ml que prédit par absorbance. Les expérimentateurs devraient idéalement confirmer l'OD _600: UFC relation / ml dans les études pilotes avant l'utilisation in vivo chez la souris, réajustant empiriquement l'OD _600: UFC / ml de conversion basé sur leur expérience personnelle.

2. murin intratrachéale (it) Aspiration de K. pneumoniae de Oropharynx

1. Assurez-vous que les souris sont identifiés de manière unique par la queue marque, tatouage, ou tout autre identifiant approuvé.
2. Dressez dosage inoculum de bactéries en utilisant P200 pipette avant de retirer les souris de l'isoflurane afin d'accélérer la procédure. Pour obtenir les meilleurs résultats avec elle aspiration, utiliser un volume de <100 pi pour éviter le débordement. Ici, utiliser 2000 UFC / 50 pi de K. pneumoniae.
3. Anesthetize souris dans une chambre claire avec le gaz isoflurane (par exemple, 2% d' isoflurane au taux de 1 L / min) ou par Institdirectives utional. Le nombre de souris pour anesthésier ensemble est déterminé par le niveau de confort de l'expérimentateur, généralement 1-2 à la fois. Observer la respiration et de confirmer le niveau de l'anesthésie, une fois respirations profondes sont visibles et 2-3 sec peuvent être comptés entre les respirations.
   NOTE: Si l'on se préoccupe des effets de confusion possibles de volatiles anesthésiques (par inhalation), l'anesthésie peut être obtenue à la place avec une injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine. Avec la méthode décrite ci-dessus, l'anesthésie profonde ne dure que quelques minutes. Si plus d'une anesthésie prolongée est induite, une pommade ophtalmique doit être utilisée pour éviter la dessication oculaire.
4. Une fois que la souris est anesthésiée, placez - le dans une position couchée semirecumbent, suspendu par les incisives maxillaires d'une bande de caoutchouc tendue entre des piquets sur une planche inclinée en plexiglas (Figure 1).
5. Tirez doucement sur la langue de la souris sur le côté avec une paire de pinces non striées émoussées et la dose de dépôt dans la cavité buccale avec un pipett P200e. Exercer grand soin pour éviter d'induire un traumatisme soit la langue ou de l'oropharynx.
6. Tout en gardant la langue rétractée, obturer doucement le nez avec un doigt ganté jusqu'à ce que la souris inhale. Continuer à recouvrir le nez jusqu'à ce que la souris a pris deux ou plusieurs inhalations, et aucun liquide est visible dans la cavité buccale. Couvrant le nez aide à faire en sorte que la souris inhalent les bactéries dans les poumons, comme les souris respirent par le nez.
7. Retirez la souris de la carte d'inoculation et de retourner dans sa cage, en plaçant la souris sur son dos pour empêcher la literie ou les débris de bloquer les narines alors que la souris se remet de l'anesthésie.
8. Une fois que toutes les souris ont été dosés et ont réveillé de l' anesthésie, les souris de maison dans une cabine / chambre ne contenant que des souris qui ont été dosés avec K. pneumoniae. Surveiller les souris par jour, y compris le poids corporel si vous allez au - delà de 48 heures après l'infection.
9. Utilisez mash quotidienne et / ou de la chaleur supplémentaire si permettant à la souris pour aller au-delà de 48heure.

3. Bronchoalveolar Lavage Fluid (LLBA) Collecte et analyse

1. Euthanasier souris par des directives institutionnelles. Ici, utiliser une injection létale de 150 mg / kg de pentobarbital de sodium ou dose équivalente de solution d'euthanasie commerciale suivie par exsanguination, car cela évite les complications possibles aux poumons associés à inhalation de CO ₂ et la dislocation cervicale.
2. Position souris sur le dos et stériliser la souris par pulvérisation fourrure avec 70% d'éthanol en particulier sur la poitrine et le cou.
3. Faire une coupe longitudinale juste en dessous du sternum, puis en maintenant le sternum avec une pince, entaille le diaphragme, ce qui permet le poumon retomber dans la cavité thoracique. Couper à travers la cavité de la poitrine de part et d'autre de la vasculature puis vers le haut à travers le col, ce qui expose la trachée.
4. Comme la trachée est entouré de muscles longitudinaux de chaque côté, découpez soigneusement par le milieu et pousser le tissu sur les côtés, ainsicela évite de couper le système vasculaire périphérique, ce qui pourrait introduire du sang dans la trachée. Si la vascularisation est entaillé, nettoyer la zone environnante avec de la gaze avant d'accéder à la lumière trachéale.
5. Utilisez des ciseaux chirurgicaux ou une aiguille pour nick la trachée environ ¼ de la descente de la tête et insérer une canule attachée à une seringue de 1 ml préchargé avec 1 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS) caudale dans la trachée. Si vous utilisez des souris <8 semaines d'âge ou les femmes, réduire le volume de lavaging à 600-800 pi.
6. Poussez le volume dans les poumons lentement, permettant à tous les lobes de gonfler puis retirer le volume arrière avec la seringue, en répétant 3x. Si PBS sort des narines de la canule n'a pas été poussé assez loin dans la trachée ou l'inflation se produit trop rapidement. Par ailleurs, si les poumons ne sont pas gonfler bien, la canule a été poussé trop loin, donc retirer légèrement.
7. Collecter lavages communs dans un tube de 15 ml sur la glace.
8. Tournerle fluide de l'espace aérien de lavage à 1200 xg pendant 5 min, recueillir le surnageant dans un tube de 1,5 ml et congeler à -80 ° C. Par la suite, utiliser le surnageant (c. -à- BALF) pour la mesure des protéines, des cytokines, et pour diverses autres analyses biochimiques. Le culot représente les cellules de l'espace bronchoalvéolaire.
9. Si les globules rouges (hématies) sont évidentes dans le culot cellulaire en fonction de la couleur, Lyse avec 1 ml de tampon de lyse ACK pendant 1 min, suivi par l'addition de 5 ml de 1 x PBS pour arrêter la réaction de lyse et on dilue le tampon. Manipuler tous les échantillons de manière identique, soit traité ou non avec un tampon de lyse ACK.
10. cellules Spin à 1200 xg pendant 5 min, décantent le surnageant, et amener les cellules dans 1 ml de PBS 1x.
11. Vortex et comptage des cellules sur un hémocytomètre pour le dénombrement des cellules de l'espace aérien au total.
12. Sur la base de la densité de cellules, ajouter environ 80-150 ul (~ 80 ul d'une souris infectée et ~ 150 pour une souris naïve) dans une chambre de coulissement dans une centrifugeuse Cytospin. cellule de Spins sur des lames de microscope pour la coloration ultérieure pour déterminer les populations différentielles de cellules.
13. Laisser les cellules à sécher sur des lames du jour au lendemain. Cellules Stain avec tri-taches (par exemple, Hema 3 [voir tableau]) en plongeant les lames 7 fois en fixateur, 9 fois dans la tache 1, et 7 fois dans la tache 2 (pas de rinçages entre les taches), et laisser sécher. Après tache a séché, des lames de lamelle et manuellement comptent des différences par microscope. En général, les neutrophiles et les monocytes / macrophages sont facilement distingués par leur taille et leur morphologie nucléaire.

4. Détermination de la charge bactérienne dans les poumons et périphériques Tissues

1. Avant de commencer: préparer des tubes de dilution avec 900 ul de PBS 1x pour le poumon et de la rate et 90 ul de PBS 1x pour le sang. plaques d'étiquetage pour la culture de bactéries et fixés à la température ambiante; par conséquent, le temps une fois le tissu a été recueillie sera minimisée entre l'homogénéisation et le placage pour la croissance bactérienne.
   Remarque: En raison de la dépo hétérogènetion de bactéries dans les poumons qui peuvent se produire avec l'aspiration, il est recommandé que les souris individuelles sont utilisées pour l'analyse de l'une cellularité totale des voies aériennes ou des poumons totale (bilatéral) la charge bactérienne.
2. Euthanize la souris selon l'étape 3.1, et ensuite recueillir le sang du ventricule gauche, en plaçant dans un tube héparinisé pour éviter la coagulation. Supprimer tous les lobes pulmonaires et les placer dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de PBS 1x, suivi de l'élimination de la rate et le placement dans 2 ml de PBS 1x. Placer les tubes sur la glace. Prenez soin de nettoyer les instruments avec de l'éthanol entre chaque tissu / souris.
3. Homogénéiser le tissu sur la glace, de préférence avec des homogénéisateurs jetables qui peuvent être changés entre chaque échantillon. Conseils homogénéisateur jetables peuvent être autoclavés pour une réutilisation entre les expériences.
4. Une fois que le tissu a été homogénéisé, effectuer des dilutions en série et de la plaque. Des échantillons de plaques d'un tissu / dilution donnée en double sur une seule plaque TSA en traçant une ligne de démarcation sur le plastique. Placage et disuggestions lution sont présentés ci-dessous (dans tous les cas, 10 pi d'échantillon est étalé sur la plaque) et sont basés sur un post-infection nécropsie 24 h. Si l'analyse des échantillons de 48-72 h, un plus grand nombre de dilutions peut avoir besoin d'être plaqué en raison de la charge bactérienne accrue aux points de temps plus tard.
   1. For Blood - diluer 1:10 en ajoutant 10 pi de sang dans 90 ul de stérile 1x PBS. Plate propre et 1:10 échantillons dilués en double. Une fois que le sang a été plaqué, essorer le sang résiduel à 9300 g pendant 10 minutes pour extraire le plasma pour mesurer les cytokines et chimiokines.
   2. Pour Lung - diluer 1:10 - 1: 100 en ajoutant 100 pi de poumon homogénéisé dans 900 ul de PBS stérile 1x série. Plate homogénat propre et toutes les dilutions en double.
   3. Pour Spleen - diluer 1: 10-1: 100 en ajoutant 100 pi de la rate homogénéisé dans 900 ul de PBS stérile 1x série. Plate homogénat propre et les deux dilutions en double.
5. Laisser sécher les échantillons étalés brièvement.
6. Inversez plaques de TSA et les placer dans un statique 37 ° C incubateur pendant une nuit.
7. Déterminer le nombre de bactéries colonisant en faisant la moyenne des colonies bactériennes des deux côtés de la plaque et de chaque dilution. Facteur dans les dilutions initiales de 5 ml pour le poumon et 2 ml pour la rate pour déterminer CFU de tissus totaux.

Results

C57BL / 6 ont été infectées avec 2000 UFC de K. 43816 pneumoniae (sérotype 2) par aspiration de l' oropharynx dans les poumons. A cette dose, les souris commencent généralement à montrer des symptômes cliniques post-infection 12-24 h , y compris la léthargie, fourrure ébouriffée, et la perte de poids de 5 à 10% (figure 2A). Dans 48-72 h post-infection, la plupart des souris montrent des symptômes de la maladie et de la morbidité qui est généralement pré...

Discussion

Les modèles murins de la pneumonie bactérienne, en partenariat avec le ciblage de gènes et dans les interventions biologiques et pharmacologiques in vivo, ont fourni des informations critiques dans la réponse de la défense de l' hôte pulmonaire. De grands progrès ont été accomplis en particulier dans notre compréhension des chimiokines et des molécules d'adhésion qui régissent le recrutement des neutrophiles à l'espace aérien infecté ^10,11. Modèles in vivo de la pneumoni...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, sérotype 2	ATCC	43816
Bouillon de soja tryptique	Becton Dickenson	211825
Excel Cathéters Safelet IV, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
Seringues à tuberculine de calibre 27½	Fisher	14-826-87
Collecteurs de plasma d’héparine de lithium	Fisher	2675187
Épandeurs jetables en forme de L	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7,4	préparé sur place	n/a	Eau distillée (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5,75 g), KH2PO4 (1 g)  ;   ;   ;
Tampon de lyse ACK	préparé en interne	n/a	NH4Cl (4,145 g), KHCO3 (0,5 g), EDTA (18,6 mg), porter jusqu’à 500 ml avec de l’eau distillée et un pH à 7,4