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Imaging G Protein-Coupled Receptor-médiée chimiotactisme et ses événements de signalisation dans les cellules HL60 neutrophiles comme

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DOI :

10.3791/54511

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14 septembre 2016

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1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

essais de chimiotaxie visuels sont essentiels pour une meilleure compréhension de la façon dont les cellules eucaryotes contrôler la migration cellulaire chimiotactique directionnelle médiée. Ici, nous décrivons des méthodes détaillées pour: 1) en temps réel, la surveillance à haute résolution de plusieurs essais de chimiotaxie, et 2) visualisant simultanément le gradient chimiotactique et la dynamique spatio-temporelle des événements dans les cellules HL60 neutrophiles comme la signalisation.

Résumé

Les cellules eucaryotes détectent et se déplacent vers un gradient de chimioattraction, un processus cellulaire appelé chimiotaxie. La chimiotaxie joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques, tels que l’embryogenèse, la structuration des neurones, les métastases des cellules cancéreuses, le recrutement des neutrophiles dans les sites d’inflammation et le développement de l’organisme modèle Dictyostelium discoideum. Les cellules eucaryotes détectent les attractifs chimiochimiques à l’aide de récepteurs couplés aux protéines G. Les tests de chimiotaxie visuelle sont essentiels pour mieux comprendre comment les cellules eucaryotes contrôlent la migration cellulaire directionnelle médiée par le chimioattractant. Ici, nous décrivons des méthodes détaillées pour : 1) la surveillance en temps réel et à haute résolution de plusieurs tests de chimiotaxie, et 2) la visualisation simultanée du gradient de chimioattractant et de la dynamique spatio-temporelle des événements de signalisation dans les cellules HL60 de type neutrophile.

Introduction

Les cellules eucaryotes sens et se déplacent vers la plus forte concentration dans un gradient chimiotactique, un processus cellulaire désigné comme chimiotaxie. Chimiotaxie joue un rôle critique dans de nombreux processus physiologiques, tels que l' embryogenèse 1, neurone patterning 2, les métastases de cellules cancéreuses 3, le recrutement des neutrophiles vers les sites d'inflammation 4, et le développement de l'organisme modèle 5 Dictyostelium discoideum. En général, les cellules eucaryotes détectent chemoattractants en utilisant G récepteurs couplés à la protéine 5. L'engagement des chemoattractants avec ces récepteurs favorise la dissociation des protéines G hétérotrimériques et Ga Gßy, qui activent à leur tour en aval des voies de transduction du signal qui régulent finalement l'organisation spatio - temporelle du cytosquelette d'actine pour entraîner la migration des cellules 5-9.

Les biologistes cellulaires ont été perfectionnés en chemotaxest des tests pour examiner comment G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) de signalisation médie dirigés la migration cellulaire. La chambre ou la migration Transwell test Boyden a été développé en 1960 par Boyden 10. Le dosage fonctionne en créant un gradient de composés chimiotactiques entre deux puits qui sont séparés par une membrane microporeuse. Sa simplicité et sa facilité d'utilisation en font chimiotaxie test le plus largement utilisé à ce jour. Cependant, l'essai ne permet pas la migration du processus des cellules à visualiser. La chambre Zigmond est le premier dispositif microfluidique visuel qui permet l' imagerie claire de la migration cellulaire sur une lamelle à travers un étranglement étroit vers un chimiotactique de source 11. Dunn 12 et Insall 13 modifiés et améliorés à haute résolution et de la capacité d'imagerie à long terme de la chimiotaxie de chambre dosage Zigmond. En raison des caractéristiques hautement prévisibles, diffusion-dominante de l'écoulement du fluide, la microfluidique a été la fourniture de solutions pour la prochaine generatisur des tests de chimiotaxie, tels que EZ-TAXIScan (un dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire).

Avec la stabilité du gradient assurée, le dispositif permet chimiotaxie six essais à effectuer en même temps (figure 1A). Par contraste avec les gradients directionnellement fixes générés dans les différents essais de la chambre ci - dessus, le dosage de l' aiguille ou micropipette développée par Guenther Gerisch génère un gradient avec une source mobile 14. Dans l'essai, chimioattractant est libéré à partir d'une micropipette mobile pour générer un gradient stable. Avec ce test de l'aiguille, les chercheurs ont constaté que les cellules différentes génèrent pseudopodes avec des caractéristiques fondamentalement différentes. En appliquant la microscopie à fluorescence, nous avons été capables de visualiser le gradient pour faciliter sa mesure quantitative à travers 15. Dans cette étude, nous décrivons des méthodes détaillées pour la préparation chimiotactique HL60 (leucémie promyélocytaire humaine) cellules, suivi simultanément plusieurs chimiotaxie assays avec le dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire et la visualisation de la dynamique spatiotemporelle GPCR médiation par des molécules de signalisation telles que la protéine kinase D1 dans les cellules vivantes uniques en réponse à des stimuli chimiotactiques visibles, spatiotemporellement contrôlable. Nos méthodes d'imagerie de pointe peuvent être appliqués à des études générales de chimiotaxie, et sont particulièrement appropriés pour des systèmes de cellules de mammifères.

Protocole

1. Culture et Différenciation des humains neutrophiles comme cellules HL60

  1. Préparer un milieu RPMI (Roswell Park Institute Memorial) 1,640 milieu de culture contenant du milieu RPMI 1640, 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS), du pyruvate de sodium 0,1 mM, et 25 mM de HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1 l'acide -piperazineethanesulfonic). Chauffer le milieu de culture RPMI 1640 et 37 ° C.
  2. En utilisant un hémocytomètre déterminer la densité cellulaire des cellules HL60 pour vérifier que les cellules sont en phase de croissance en phase logarithmique.
    NOTE: Les cellules sont généralement en phase logarithmique le troisième jour après repiquage. La densité des cellules en phase logarithmique est généralement 6-8 x 10 5 cellules / ml. La densité cellulaire nécessaire pour démarrer une nouvelle culture est d' environ 1,5 x 10 5 cellules / ml.
    NOTE: Par exemple, pour une 10 ml nouvelle culture dans un flacon plat T-75, si la densité cellulaire des cellules en phase logarithmique est de 6 x 10 5 cellules / ml, puis 2,5 ml de cellules en phase logarithmique (6 x 10 5 ) est diluée à 1,5 x 10 5 cellules / ml dans 10 ml nouvelle culture. Pour un volume final de 10 ml de culture, 7,5 ml de RPMI 1640 milieu de culture est ajouté.
  3. Placez le volume calculé de chaud RPMI 1640 milieu de culture dans un flacon plat. Pour une culture en flacon T-75 plat, le volume total de la culture cellulaire est de 10 ml.
  4. Ajouter le volume calculé de cellules HL60 phase logarithmique de croissance dans le flacon à plat pour atteindre une densité cellulaire de 1,5 x 10 5 cellules / ml.
  5. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2.
    NOTE: Le temps de doublement de HL60 est presque 24 h.
  6. Passage des cellules avec du RPMI 1640 du milieu de culture tous les 2-3 jours. Il est important que la densité cellulaire des cellules HL - 60 ne dépasse jamais 1,5 x 10 6 cellules / ml et le passage cellulaire ne dure pas plus de 2 mois.
  7. Différencier les cellules HL60 5 jours avant les expériences.
    REMARQUE: le milieu RPMI 1640 de différenciation contient du milieu RPMI 1640, 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS), du pyruvate de sodium 0,1 mM, 25 mM d'HEPES et 1,3% de diméthylsulfoxyde (DMSO). En d'autres termes, elle est de 1,3% de DMSO dans du RPMI 1640 du milieu de culture.
    1. Pour différencier les cellules HL60, préchauffer le milieu de culture RPMI 1640 et 37 ° C. Ajouter le RPMI 1640 milieu de culture chaud dans un flacon plat.
    2. Pour une culture de 10 ml de la différenciation des cellules HL60 finale, ajouter 130 ul de DMSO directement au milieu de culture RPMI 1640 dans le ballon plat et en agitant le flacon de sorte que le DMSO est rapidement dilué par du milieu de culture RPMI 1640.
    3. Ajouter des cellules HL60 phase logarithmique jusqu'à une densité cellulaire finale de 1,5 x 10 5 cellules / ml dans 10 ml de milieu RPMI 1640 finale de différenciation. Cultiver les cellules dans du RPMI 1640 HL60 milieu de différenciation à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 pendant 5 jours.

2. revêtement de la surface de couverture en verre de la Chambre 4well

  1. Prenez la bouteille de solution de gélatine de stock 2% par rapport au réfrigérateur, nettoyer avec 70% d'éthanol, et le placer dans la hotte. Take 1 ml solution à 2% de gélatine de stock et retourner immédiatement la gélatine solution mère restante au réfrigérateur.
  2. Laisser la solution de gélatine pour liquéfier complètement à 37 ° C et la pipette à fond. Diluer la solution à 2% de gélatine d'actions avec une solution saline équilibrée de 9 ml préchauffé 1x Hanks (HBSS) tampon à une concentration finale de 0,2% de gélatine.
  3. Ajouter 0,5 ml ou 2 ml de 0,2% de gélatine dans HBSS les deux puits moyen d'une chambre 4 puits ou une chambre 1 puits avec un couvercle en verre dans le fond, respectivement. Inclinez les plaques dans plusieurs directions pour que le liquide recouvre la totalité de la surface.
  4. Placer les plaques dans un incubateur à 37 °. Les plaques seront prêtes pour une utilisation dans 1 h. Ils peuvent être utilisés pour 5 jours. Juste avant l'ensemencement des cellules, enlever la solution de gélatine à partir des 4 puits ou 1 puits chambres.

3. chimiotactisme Assay Utilisation Cellule d'analyse Mobilité périphérique

  1. Préparer et réchauffer RPMI 1640 faim, qui est RPMIun milieu contenant 0,1 mM de pyruvate de sodium (en option) et HEPES 25 mM.
  2. Préparer 100 pi de 100 nM de fMLP (N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine) dans RPMI 1640 affamés moyen.
  3. Préparer 3 ml de 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) / milieu RPMI 1640 contenant 1% de BSA dans du RPMI 1640 affamés milieu et 10 ml de BSA à 0,1% / RPMI 1640.
  4. Enduire une lamelle carré de 22 mm et d'une mobilité cellulaire puce de dispositif d'analyse de 5 um avec fraîchement préparé 1% de BSA / RPMI 1640 pendant 1 heure à température ambiante.
  5. Assembler le porteur selon la procédure suivante:
    1. Positionner la base de support avec les leviers dans la position verticale, de sorte que les leviers peuvent basculer vers l'utilisateur. Appliquer une solution d'éthanol à 70% à la surface du verre 41 mm. Essuyez soigneusement les surfaces avec une lingette, en prenant soin de ne pas les rayer.
    2. Insérez le verre de 41 mm dans la base de support. Mettez le 22 mm lamelle carré BSA revêtu sur le dessus du verre de 41 mm dans la base de support.
      NOTE: Le carré revêtu coverslip entre le verre de 41 mm et la puce permet chimiotaxie de se produire sur le substrat de la surface de revêtement.
    3. Insérer le joint torique (faible) dans le fond du logement de plaquette, et monter le logement de plaquette dans la base de support avec le trou elliptique à l'arrière. Tirez le niveau interne de la base de support vers la position horizontale pour verrouiller le logement de plaquette en position.
    4. Souffler toute poussière de l'intérieur du logement de plaquette avec un chiffon à poussière de l'air. Ajouter 4 ml de BSA à 0,1% / RPMI 1640 dans le logement de plaquette.
    5. Monter la puce du dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire BSA revêtu dans le centre du logement de plaquette avec la face vers le bas de structure en contact avec le verre.
      NOTE: Que la puce doit être insérée avec la marque de positionnement (le trou dans la partie supérieure de la puce) à l'arrière.
    6. Fixer le joint d'étanchéité en caoutchouc sur la partie inférieure de la pince de la plaquette en ajustant les deux saillies sur le joint en caoutchouc dans les trous.
    7. Monter le joint torique (grande) surla partie supérieure du logement de plaquette. Monter la pince de tranche avec le trou de détection à l'arrière. Tirez le levier externe de la base du boîtier vers l'avant en position horizontale pour verrouiller la pince de la plaquette en place.
    8. Après le montage du support, placez le fond du support sur la boîte à lumière pour confirmer qu'il n'y a pas de bulles d'air dans les puits. Si des bulles d'air sont détectées, retirez-les à l'aide de la seringue en plastique fourni équipé d'un embout de chargement d'échantillon.
    9. Retirez le couvercle et placez l'ensemble sur la plaque sur le dessus de l'unité de dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire. Fixer le bloc capteur sur le support.
  6. Préparer des cellules HL60 pour la chimiotaxie dosage:
    1. Calculer la densité cellulaire des cellules HL60 différenciées avec un hémocytomètre. Au bout de 5 jours de différenciation, de la densité des cellules est d' environ 1,0 x 10 6 cellules / ml.
    2. Calculer le volume final de cellules HL60 à une densité cellulaire finale de 2 x 10 6 cellules / ml. Par exemple, si la densité cellulaire de lacellules HL60 différenciées est de 1,0 x 10 6 cellules / ml, puis 10 ml de cellules HL60 différenciées seront remises en suspension avec 5 ml de 0,1% de BSA / milieu RPMI 1640 pour atteindre 2 x 10 6 cellules / ml.
    3. Centrifugeuse différenciée cellules HL60 à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec le volume calculé de 0,1% de BSA / milieu RPMI 1640 à l' étape 3.6.2) à une densité cellulaire finale de 2 x 10 6 cellules / ml.
  7. Démarrez l'unité de dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire et PC pour l'acquisition d'image. Branchez l'appareil à l'ordinateur. Activer le dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire. Allumez le PC.
  8. Start Up Cell Analysis Mobility Device Software.
    1. Observer 5 panneaux de contrôle: images caméra, chauffage, prise de vue, mémo, et l'appareil photo.
    2. Sur le panneau de contrôle de l'image de la caméra, utilisez "ligne horizontale" ou "ligne verticale" pour régler la position support / vue en temps réel pour centrer la caméra dans le panneau d'image de la caméra.
    3. Sur le panneau de contrôle de la caméra, sélectionnez CH1 à CH6 pour déplacer la caméra vers le canal défini. Pour centrer les champs d'un canal d'affichage, cliquez sur "Déplacer L" ou "Déplacer R" pour régler la coordonnée X de la caméra et centrer la position de l'appareil photo horizontalement.
    4. Réglez la coordonnée Y de la caméra en tournant le bouton de position sur le panneau avant de l'unité de dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire pour ajuster verticalement l'image pour centrer l'écran.
    5. Sur le panneau de commande de chauffage, réglez le "temp de support" à 37,0 ° C et la "température de la plaque" à 39 ° C. Cliquez sur "Heat" pour commencer le chauffage. Également cliquer "titulaire" pour contrôler la température à l'aide du capteur thermique relié au support.
    6. Sur le panneau de tir, entrez "15 ​​sec" à "Interval" et "30 min" à "Time" pour les intervalles et la durée de l'essai de chimiotaxie. Cochez la case "appareil de chauffage à la fin de la prise de vue" pour des raisons de sécurité. Désigner un destination pour les images enregistrées.
    7. Sur le panneau de mémo, entrée les spécificités des expériences, telles que la lignée cellulaire utilisée, si oui ou non le traitement a été appliqué, et la concentration de chimio-attractants appliquées.
    8. Confirmer la position du centre de tous les canaux qui seront utilisés dans les expériences, et répéter l'ajustement pour tous les canaux si nécessaire.
  9. Injecter et Aligner les cellules comme suit:
    1. Retirer le tampon du support, et sortez 8 pi de tampon du troisième puits du haut pour chaque canal.
    2. Utiliser une seringue pour injecter 2 pi de cellules dans le deuxième puits dans le même canal, tout en surveillant l'écran en temps réel pour contrôler le nombre de cellules et le débit lors de l'injection. Après que les cellules sont bien alignées, ajouter immédiatement les 8 pi de tampon de retour. Répétez la même procédure pour les autres canaux (figure 1B).
  10. Ajouter 2 ml de tampon de retour sur le support, et ajouter 1 pl 100 nM fMLP au troisième puits du haut. Lancer l'acquisition d'image et enregistrer les données. Analyser les données obtenues en utilisant un logiciel de traçage 9 image (Figure 2).

4. Transfection avec électroporation

  1. Différencier cellules HL60 5 jours avant l'expérience comme décrit dans la section 1. Coat 4 puits ou 1 puits chambres comme indiqué à la section 2.
  2. Préparer et chauffer le milieu RPMI 1640 de récupération de l'électroporation, contenant du milieu RPMI 1640, 20% (v / v) de FBS, du pyruvate de sodium 0,1 mM, et 25 mM de HEPES, à 37 ° C.
  3. Juste avant de commencer l'expérience de transfection, soit ajouter 300 pi ou 3 ml de RPMI 1640 du milieu de culture dans les puits des chambres de pré-enduites 4 puits ou cupules 1, respectivement.
  4. Incuber les chambres humidifiée dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Utilisez ces chambres immédiatement ou conserver dans l'incubateur pour une utilisation future (deux semaines).
  5. Compter la densité des cellules différenciées du HL60 cellules avec un hémocytomètre.
    REMARQUE: La densité cellulaire atteint souvent d' environ 1,0 x 10 6 cellules / ml. La densité cellulaire supérieure à 3,0 x 10 cellules 6 / ml donne généralement l' efficacité de transfection indésirable. Comme les cellules HL60 sont des cellules en suspension, aucune remise en suspension est requise.
  6. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. Eliminer le surnageant et remettre en suspension de 2 x 10 6 cellules HL60 dans 100 ul de réactif de transfection.
  7. Ajouter 4 pg de GFP-PKD1 plasmidique 9 dans le mélange de 100 pi de cellules et de réactifs de transfection et mélanger doucement et soigneusement. Ajouter le mélange dans la cuvette prévue.
  8. Sélectionnez le programme de pré-série du fabricant pour la lignée cellulaire leucocytaire humain et effectuer la électroporation.
    NOTE: Des informations complémentaires sont disponibles sur le site Web du fabricant.
  9. Après l'électroporation, immédiatement et lentement ajouter préchauffée 500 ul de RPMI 6140 milieu de récupération d'électroporation aux cellules, ettransférer doucement les cellules de la cuvette dans un tube de 1,6 ml à la pipette en plastique fournis.
  10. Incuber les cellules pendant 30 min dans un humidifiée à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2. Graine de 100 pi ou 500 pi de cellules dans un puits d'une 4 puits ou une chambre 1 puits, respectivement.
  11. Ajouter du RPMI 1640 du milieu de culture jusqu'à un volume final de 1 ml ou 4 ml de ce même puits d'un puits 4 ou d'une chambre 1 puits, respectivement. Incuber les cellules dans un humidifiée à 37 ° C incubateur avec 5% de CO2 pendant 3 h. Préchauffer RPMI 1640 affamés à 37 ° C.
  12. En utilisant une pipette de 1ml, retirez délicatement 0,8 ml ou 3 ml de milieu RPMI 1640 culture du puits d'une chambre 4 puits ou une chambre 1 puits, respectivement. Soyez doux et éviter aspirer les cellules HL60 adhèrent.
    NOTE: les cellules HL60 se développent et se différencient dans les milieux de suspension. Après avoir été différenciés ou avec certains traitements, les cellules HL60 adhèrent au substrat revêtu avec de la polylysine, le collagène, la gélatine, ou fifibronectine.
  13. Ajouter 0,8 ml ou 3 ml de RPMI 1640 affamés milieu dans le puits d'une chambre 4 puits ou 1 puits, respectivement. Attendre 1 h.
    NOTE: A ce stade , les cellules sont prêtes pour des expériences d'imagerie 9.

5. Suivi GPCR médiée Membrane translocation de PKD1 par Multi-canal Fluorescent Microscopie

  1. Préparer un nouveau mélange de 100 nM de fMLP et 1 pg / ml Alexa 594 dans RPMI 1640 affamés moyen comme stimuli.
    NOTE: Le mélange de fMLP et Alexa 594 a besoin d'être fraîchement préparé pour assurer une efficacité maximale.
  2. Monter une chambre 4 puits ensemencé avec des cellules sur une lentille d'huile 40X.
  3. Réglez le microscope à fluorescence dans la configuration multicanal comme suit:
    1. Réglez le canal vert d'émission (500-530 nm) pour la GFP-tagged PKD1, canal d'émission rouge (580-620 nm) pour chimiotactique fMLP (Alexa 594), et le canal de lumière transmise pour identifier les cellules HL60 adhèrent.
    2. Lancer acquisition "live" etoptimiser les conditions d'acquisition des trois canaux:
    3. Affiner entre l'intensité et la puissance du laser pour les trois canaux afin de minimiser photoblanchiment pendant une période plus longue de l'imagerie.
    4. Si nécessaire, en moyenne tous les 2 à 4 cadres pour diminuer le bruit de fond pour une meilleure qualité des images. Utilisez un intervalle de 1 sec.
  4. Recherche pour faire adhérer les cellules qui expriment une forte PKD1-GFP dans la vue du canal GFP et DIC (contraste d'interférence différentiel). les cellules adhérentes sont morphologiquement plat et ne se déplacent pas rapidement.
  5. Après avoir identifié les cellules HL60 adhèrent fortement que expriment la GFP-PKD1, d' optimiser les conditions d'acquisition en diminuant la puissance du laser , tout en augmentant le gain du détecteur pour chaque canal pour diminuer le photoblanchiment pour l' imagerie à long terme (figure 3A).
  6. Prenez 100 pi de fMLP / Alexa 594 solution avec une pipette ul 200 et mettre de côté. Sélectionnez l'option "acquisition time-lapse" et définir les intervalles de2 s et le nombre d'images à acquérir pour cent.
    REMARQUE: les intervalles et le nombre d'images à acquérir dépendent des fins d'expérimentation. 1-2 intervalles sec et 100 cadres sont souvent utilisés pour des expériences d'imagerie, comme dans la figure 3. Pour migrer lentement les cellules, des intervalles plus longs sont nécessaires pour l' imagerie à long terme. En revanche, pour la migration rapide des cellules, des intervalles plus courts sont nécessaires pour observer les détails continus de la migration cellulaire.
  7. prendre avec précaution le couvercle d'une chambre 4 puits de telle sorte que la position de la chambre ne change pas. Lancer acquisition immédiatement et acquérir 3-5 images des cellules non stimulées tout en positionnant la pipette 200 pi directement sur les cellules en utilisant la tache de lumière laser comme guide.
  8. Pipette le 594 mélange fMLP / Alexa sur les cellules étant imagée avec un rapide et même débit et terminer le jeu complet d'acquisition time-lapse. Nom et enregistrer les données qui seront soumis à une analyse plus approfondie des données.

6. Cellules Imaging Chemotaxing dans Stimuli de Chemo-attractant visibles et contrôlables

  1. L'utilisation d'un 10 micropipetteur et d'injection des conseils pi, remblayer une micropipette avec 30 ul fraîchement mélange de fMLP et Alexa594 préparés.
  2. Attacher la micropipette à un support de micro-pipette monté sur une platine de microscope, et raccorder le tuyau à l'unité d'alimentation en pression, un appareil qui fournit une pression constante pour libérer la solution fMLP / Alexa594 de la micropipette pour produire un gradient constant.
  3. Allumez l'alimentation en pression et régler la pression de compensation (Pc) à 70 hPa.
  4. Monter une lamelle 1 puits chambré ensemencées avec des cellules HL60 exprimant PKD1-GFP sur une lentille d'huile 40X sur un microscope confocal ou son microscope à fluorescence équivalent.
  5. Réglez l'acquisition en mode canal dans la configuration suivante: canal vert (500-530 nm) pour PKD1 GFP-tagged; canal rouge (580-620 nm) pour chimiotactique fMLP (Alexa594); et transMitted canal de lumière pour identifier les cellules HL60 adhèrent.
  6. Lancer acquisition "live" et d'optimiser les conditions d'acquisition pour les trois canaux: ajuster les intensités de chaque canal pour l'analyse quantitative des données d'imagerie; affiner entre l'intensité et la puissance du laser pour les trois canaux pour obtenir des images avec la meilleure qualité et de minimiser la photo-blanchiment. Si nécessaire, en moyenne tous les 2 à 4 cadres pour une meilleure qualité d'image. Nous utilisons habituellement un intervalle de 1 sec.
  7. Lancer acquisition "live" et la recherche de l'adhésion des cellules qui expriment une forte PKD1-GFP dans la vue de la GFP et les canaux de lumière transmise. En utilisant l' optique champ clair, centre du micropipette dans le domaine du centre de vue (figure 4A) afin de visualiser le gradient fMLP et les cellules HL60 adhérentes exprimant PKD1-GFP.
  8. Sélectionnez acquisition time-lapse et définir les intervalles à 2 seconde d'intervalle et le nombre d'images à acquérir 100.
    NOTE: Après la collecte de chaque tsérie ime-lapse, le nom et enregistrer les données qui seront soumis à une analyse plus approfondie des données.

Résultats

imagerie simultanée de la chimiotaxie des cellules HL60 multiples en utilisant la mobilité cellulaire dispositif d'analyse

Basé sur le principe de la microfluidique 16, le fabricant fournit des profils simulés de gradients: un gradient est produit en 1 min, stabilisée à moins de 5 min et maintenue pendant 2 heures. Les profils très prévisibles des gradients stables générés par microfluidiques permettent plusieurs dosages de chimiotaxie à effectuer simultanément. Dans la présente étude, nous avons observé trois essais de chimiotaxie simultanées (Figure 2A et film 1). Nous avons constaté que les cellules HL60 ont commencé chemotaxing immédiatement après la chimiotactique a été injecté dans le puits du chimiotactique, et gardé chemotaxing dans un chemin droit pour les 60 min suivantes, en accord avec les résultats de simulation pour la stabilité gradient. Tracer le chemin de Voyage et de la morphologiedes cellules permet des mesures quantitatives et la comparaison ultérieure des comportements de chimiotaxie en utilisant un indice de chimiotactisme qui inclut la longueur totale du trajet, la vitesse, la directionnalité et de circularité des cellules (figure 2B). La longueur totale du trajet correspond à la somme des longueurs des segments de droite reliant les centres de gravité de la trajectoire. La vitesse est obtenue en divisant la longueur totale du trajet du temps. Directionnalité est mesurée vers le haut et est définie comme suit: (coordonnée Y de fin de trajet moins coordonnée Y du début) divisée par la longueur totale du trajet. Cela donne 1,0 pour un objet se déplaçant directement vers le haut. La rondeur de la cellule est une mesure (en pour cent) de la façon dont efficacement zone une quantité donnée de périmètre entoure. Un cercle a la plus grande superficie pour tout périmètre donné et a un paramètre rotondité de 100%. Une ligne droite renferme aucune zone et a un paramètre rotondité de 0%. Nous démontrons le comportement de la chimiotaxie quantitativement mesurée comme décrit par les paramètres sélectionnés chimiotaxie(Figure 2C).

Surveillance PKD localisation subcellulaire dans les cellules HL60 sous un stimulus fMLP spatiotemporellement visibles et contrôlables

Il est un grand progrès technique marqué et appliquent une stimulation par fluorescence chimiotactique commandable pour un système expérimental. Historiquement, nous avons appliqué soit homogène (appelé aussi uniforme) la stimulation ou la stimulation gradient d'observer la réponse et les comportements cellule. Toutefois, la stimulation «aveugle» fournit non seulement aucune information spatio-temporelle sur la façon dont le stimulus atteint les cellules, mais met aussi en doute les observations «anormales» de la réponse cellulaire à la stimulation, tout simplement parce que nous ne voyons pas le stimulus. Nous avons précédemment montré que le colorant fluorescent (Alexa594) peut être appliqué avec chimiotactique pour établir une relation linéaire entre la concentration chimiotactique et monitored intensité de colorant fluorescent 15. Avec une configuration d'acquisition de la protéine fluorescente verte (GFP), une émission rouge de colorant fluorescent (Alexa594), et la lumière transmise, nous sommes en mesure de surveiller les cellules adhérentes, l'application du stimulus, et la réponse cellulaire au stimulus (Figure 3A). La protéine kinase D est une famille de sérine / thréonine kinases , qui jouent un rôle essentiel dans la migration cellulaire dirigée 9,17. En réponse à la uniformément appliquée fMLP (rouge) la stimulation, les cellules HL60 la médiation d' une translocation membranaire solide de GFP-étiquetée protéine kinase D1 (vert) (Figure 3B et film 2). Dans un gradient de fMLP (rouge) (figure 4A), les cellules HL60 recrutent activement PKD1 au bord d' attaque (figure 4B et du film 3). Une comparaison étroite de la localisation subcellulaire de la GFP dans la saillie du bord d'attaque indique que PKD1 localise à l'arrière du bord d'attaque (La figure 4C).

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Figure 1. Cellule mobilité dispositif d'analyse permet jusqu'à 6 essais de chimiotaxie simultanés. (A) , le schéma montre la conception d'une puce de dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire pour la surveillance simultanée de 6 essais de chimiotaxie indépendants. expositions rouges chimioattractant ajoutés aux puits. (B) L' introduction de cellules HL60 aux puits de cellules tandis que le chimiotactique diffuse pour établir un gradient fMLP stable. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. La surveillance simultanée de plusieurs essais de chimiotaxie avec des cellules HL60. (A ) Montage montre des images de la mobilité cellulaire essai de chimiotaxie de dispositif d'analyse pour examiner les effets inhibiteurs des inhibiteurs spécifiques de la PKD sur la chimiotaxie à des moments de 0 et 12 minutes après l'application de gradient. cellules chimiotactique HL60 ont été pré-traitées avec un inhibiteur de PKD 1 uM CID755673 pendant 30 min. les cellules HL60 avec ou sans le traitement de l'inhibiteur de PKD ont été autorisés à chemotax soit en milieu RPMI1640 de faim ou 100 nM de fMLP gradients de 12 min. (B) Schéma montre la longueur du trajet de Voyage et de la morphologie des cellules HL60 tracées. (C) Quantification de la chimiotaxie que la longueur totale du trajet, la vitesse, la directivité et la rondeur. Moyenne ± écart-type est représenté; n = 10, 12, ou 11 sans gradient, fMLP gradient sans traitement CID755673, et le traitement fMLP avec traitement CID755673, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. GPCR-médiée robuste translocation membranaire de PKD1 en réponse à des stimuli fMLP uniformément appliqués. (A) suivi Multichannel de PKD1-GFP (vert), chimiotactique (1 uM fMLP mélangé avec 0,1 pg / ml colorant fluorescent Alexa 594, rouge) et DIC (contraste d'interférence différentiel) afin d'identifier les cellules HL60 adhèrent dans un puits d'une chambre de 4well revêtu de gélatine à 0,2% dans du milieu RPMI 1640. Barre d'échelle = 10 pm. (B) Montage montre que fMLP appliquée uniformément (rouge) induit robuste translocation membranaire de PKD1-GFP (vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. Le bord d' attaque localisation de PKD1 dans chemotaxing cellules HL60. configuration d'acquisition de mode (A) Canal facilite la visualisation du gradient fMLP et la dynamique spatiotemporelle des PKD1. Dans A - C, les cellules HL60 transitoirement exprimé PKD1 GFP-tagged; pour visualiser le gradient fMLP généré à partir d' une micropipette (DIC), 100 nM de fMLP (rouge) ont été mélangés avec 0,1 pg / ml de colorant fluorescent Alexa 594. (B) , la localisation Enrichi de PKD1 au bord d' attaque de la cellule de chemotaxing. Barre d'échelle = 10 pm. (C) images fusionnées montrent que PKD1 localise à l'arrière du bord d' attaque dans les cellules HL60. Vert montre PKD1 localisation cellulaire, et l'image DIC montre la zone en saillie du bord d'attaque. Barre d' échelle = 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Dans la présente étude, nous montrons deux exemples de dosages de chimiotaxie: tout d'abord, la surveillance simultanée de plusieurs essais de chimiotaxie par le dispositif d'analyse de la mobilité de la cellule; et, deuxièmement, la visualisation du gradient chimiotactique et la dynamique spatio-temporelle des événements dans les mêmes cellules en temps réel de signalisation.

la mobilité cellulaire dispositif d'analyse pour de multiples essais de chimiotaxie simultanés

Dans la présente étude, nous avons introduit un protocole détaillé pour effectuer plusieurs essais de chimiotaxie simultanée en utilisant un dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire. Ce dispositif permet à l'utilisateur d'observer le comportement de la chimiotaxie cellulaire avec un objectif 10X dans l'observation champ lumineux conventionnel. En raison des caractéristiques de diffusion dominante de l'écoulement de fluide, le dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire génère des gradients très stables et prévisibles et permet jusqu'à six chimiotaxie des essais à effectuer en même temps. Les étapes critiques du protocole sontpour obtenir des gradients fiables et d'aligner les cellules sur la ligne de terrasse. L'utilisateur doit suivre strictement les instructions du fabricant pour l'ensemble de support et de l'injection de chemoattractants et des cellules. Des instructions détaillées sont également disponibles en ligne. Par rapport aux méthodes alternatives de chimiotaxie 11-13,15, ce dispositif améliore considérablement la fiabilité et l' efficacité des essais de chimiotaxie. Quatre tailles de puce de dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire dans des tailles de 4, 5, 6 et 8 um sont disponibles pour accueillir différents types et tailles de cellules. Nous avons constaté qu'une mobilité cellulaire puce de dispositif d'analyse 4 ou 5 um convient pour la HL60 et D. cellules discoideum, qui sont environ 10-15 um de diamètre. Cependant, une limitation est que ce dispositif ne convient pas à tous les types de cellules. Nous avons eu peu de succès en utilisant la mobilité cellulaire dispositif d'analyse chimiotaxie test avec des cellules Raw267.4. La raison peut être que les cellules migrent Raw267.4 trop lentement. Le temps nécessaire pour l'efficacité chemotaxis des cellules Raw267.4 pourrait être beaucoup plus longue que le temps d'un gradient est maintenu par le dispositif. Au lieu de cela, un test de migration Transwell a bien fonctionné pour les cellules Raw267.4 9. Une autre limitation est que l'observation fluorescente est pas possible avec le dispositif actuel. Une orientation future consiste à surveiller l'imagerie de fluorescence avec un grossissement plus élevé. Ceci est possible avec le dispositif perfectionné d'analyse de la mobilité cellulaire, qui est équipé d'une détection fluorescente et un objectif 100X. En outre, le nombre de dosages simultanés est également augmenté à 12. Toutes ces améliorations facilitent le débit amélioré des essais de chimiotaxie et l'observation de la dynamique sous-cellulaires dans des cellules en migration.

Haute efficacité de transfection de cellules HL60 pour exprimer la protéine de protéine marqué fluorescent

les cellules HL60 sont une lignée de cellules de leucémie divisant activement et se développent en suspension. Comme indiqué précédemment 18-20, les cellules HL60 sont résistantes à gtransfert ène. Les deux lipides et le transfert de gènes d'électroporation ont été testés, et une plus grande efficacité de transfection a été obtenu avec l'électroporation, comme décrit en détail dans la section 4. Obtenir une viabilité élevée après l'électroporation est essentielle pour obtenir une grande efficacité de transfection en raison des dommages graves qui résulte de l'électroporation. Par la suite, la manipulation minutieuse et douce cellule sont nécessaires, en particulier après l'électroporation. Tous les médias doivent être préchauffée et doucement ajouté aux cellules dans toutes les étapes après l'électroporation. Il est également important de réduire au minimum le temps d'exposition des cellules au réactif électroporation. Afin d'éviter la mort des cellules après l'électroporation, le milieu RPMI 1640 de récupération de l'électroporation doit être ajouté aux cellules immédiatement. Nous avons constaté que 20% de FBS dans le milieu de récupération donne un taux de récupération des cellules beaucoup plus élevée que 10% de FBS. Après l'électroporation, l'incubation dans du RPMI 1640 électroporation milieu de récupération pendant 30 min est essentielle pour une plus grande viabilité et transfectionEfficacité. Pour augmenter encore l'efficacité de transfection, on a également utilisé 4 pg d'ADN de plasmide par transfection, ce qui est presque le double de la quantité de plasmide recommandé par le fabricant.

Il existe deux grandes limitations sur électroporation transfection: l'transiency de l'expression de la protéine et la limite du nombre de cellules (2 x 10 6 cellules par transfection). Dans les cellules non différenciées, l'expression est détectable uniquement pendant les deux premières divisions cellulaires, étant donné que le plasmide vecteur est dilué par moitié après chaque division cellulaire. Pour La HL60 différenciées des cellules survivent pas plus de 48 heures. Par conséquent, toute expérience exige des transfections fraîches 6 heures avant l'expérience. Le nombre de cellules pour une électroporation répond simplement à l'exigence minimale pour tous les dosages biochimiques. Aux fins de l'utilisation répétitive ou grande quantité, il est fortement recommandé qu'une lignée de cellules HL60 indifférenciée établie qui exprime de manière stable la protéine d'intérêt which a été marqué avec une protéine fluorescente par un vecteur viral, dans le cas d'un vecteur viral est disponible ou peut être construite.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent pour ce travail.

Remerciements

Ce travail est soutenu par le fonds intra-muros du NIAID, NIH.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RPMI 1640 Medium GlutaMAXLife technologies61870-036
Pyruvate de sodiumThermo Fisher Scietific11360-070
Sérum fœtal bovinGemini Bio-Products100-106
1 M HEPES solution stérile, pH 7,3Quality Biological Inc.A611-J848-06
Pénicilline streptomycine solutionFisher Scientific15140122
NucleofectorTM 2bLonzaAAB-1001
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V comprenant la solution NucleofectorTM, pipettes à usage unique, certifié AmaxaTM 100 ml aluminium cuvettes d’électrodesLonzaVCA-1003
Lab-Tek chambré #1.0 Borosilicate CoverglassNalge Nunc International Inc155383
solution de gélatine à 2 %Sigma-AldrichG1393
FibronectinSigma-AldrichF1141
HBSS (Hanks' Solution saline équilibrée)Life technologies14025-076
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA3803
Enceintes de recouvrement Lab-Tek II à un puitsNalge Nunc International Inc155361
Chambres de verre de protection Lab-Tek II à quatre puitsNalge Nunc International Inc155383
Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-10438
fMLPSigma -AldrichF3506-5MG
Épaisseur du verre de couverture (2) 22 mm x 22 mmCorning2855-22
EZ-TAXIScanEffector Cell Institute, Inc.MIC-1001
EZ-TAXICrope scannée (5 mm)Effector Cell Institute, Inc.EZT-F01-5
1701RN 10 &mu ; l seringueHamilton80030
Femtotips II Embouts d’injectionEppendorf5242956003
Femtotips IIEppendorf930000043
TransferMan NK2, y compris module moteur, tête en X avec réglage d’angle et aides au positionnement.  ;Eppendorf5188900056
DIAS softwareSolltech Inc.
LSM 780 META ou microscope confocal équivalent avec un objectif à huile DIC Plan-Neofluar 40X 1.3 NA ou 60X 1.4 NA

Références

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