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Article de méthode

La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation

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DOI :

10.3791/54525

⸱

13 octobre 2016

 , 
1Centre National de la Recherche Scientifique (UMR 8119), Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes

Dans cet article

Résumé

Nous montrons comment préparer des tranches obliques de la moelle épinière chez les jeunes souris. Cette préparation permet la stimulation des racines ventrales.

Résumé

enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches de la moelle épinière se sont révélés être une technique précieuse pour enquêter sur un large éventail de questions, de cellulaire aux propriétés du réseau. Nous montrons comment préparer des tranches obliques viables de la moelle épinière des souris jeunes (P2 - P11). Dans cette préparation, les motoneurones conservent leurs axones sortant des racines ventrales de la moelle épinière. La stimulation de ces axones suscite back-propageant des potentiels d'action qui envahissent le soma des motoneurones et passionnants nantissements l'motoneuronales au sein de la moelle épinière. Enregistrement des potentiels d'action antidromiques est une façon immédiate, définitive et élégante pour caractériser l'identité du motoneurone, qui surpasse les autres méthodes d'identification. En outre, la stimulation des nantissements de motoneurones est un moyen simple et fiable pour exciter les cibles collatérales des motoneurones au sein de la moelle épinière, comme d'autres motoneurones ou Renshaw cellules. Dans ce protocole, nous présentons les enregistrements antidromiques du motoneurone somas ainsi que Renshaw cellulaire excitation, résultant de la stimulation de la racine ventrale.

Introduction

Historiquement, les enregistrements de motoneurones utilisant sharp-électrode ont été réalisées in vivo sur les grands animaux tels que les chats ou rats 1 ou sur un ensemble de la moelle épinière isolée chez la souris 2. L'émergence de la technique d'enregistrement patch-clamp pendant les années 1980, a appelé à un accès direct à la motoneurone somas que l'étanchéité nécessaire pour être réalisé sous guidage visuel. Ainsi, la moelle épinière préparation de tranche a été facilement atteint depuis le début des années 1990 3. Cependant, au début de la préparation tranche souvent ne permettait pas la stimulation des racines ventrales. Au meilleur de notre connaissance, seules deux études ont rapporté une stimulation réussie des racines ventrales en tranches transversales, et aucun n'a été obtenu à partir de souris 4,5.

Dans cet article, nous présentons une technique pour obtenir des tranches viables de la moelle épinière de souris néonatale (P2 - P11) dans lequel le pool de motoneurones conserve ses racines au départ ventrales axones. conduitla stimulation de la racine ral déclenche potentiel d'action antidromique de nouveau dans les somas de la piscine du motoneurone sortant de la même racine ventrale. Il excite aussi les cibles collatérales du motoneurone, d' autres motoneurones 6-10 et les cellules de Renshaw 11-13. Étant donné que seuls les motoneurones envoient leurs axones vers le bas les racines ventrales, nous utilisons l'enregistrement des potentiels d'action antidromiques comme un moyen simple et définitive à physiologicaly identifier motoneurones 10.

En plus d'utiliser des critères électrophysiologiques et morphologiques potentiellement non inclusives ou trompeuses pour confirmer l'identité des motoneurones, des études récentes sur les motoneurones de la moelle épinière invoquaient également fastidieuse et chronophage post hoc Colorations 16. Une telle identification est habituellement effectuée uniquement sur un échantillon des cellules enregistrées. D'autres stratégies d'identification reposent sur des lignées de souris dans lequel les motoneurones expriment une fluorescence endogène 17-19. Cependant, en utilisant des marqueurs codés génétiquement peut être difficile à un jeune âge où l'expression du marqueur est encore variable ou si l'étude exige déjà en utilisant une lignée de souris transgéniques. En variante, l'action antidromique enregistrements éventuels peuvent être effectués en routine sur toutes les souris à partir du début de l'enregistrement de la cellule. Expérimentateurs travaillant sur intactes les préparations de la moelle épinière chez le chat, le rat et la souris, ont utilisé de manière fiable ces techniques d'identification depuis les années 1950, 1,2,20,21. Dans des conditions optimales, nous avons pu obtenir des potentiels d'action antidromiques de la quasi-totalité des motoneurones enregistrées.

En outre, la stimulation de la racine ventrale peut être utilisé de manière fiable pour exciter les autres motoneurones 22,23 ou leurs cibles. les cellules de Renshaw 10,24,25. Nous présentons ici les applications de la stimulation de la racine ventrale sous la forme d'actions antidromique enregistrements potentiels de motoneurone somas, ainsi que l'excitation des cellules de Renshaw.

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Protocole

Les expériences ont été réalisées conformément aux directives européennes (86/609 / CEE et 2010-63-UE) et de la législation française, et ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université Paris Descartes.

1. Préparation de la moelle épinière Slice

  1. Préparer les solutions quotidiennes ou suivantes un jour à l'avance. Si elles sont conservées pendant une nuit, bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 et de garder au réfrigérateur dans des flacons fermés hermétiquement.
    1. Préparer faible Na + liquide artificiel céphalorachidien (ACSF): 3 mM de KCl, 1 mM de NaH 2 PO 4, 230 mM de saccharose, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM de CaCl2, 8 mM de MgCl2, 25 mM de glucose, l' acide ascorbique 0,4 mM, 1 mM de Na-kynurénate, 2 mM de pyruvate. Bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,4). Depuis Na-kynurénate est souvent difficile à dissoudre, assurez-vous d'acheter celui indiqué dans le tableau des matériaux.
    2. Préparer solu K-gluconatetion: 130 mM de K-gluconate, 15 mM de KCl, 0,05 mM d' EGTA, 20 mM de HEPES, 25 mM de glucose, 1 mM de Na-kynurénate, 2 mM de Na-pyruvate, ajusté à pH 7,4 avec du KOH.
    3. Préparer ACSF: 130 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM de NaH 2 PO 4 26 mM NaHCO3, 25 mM de glucose, 0,4 mM d' acide ascorbique, 2 mM de pyruvate. Bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,4).
    4. Avant le début de la dissection, dissoudre 2% d'agar dans 80 ml de la solution K-gluconate, et garder au chaud à 60 ° C.
  2. intracardiaque perfusion
    1. Effectuer cette préparation sur des souris femelles et mâles, âgés de P2 à P11.
    2. Anesthésier la souris avec une injection intraperitoneale de 0,1 ml de 25 mM de pentobarbital sodique (50 mg / kg).
    3. L'utilisation d'aiguilles ou de bande, immobiliser la souris sur le dos sur une grande boîte de Pétri remplie de silicium. Utilisez un Microscope disséquante pour le reste de la dissection.
    4. Tenir la pointe du sternum, soulever la poitrine et couper la membrane à l'aide de ciseaux fins. Ouvrez ensuite la poitrine des deux côtés en coupant à travers les côtes pour exposer le cœur.
    5. Couper l'oreillette droite avant de percer le ventricule gauche avec une aiguille de 27G.
    6. Perfuser avec de la glace froide faible ACSF Na +. Au bout de 30 secondes, le plus bas de Na + ACSF doit être considéré circulant hors de l'atrium. De faibles quantités de sodium empêchent les cellules à partir de dopage et à réduire la mort cellulaire lors de la dissection.
    7. Maintenez l'aiguille dans le cœur sous le microscope de dissection jusqu'à ce que le foie devient jaune lorsque le sang est drainé.
  3. Spinal dissection du cordon
    1. Décapitez l'animal et le mettre sur le ventre.
    2. Retirez rapidement la peau du dos (figure 1A1). Faites deux coupes à travers les épaules et en descendant la cage thoracique (figure 1A2). Ensuite, couper le cordon en loe que possible dans la partie caudale afin d'isoler la colonne vertébrale avec le début des nervures de la partie inférieure de l'animal. Retournez l'animal à nouveau et retirer les viscères encore attachés aux côtes.
    3. Transférer la colonne vertébrale à un autre, plus petite boîte de Pétri silicium-rempli et utiliser 4 broches d' insectes pour le maintenir dorsale vers le haut (figure 1A).
    4. Perfuser en continu l'animal avec l' ACSF carbogène-barboter (à environ 4 ° C) tout en effectuant une laminectomie de la face dorsale, et l' exposition de la moelle épinière de l'extrémité rostrale (figure 1B). Pour ce faire, insérez la pointe des ciseaux fins entre l'os et la moelle épinière et couper l'os peu à peu de la fin rostrale, en veillant à rester à l'écart de la matière blanche. Alternate de chaque côté tout en utilisant des pinces pour tenir à l' écart de la bande de l' os déjà coupé (Figure 1B1).
    5. En utilisant les plus petits ciseaux et des pinces à ressort disponibles, soulevez la dure et coupesur les deux côtés tout en maintenant la partie non serrée de la dure-mère, afin d'éviter d'endommager la moelle épinière avec des ciseaux. Couper le long de l'axe rostro-caudale.
      NOTE: La dure est une membrane continue semi transparent; à cet âge la pie - mère est trop fragile et se désagréger lors de la dissection et le tranchage (Figure 1B2).
    6. Une fois que la dure est l'utilisation enlevé un verre contondant ou embout en plastique pour pousser doucement le cordon sur le côté gauche de la gorge formée par la colonne vertébrale demi-coupe, et couper les racines ventrales et dorsales sur le côté droit, en partant du côté rostral , le plus éloigné où ils entrent dans le cordon (quelques mm au moins, Figure 1B2).
    7. Répéter l'opération sur le côté gauche, allant toujours de rostrale à caudale. Si gaucher, démarrer à partir du côté gauche, puis déplacer vers le côté droit.
  4. Incorporation dans la gélose
    1. Glissez le cordon de la colonne vertébrale. Utilisez une épingle d'insectes plus petits à cernerle cordon avec la dorsale de surface et enlever délicatement toute pièce de membrane encore attaché à elle (Figure 1C1).
    2. Une fois nettoyé, coupez les deux extrémités (figure 1C2). Insérez une épingle d' insectes cintré dans la partie antérieure du cordon pour manipuler le cordon et notez son orientation (flèche dans la figure 1C2). Puis transférer la moelle épinière à une solution K-gluconate glacée.
      NOTE: Cette solution imite la composition intracellulaire du CSF et empêcher les cellules de mourir de choc osmotique une fois que les motoneurones seront coupés 26.
    3. Une fois que la moelle épinière est dans la solution intra-cellulaire, prenez le bécher avec l'agar du bain sec et refroidir sur un mélange de glace et d'eau.
    4. Gardez en remuant tout en mesurant la température. Lorsque la température atteint 38 ° C plonger la moelle épinière, en le tenant par la broche d'insectes et le placer côté rostral vers le bas. Assurez-vous que la moelle épinière est comme straight que possible, loin des murs, partie caudale légèrement vers le haut (Figure 1D1).
    5. Laisser le bécher dans le mélange de glace et de l'eau pour permettre à l'agar se solidifier le plus rapidement possible. Assurez - vous qu'il reste en place et que le cordon est aussi droite que possible (Figure 1D1).
  5. Slicing
    1. Après solidification, découper le bloc d' agar contenant de la moelle épinière , d'une manière telle que la base du bloc est à un angle de 35 ° avec la partie lombaire du cordon (flèche sur la figure 1D2). La surface dorsale doit être orientée de la base (Figure 1D2).
      NOTE: Ceci est une étape critique dans la procédure, pour le maintien de la continuité des pools de motoneurones aux racines ventrales à partir de laquelle ils sortent.
    2. Coller le bloc dans la chambre du vibratome en utilisant de la colle cyanoacrylate. Immergez en solution K-gluconate et ajouter la solution K-gluconate congelée en bouillie pour maintenirle bain refroidi (en dessous de 2 ° C).
    3. Couper 350 - 400 um d'épaisseur des tranches de la région lombaire (identifiable par sa courbure et plus grand diamètre). Dans sa bonne orientation (voir 1.4.1.), Utilisez la lame pour couper de la dorsale à la surface ventrale et faire des tranches en continu plus rostrale. En règle générale, il y a 4-5 tranches convenables avec des racines ventrales étendant de 2 mm ou plus. Utiliser les paramètres suivants: angle de 10 °, 70 Hz, la fréquence de vibration et de 10 mm / min Vitesse de découpe.
  6. Incubation
    1. Transférer les tranches à ACSF à 34 ° C. Au bout d'environ 30 minutes, refroidir les tranches jusqu'à la température ambiante et commencer la session d'enregistrement.

figure-protocol-1
Figure 1. Dissection
A1:. L' élimination de la peau du dos pour exposer la colonne dorsale A2:Coupe des épaules et des côtes pour libérer la dorsale colonne B1:. Colonne vertébrale épinglé sur la boîte de Pétri silicium-rempli (côté dorsal haut, côté caudal gauche) B2:. Même avec la moelle épinière exposée et disséqués C1:. Moelle épinière isolée . (côté gauche rostrale) C2: moelle épinière prêt à être embarqué (face ventrale, latérale rostrale gauche). Notez la broche d'insecte plus petit sur le côté rostrale D1:.. La moelle épinière dans le bécher de gélose (côté rostrale dow, face ventrale tournée vers le bas) D2: Couper le bloc de gélose avec la moelle épinière incorporée. Notez l'angle de 35 ° les formes de la moelle épinière à la base du bloc et le renflement lombaire (flèche). Barres d'échelle 1 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Placer le Slice dans la Chambre

NOTE: Ventral racines sont de taille variable.

  1. Préparer une boîte de diverses pipettes avec des diamètres de pointe allant de 40 à 170 pm à l'avance. Pour préparer les pipettes d'aspiration, préparer de nombreux pipettes avec un long cône. L'utilisation d'un couteau de diamant, faire une coupe à différentes positions. Puis, sous un microscope à dissection, briser en frappant la pointe avec des pincettes.
  2. Retirer la chambre du microscope d'enregistrement et de le placer sous un microscope à dissection.
  3. Sélectionner une tranche contenant une racine ventrale d'une longueur suffisante de 2 mm (ou plus) pour être monté sur une électrode de stimulation d'aspiration. Sélectionnez la bonne orientation de la tranche avec les racines ventrales vers le haut (figure 2A) et couper délicatement l'agar autour des racines ventrales tout en laissant le reste de l'agar autour de la tranche (figure 2B).
    NOTE: Parce que l'agar-agar est plus ferme que la tranche, cela va permettre aux fils de l'ancre de la tranche de se reposer sur l'agar plutôt que sur la tranche et donc unnchor ne sera pas endommager le tissu. Assurez - vous que les fils de l'ancre de la tranche sont au- dessus de la piscine du motoneurone (en rouge sur la figure 2C).
  4. Monter la chambre arrière sur le microscope et perfuser en continu la chambre d'enregistrement avec ACSF à un taux de 1 - 2 ml / min, à la température ambiante. En utilisant une pipette en verre rempli d'ACSF et relié à une seringue, une aspiration de la racine ventrale (flèche sur la figure 2C). Afin d'obtenir une bonne stimulation de la racine ventrale, la pointe de la pipette doit être serré autour de la racine ventrale. Un pôle doit être de l'électrode de stimulation et l'autre dans le bain (ou relié à la plaque d'électrode de référence de serrage).
  5. Réaliser l' enregistrement patch-clamp du type cellulaire souhaité et enregistrer l'effet de la stimulation de la racine ventrale comme décrit previsouly 10.
    1. Ici, utiliser un amplificateur pour l'acquisition de données. Filtrez les enregistrements de cellules entières à 3 kHz. Numérisez à 10 kHz. Compenser résistance pont currele mode NT-pince.

figure-protocol-2
Figure 2. ventral Racine Préparation
R: Lumbar tranche de la moelle épinière noyée dans de la gélose à la racine ventrale vers le haut B. Lumbar tranche de la moelle épinière avec les racines ventrales libérés de l'agar - agar . C: Lumbar tranche de la moelle épinière avec une électrode de stimulation ajusté serré autour des racines ventrales (flèche) . Notez l'emplacement des cellules de Renshaw exprimant la fluorescence rouge dans le 28 chrna2-Cre souris croisé avec le journaliste de la souris R26 Tom 17. Les barres d'échelle 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Résultats

Confirmation de motoneurones Identité utilisant Potentiels antidromique action

ciblage cellulaire

Motoneurones se trouvent dans la corne ventrale (visible en rouge sur la figure 2C). Commencez par le faisceau d'axones formant la racine ventrale et remonter jusqu'à ce que le faisceau se disperse complètement et...

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Discussion

tranchage Oblique de la moelle épinière est importante car elle permet une stimulation unilatérale des pools de motoneurones et les cellules de Renshaw à un segment vertébral unique d'une manière fiable, complète et spécifique. En outre, il permet une identification rapide, élégant et non-ambiguë des motoneurones enregistrées. Ensuite, nous allons mettre en évidence les avantages de cette technique par rapport à d'autres méthodes de préparation de tranche, puis nous allons insister sur les pièges les plus couran...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Marin Manuel et Olivia Goldman-Szwajkajzer pour leur aide dans la prise des photos. Les auteurs remercient également Arjun Masukar et Tobias Bock pour la relecture du manuscrit. supports financiers ont été fournis par l'Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-01), le NIH-NINDS (R01NS077863), la Fondation Thierry Latran (OHEX Project), l'association française de myopathie ( numéro de subvention 16026) et Target ALS sont appréciés. Felix Leroy était le destinataire d'un "Contrat doctoral" de l'Ecole Normale Supérieure, Cachan.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Na-kynurenateABCAMab120256dissout mieux que les autres marques
KClSigmaP3911
NaH2PO4SigmaP5655
saccharose  ;SigmaS9378
NaHCO3  ;SigmaS6014
CaCl2  ;G BiosciencesR040
MgCl2  ;Qualité Biologique351-033-721
glucose  ;SigmaG5767
acide ascorbique  ;SigmaA5960
Na-pyruvate  ;SigmaP2250
K-gluconate  ;SigmaP1847
EGTA  ;SigmaE3889
HEPES  ;SigmaH4034
NaClSigmaS9888
AgarSigmaA9799
QX-314AlomoneQ150
Mg-ATPSigmaA9187
CsOHSigma232041
Na-GTPSigma51120
acide gluconiqueSigmaG1951
Solution d’hydroxyde de césiumSigma232041
KOHSigmaP5958
Ciseaux à ressort Vannas - 2.5mm  ;FST15000-08à utiliser uniquement pour couper la dure-mère, peut être endommagé si vous coupez les os
StimulateurA-M SystemsStimulateur à impulsions isolées Modèle 2100
VibratomeCampden VibrantMicrotome 7000 - Modèle 7000smz-2
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Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation
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