Article de méthode

Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs, Ceratitis capitata

DOI :

10.3791/54528

⸱

1 octobre 2016

 , 
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Dans cet article

Résumé

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La mouche méditerranéenne des fruits (medfly) Ceratitis capitata (Diptera : Tephritidae) est un ravageur mondial de l’agriculture. Une meilleure compréhension de sa biologie est essentielle pour contrôler les populations de mouches et ainsi réduire l’impact économique. La micro-injection embryonnaire est un outil fondamental permettant à la fois la transformation de la lignée germinale et l’étude de la génétique inverse chez cette espèce.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mouche méditerranéenne des fruits (mouche méditerranéenne) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) est une espèce nuisible avec pertinence agricole extrêmement élevé. Cela est dû à son comportement de reproduction: les femelles endommagent la surface externe des fruits et légumes quand ils pondent des œufs et les larves se nourrissent hachurée sur leur pulpe. Sauvage C. populations capitata sont traditionnellement contrôlés par pulvérisation d' insecticides et / ou des approches écologiques, le plus de succès étant la technique de l' insecte stérile (TIS). Le SIT repose sur l'élevage en masse, la stérilisation à base de rayonnement et la dissémination des hommes qui conservent leur capacité à accoupler, mais ne sont pas en mesure de générer une descendance fertile. L'avènement et le développement rapide subséquente des outils biotechnologiques, ainsi que la disponibilité de la séquence du génome de la mouche méditerranéenne, a considérablement renforcé notre compréhension de la biologie de cette espèce. Cela favorisait la prolifération de nouvelles stratégies pour la manipulation du génome, qui can être appliquée au contrôle de la population.

Dans ce contexte, l'embryon microinjection joue un double rôle dans l'expansion de la boîte à outils pour le contrôle de la mouche méditerranéenne. La capacité à interférer avec la fonction des gènes qui régulent les processus biologiques clés, en effet, élargit notre compréhension du mécanisme moléculaire sous-jacente invasivité mouche méditerranéenne. En outre, la capacité de réaliser la transformation de la lignée germinale facilite la production de multiples souches transgéniques qui peuvent être testées pour les futures applications sur le terrain dans de nouveaux paramètres de SIT. En effet, la manipulation génétique peut être utilisé pour conférer des traits désirables qui peuvent, par exemple, être utilisés pour surveiller la performance des mâles stériles dans le domaine, ou qui peut entraîner au début de la létalité de stades de vie. Nous décrivons ici une méthode pour micro-injection des acides nucléiques dans des embryons de mouches méditerranéennes pour atteindre ces deux objectifs principaux.

Introduction

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La mouche méditerranéenne des fruits (mouche méditerranéenne) Ceratitis capitata est une espèce cosmopolite que intensivement dommages fruits et plantes cultivées. Il appartient à la famille des Tephritidae, qui comprend plusieurs espèces de parasites, tels que ceux appartenant aux genres Bactrocera et Anastrepha. La mouche méditerranéenne est l'espèce la plus étudiée de cette famille, et il est devenu un modèle non seulement pour l'étude des invasions d' insectes 1, mais aussi pour l' optimisation des stratégies de lutte antiparasitaire 2.

La mouche méditerranéenne est une espèce multivoltines qui peuvent attaquer plus de 300 espèces de sauvages et les plantes cultivées 3,4. Le dommage est causé par les adultes et les stades larvaires: femelles fécondées percent la surface du fruit pour la ponte, ce qui permet des micro-organismes d'affecter leur qualité commerciale, alors que les larves se nourrissent de la pulpe de fruits. Après trois stades larvaires, les larves émergent de l'hôte et se nymphosent dans le sol. Ceratitiscapitata affiche une répartition presque dans le monde entier, y compris l' Afrique, le Moyen-Orient, en Australie occidentale, centrale et Amérique du Sud, en Europe et régions des États-Unis 5.

Les stratégies les plus communes pour limiter les infestations de mouches méditerranéennes impliquent l'utilisation d'insecticides (par exemple, Malathion, spinosad) et respectueux de l' environnement Technique de l' insecte stérile (TIS) 6. Cette dernière approche implique la libération dans la nature des centaines de milliers de mâles rendus stériles par exposition à une irradiation ionisante. L'accouplement de ces mâles stérilisés aux femelles sauvages se traduit par aucune descendance, ce qui provoque une réduction de la taille de la population, pour aboutir finalement à l'éradication. Bien que le SIT a prouvé son efficacité dans de multiples campagnes dans le monde entier, ses principaux inconvénients comprennent les coûts élevés de l'élevage et de stérilisation des millions d'insectes à être libéré. Marquage des individus relâchés est nécessaire de distinguer stérile des insectes sauvages capturés sur le terrain pendantles activités de surveillance et il est actuellement réalisé en utilisant des poudres fluorescentes. Ces procédures sont coûteuses et ont des effets secondaires indésirables 7.

Afin d'optimiser et / ou de développer des approches plus efficaces pour le contrôle de ce ravageur, la biologie et la génétique mouche méditerranéenne ont été largement exploré par de nombreux chercheurs dans le monde entier. La disponibilité de la séquence du génome de la mouche méditerranéenne 8,9, facilitera de nouvelles enquêtes sur les fonctions des gènes. l'interférence ARN est un outil puissant pour de telles études et il peut être atteint par la microinjection d'ARNdb (en ARN double brin) ou siRNA (petits ARN interférents). Cette technique a été utilisée, par exemple, pour démontrer que la cascade moléculaire de détermination du sexe chez C. capitata est partiellement conservée par rapport à celle de la drosophile 10.

Le développement des protocoles à micro - injection d' embryons permis C. mouche méditerranéenne capitata d'être le premier nonespèces de mouches -Drosophilid à être génétiquement modifiées. Comme ses œufs sont semblables à ceux de la drosophile, tant en termes de morphologie et de la résistance à la dessiccation 11, le protocole pour délivrer l' ADN plasmidique dans des embryons pré-blastoderme premier développés pour D. melanogaster 12,13 a été initialement conçu pour être utilisé en C. capitata. Ces premières expériences ont permis la transformation de la mouche méditerranéenne lignée germinale sur la base des éléments transposables Minos 11. Par la suite, a été modifié le système d' origine 14 à l' aide d' autres approches à base de transposons. Tel est le cas de piggyBac de lépidoptères 15 Trichoplusia ni. Le protocole a depuis été optimisé, ce qui a permis la transformation d'autres espèces téphritides 16-21 ainsi que de nombreux autres diptères 22-31. Tous ces systèmes reposent sur l'utilisation d'un système typique de vecteur binaire / auxiliaire de transformation: plasmide artificiel, transp défectueuseles fils contenant les gènes souhaités sont assemblés dans l' ADN plasmidique et intégré dans le génome de l'insecte en fournissant l'enzyme transposase 32. Un certain nombre de lignes de mouches méditerranéennes transgéniques ont été générées, avec de multiples fonctionnalités, y compris des souches portant un gène létal dominant conditionnel qui induit la létalité, les souches produisant exclusivement masculine descendance et ne nécessitant donc pas de stratégies de sexage supplémentaires, et les souches avec le sperme fluorescent, qui peut améliorer la précision de la phase de surveillance SIT 33-37. Bien que la libération dans la nature des organismes transgéniques a eu lieu dans des essais pilotes contre les moustiques seulement 38,39, au moins une entreprise évalue un certain nombre de souches transgéniques pour leur mouche méditerranéenne utilisation dans le domaine 40.

Embryo microinjection peut également favoriser le développement de nouveaux outils génome-édition, telles que la transcription nucléases activateurs comme effecteurs (Talens), regroupées répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) / CRISPR protéine associée 9 nucléase (cas9) et endonucléases homing gènes (HEGs), ce qui permettra de nouvelles études sur l'évolution et le développement, ainsi que l'expansion de la boîte à outils biotechnologiques disponibles. Approches Genome-édition déjà permis à la génération de systèmes de gènes entraînement chez les moustiques 41, et leur transfert à la mouche méditerranéenne est imminente. Nous décrivons ici un protocole universel pour microinjection acides nucléiques dans des embryons qui peuvent être la mouche méditerranéenne utile pour toutes les applications mentionnées ci-dessus.

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Protocole

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1. Experimental Set-up

  1. exigences insectarium
    1. Maintenir tous C. vie capitata étapes à 25 ° C, 65% d' humidité et de 12/12 heures de lumière / photopériode sombre.
    2. Placer environ 1500-2000 pupes mouche méditerranéenne dans un 6 L cage. Utilisez une cage avec un laiton filet sur un côté avec des trous suffisamment petits pour stimuler la ponte 42. Insérez une bande éponge à travers une petite ouverture dans la base de la cage pour fournir des mouches avec de l'eau au moyen d'une action capillaire. Utilisez un mélange de levure et de sucre (1:10) en tant que source de nourriture pour les adultes (figure 1A). Augmenter la quantité de levure (jusqu'à 1: 3, de la levure: sucre) si les femmes ne parviennent pas à pondre des œufs.
    3. Placez une plaque remplie d'eau en dessous de la cage pour recueillir les œufs déposés à travers les mailles. Comme les femelles vierges peuvent pondre, attendre jusqu'à ce que les mouches sont au moins 6-7 jours vieux avant la collecte des œufs pour les expériences de microinjection. Cela permettra d'assurer que les femelles sont accoupléset que les œufs ont été fécondés.
    4. Ramassez les oeufs en filtrant l'eau avec une passoire nette amende. Transférer les oeufs de la crépine dans une boîte en plastique contenant de la nourriture larvaire standard (1,5 LH 2 O, 100 ml de HCl 1%, 5 g de large spectre agent antimicrobien dissous dans 50 ml d' éthanol, 400 g de sucre, 175 g de levure de bière déminéralisé, 1 kg de son de blé tendre) à l'aide d'une pipette Pasteur.
    5. Placez chaque boîte dans un récipient transparent fermé d'un couvercle net pour permettre la circulation de l' air et contenant une couche de bran de favoriser la nymphose (figure 1B).
    6. Après environ 10 jours, vérifiez 3 ème stade larvaire qui se dégagent de la nourriture des larves et de sauter vers le bas dans la couche de son pour la nymphose.
    7. 24 heures plus tard, de recueillir les pupes dans une petite tasse avec une brosse douce et de les transférer à une nouvelle cage adulte. Les adultes émergent normalement 10 jours après la nymphose. La mouche émergente utilise le ptilinum, une poche gonflable situé sur sa tête au- dessus ee base des antennes, pour forcer l'extrémité de la pupe. Après la levée, l'ptilinum effondre en permanence à l' intérieur de la tête.
  2. Préparation de 1 L nourriture pour les larves microinjecté
    1. Dissoudre 2,5 g d' agar dans 300 ml H 2 O.
    2. Chaud 500 ml H 2 O sur une plaque d' agitation chaude et dissoudre 4 g de benzoate de sodium, HCl 4,5 ml 37%, 42 g d' extrait de levure et 115 g de carotte déshydratée en poudre.
    3. Ajouter au mélange une solution de 2,86 g de large spectre antimicrobien dissous dans 10 ml d'éthanol absolu.
    4. Distribuer le milieu dans 15 cm autour des boîtes de Pétri et laisser refroidir. Si nécessaire, conserver à 4 ° C.
  3. Préparation de diapositives
    1. Placez une bande de 2 cm de ruban adhésif double face sur une lame de microscope (75 x 26 mm 2) et marquer les bords avec un marqueur Chine, pour prévenir la propagation de l' huile et de la dessiccation consécutive des embryons injectés.
  4. Nucleic Acid Préparation
    1. Isoler l' ADN plasmidique en utilisant des kits disponibles dans le commerce 34. Précipiter le plasmide en utilisant de l'éthanol et remise en suspension dans un tampon d'injection (0,1 mM de tampon phosphate de pH 7,4, KCl 5 mM) à la concentration souhaitée.
    2. Purifier in vitro en utilisant l' ARN double brin synthétisé à long phénol-chloroforme, précipité avec de l' isopropanol et remettre en suspension dans un tampon d'injection 43.

2. Embryon Préparation

  1. Placez un bac rempli d'eau sous une cage contenant 6-7 jour adultes âgés.
  2. Permettre aux femmes d'pondent pendant 30 min, puis recueillir les embryons en filtrant l'eau à l'aide d'une passoire fine. Toujours garder la crépine dans l'eau pour éviter la dessiccation des embryons.
  3. Dechorionate les embryons en immergeant le tamis pendant 5 secondes dans une solution à 50% d'eau de javel commerciale.
  4. Laver soigneusement les embryons par immergeant à plusieurs reprises la crépine dans l'eau ultrapure propre (au moins4-5 fois). Enfin, placer la crépine dans l'eau ultrapure propre. Utilisez les embryons dans un délai maximum de 2 heures.
    NOTE: Le calendrier de microinjection est liée à la nécessité d'injecter dans des embryons pré-blastoderme, lors d'une phase de divisions nucléaires avant cellularisation. Cela permet à l'ADN injecté à prendre en place dans les noyaux, en particulier dans les noyaux des cellules germinales primordiales qui sont créés gamètes. Chez la drosophile, cellularisation les cellules polaires commence à environ 90 min après la fécondation (à 25 ° C), avec la formation de blastoderme se produisant environ 30 minutes plus tard 44, alors que dans la cellularisation mouche méditerranéenne a lieu entre 9 et 12 h 45,46.
  5. Orientation Embryo en rangées
    1. L'utilisation d'un pinceau fin, recueillir environ 50 embryons et les placer sur un disque de papier filtre noir imbibé d'eau.
    2. En vertu d'un stéréomicroscope à dissection, organiser les embryons dans une rangée sur la surface supérieure du ruban adhésif double face surla lame de microscope à l' aide d' un pinceau fin (000) (figure 1C).
      REMARQUE: Alignez les embryons dans la même orientation, que l'injection est réalisée dans le pôle postérieur, où la lignée germinale proviendra; le pôle postérieur est opposée à la région de micropyle.
    3. Couvrir les embryons avec une couche d'huile de chlorotrifluoroéthylène faire en sorte que l'huile ne rejaillissent pas sur porcelaine frontières de marqueur (voir 1.3).
      NOTE: Avant de recouvrir les embryons avec de l'huile, une étape supplémentaire peut être réalisée: les embryons peuvent être desséchées pendant quelques minutes afin de réduire leur teneur en liquide et faciliter ainsi l'entrée de la solution d'ADN injectée. Cela peut aider à éviter l'éclatement embryon lors de l'injection ou une fuite excessive de la solution injectée, en raison de la pression de liquide élevée.

3. Embryo microinjection

  1. Remplir une aiguille (1-2 ul) avec de l'ADN de plasmide ou d'une solution ARNdb (1-2 ug / ul) en utilisant une micropipette.
  2. connect l'aiguille à l'appareil de micro-injection, qui contrôle le temps d'injection (0,5 seconde), la pression (800 hPa) et la contre-pression (150 hPa).
  3. Effectuer une micro - injection sous un stéréomicroscope, à l' aide d' un micromanipulateur pour commander les mouvements de l'aiguille (figure 1D). Utiliser la platine du microscope pour déplacer la diapositive.
    1. Placer la lame sur la scène de la portée.
    2. Insérer la pointe de l'aiguille dans le pôle postérieur de l'embryon (figure 1E).
    3. Injecter la solution en activant le système de micro-injection avec la pédale. Le liquide injecté provoque une augmentation de la pression interne, ce qui entraîne un léger mouvement de l'embryon.
    4. Relâcher la pédale et immédiatement, mais doucement, retirez l'aiguille de l'embryon.
    5. Observer un peu de fuites cytoplasmique au niveau du site d'injection.
      NOTE: Pour une discrimination entre les effets létaux potentiels d'ADN / ARNdb / siRNA et de la mortalité due à la pro microinjectionprocédure elle-même, des expériences de contrôle doivent être effectuées. Celles-ci comprennent l'injection du tampon uniquement, ou, dans le cas de la génétique inverse des expériences, d'une protéine fluorescente verte (GFP) -derived ARN double brin (ARNdb-GFP) ou ARNsi.
  4. Après injection incuber les embryons à 25 ° C.

4. Procédures de post-injection

  1. Deux jours après l' injection, vérifiez les diapositives de larves écloses (figure 1F) sous un stéréomicroscope. Les larves peuvent se déplacer dans l'huile, mais doivent être transférés à la nourriture des larves dès que possible. Pour cette raison, vérifiez les diapositives plusieurs fois par jour.
  2. L'utilisation d'un pinceau fin (000), transférer doucement les larves écloses à la nourriture des larves sur la base de la carotte. Transfert jusqu'à un maximum de 200 larves par chaque boîte de Pétri.
  3. Incuber les larves à 65% d'humidité (25 ° C). Assurez-vous que le couvercle ne colle pas à l'antenne, d'altérer l'échange d'air.
  4. Gardez les boîtes de Pétri avec le couverclela plupart du temps fermé afin qu'il y ait encore l'écoulement d'air vers les larves. Pour éviter un séchage excessif, vérifiez les plats tous les jours et, si nécessaire, ajouter de l'eau pour compenser l'évaporation.
  5. Placez les boîtes de Pétri dans un récipient transparent fermé par un filet-couvercle et contenant une couche de bran de favoriser la nymphose. En ce qui concerne l' élevage insectarium de routine, 3 e stade larvaire sauter hors de la nourriture des larves et se nymphosent dans le son.
  6. Collecter les pupes et les placer dans une petite cage pour l'élevage des adultes et le dépistage (ce qui est la génération 0, G0). Arrière de la descendance sur la nourriture des larves standard.
  7. Dans le cas des expériences de transformation de lignée germinale, vérifier les individus possibles transformées dans la prochaine génération (G1), en tant qu'individus injectées sont généralement chimères. Les événements de transposition, en effet, ont pu se produire dans l'un des noyaux du syncytium embryonnaire, qui formeront soit le germe en ligne ou le soma.
    1. Peu après la levée, anesthésier individus G1 en utilisant le CO 2 et vérifier transfévénements ormation en vertu d'un stéréomicroscope à épifluorescence. Pour dépister la présence de la fluorescence rouge, utiliser un filtre DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), tout à l'écran pour la fluorescence verte utiliser le filtre EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
    2. Placez les personnes transformées dans une petite cage avec de type sauvage adultes du sexe opposé et proviennent d'une nouvelle, d'abord hétérozygote, la souche.

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Résultats

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Nous rapportons ici deux applications de l'embryon microinjection dirigé à la caractérisation fonctionnelle d'un gène d'intérêt (cas 1), et à la génération de souches transgéniques (cas 2), respectivement.

Livraison d'ARNdb dans des embryons à démêler la fonction des gènes.

Le gène innexin-5 code pour un écart-jonction qui, chez les insectes, est exprimé sp...

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Discussion

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Microinjection d'acides nucléiques dans les embryons d'insectes est une technique universelle qui facilite à la fois l'analyse de la fonction génique et des applications biotechnologiques.

La publication récente des séquences génomiques provenant d'un nombre croissant d'espèces d'insectes conduit à un besoin urgent d'outils pour la caractérisation fonctionnelle des gènes de fonction inconnue encore. L' ARN interférence est avérée être une des méthodes les plus...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du Laboratoire « Génétique et Génomique des Insectes », en particulier Lorenzo Ghiringhelli qui a travaillé au développement, à l’adaptation et au maintien de l’élevage de la mouche au cours des trente dernières années. Une partie des résultats représentatifs de cet article a été réimprimée à partir de N. Biotechnology, 25(1) par Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann ; Diptera : Tephritidae), 76-84, 2008, avec l’autorisation d’Elsevier (Numéro de licence 3796240759880). Ce travail a reçu le soutien de Cariplo-Regione Lombardia « IMPROVE » (FS).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 x tampon0,1 mM tampon phosphate pH 7,4, 5  ; mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmide
dsRNAPhénol-Chloroforme purifié
larvaire standard1,5 L H2O, 100 ml HCl 1 %, 5 g Agent antimicrobien à large spectre utilisé dans les produits pharmaceutiques dissous dans 50  ; ml d’éthanol, 400 g de sucre, 175 g de levure de bière déminéralisée, 1 kg de son de blé tendre
Aliment pour2,5 g d’agar, 4 g de benzoate de sodium, 4,5 ml de HCl 37 %, 42 g d’extrait de levure, 115 g de poudre de carotte, 2,86 ; g agent antimicrobien à large spectre, eau à 1 L d’extrait
alimentaireadulte et sucre (1:10)
Lames de microscopeSigma-AldrichZ692247
Aiguilles d’injection  ;Eppendorf5242956000
MicrochargeursEppendorf5242956003
Ruban
Whatman Papier cercle noirSigma-AldrichZ695505
BleachDiluite 1:2 avant utilisation
Pinceau (000)
MicromanipulateurNarishigeMN-153
MicroinjecteurEppendorfFemtojet
Cages
Huile de chlorotrifluoroéthylèneSigma-AldrichH8898
Ceratitis capitataLa souche utilisée est ISPRA
d’injection Nourriture larves de carottes de levureadhésif double glisséadultes

Références

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