Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

Summary

Nous décrivons ici une méthode d’identification des protéines de liaison aux petites molécules à l’aide du marquage par photoaffinité. L’avantage de cette technique est que la liaison et le marquage covalent des protéines cibles se produisent dans l’environnement cellulaire vivant, éliminant ainsi le risque de perturber la structure des protéines natives et les conditions de liaison lors de la lyse cellulaire.

Abstract

L’identification de la ou des cibles moléculaires des petites molécules est une étape difficile mais nécessaire vers la compréhension de leur mécanisme d’action. Bien que plusieurs méthodes d’identification de cibles aient été développées et utilisées pour élucider avec succès les protéines de liaison d’une variété de petites molécules, ces techniques présentent des inconvénients qui les rendent inadaptées à la détection de certains types d’interactions entre petites molécules et cibles. En particulier, les interactions non covalentes qui dépendent de conditions cellulaires natives, telles que celles des protéines membranaires dont les structures peuvent être perturbées lors de la lyse cellulaire, ne se prêtent souvent pas aux méthodes d’identification des cibles basées sur l’affinité. Ici, nous démontrons une méthode dans laquelle une sonde contenant un groupe photolabile est utilisée pour se réticuler de manière covalente à la protéine de liaison à la petite molécule dans l’environnement de la cellule vivante, permettant la détection et l’isolement de la protéine cible sans qu’il soit nécessaire de maintenir l’interaction après la lyse cellulaire. Cette technique est un outil précieux pour étudier de petites molécules biologiquement intéressantes dont les mécanismes sont inconnus, tant dans le contexte de la biologie fondamentale que de la découverte de médicaments.

Introduction

de petites molécules bioactives fonctionnent fondamentalement par interaction avec et en modifiant la fonction d'une ou plusieurs molécules "cibles", le plus souvent des protéines dans la cellule. Dans la découverte de médicaments, quand un composé actif est découvert par le dépistage phénotypique, l'identification de la cible moléculaire (s) de ce composé est crucial, non seulement pour comprendre le mécanisme d'action et les effets secondaires potentiels du composé, mais aussi pour éventuellement découvrir nouvelle biologie sous - tend le modèle de la maladie et ouvrant la voie pour le développement de nouvelles classes mécanistiques de la thérapeutique ^1. Bien que l'identification des cibles est pas nécessaire pour un médicament à être utilisé en thérapeutique, ces dernières années, il y a eu une reconnaissance croissante que les nouveaux médicaments candidats sont plus susceptibles de réussir dans les essais cliniques, et donc d'obtenir de meilleurs rendements sur investissement, si une cible validée est connue ^2. Ainsi, il y a eu un intérêt croissant pour les méthodes d'identification des petitsprotéines cibles molécule.

Une expérience d'identification de cible classique repose généralement sur ​​la purification par affinité, où la petite molécule d'intérêt est immobilisée sur une résine et mis en incubation avec des lysats de cellules entières, après quoi les protéines non liées sont éliminées par lavage et les protéines restantes sont éluées et identifiés ^3. Bien que cette technique a été utilisée pour identifier les cibles de nombreuses petites molécules ^4, il ne convient pas comme procédé d'identification cible universelle pour plusieurs raisons. Tout d'abord, la protéine cible doit conserver sa conformation native lors de la lyse cellulaire, afin de conserver sa capacité à se lier à la petite molécule. Cela peut être particulièrement problématique pour les protéines membranaires, qui subissent souvent des changements conformationnels après avoir été retiré de son environnement d'origine, ou simplement d'agrégats et précipitent hors de la solution. D'autre part, la petite molécule doit être chimiquement modifiée de façon à ce qu'il puisse être immobilisé sur la résine tout en conservantsa capacité à se lier à la protéine cible. poches de liaison profondes peuvent donc devenir inaccessibles à une petite molécule, une fois qu'il est fixé à la résine. En troisième lieu, l'affinité de liaison doit être suffisamment élevée pour que l'interaction soit maintenue pendant les étapes de lavage, ce qui rend l'identification des interactions d'affinité inférieurs difficiles. En quatrième lieu, les conditions environnementales telles que le pH, la concentration d'ions, ou la présence d'autres molécules endogènes peuvent varier dans l'espace intérieur de la cellule et sont parfois des conditions préalables pour les interactions médicament-cible. Ainsi, trouver les bonnes conditions pour permettre et maintenir l'extérieur de la cellule de liaison peut nécessiter une quantité importante d'essais et d'erreurs.

Marquage photoaffinité évite ces problèmes en permettant la liaison d'une petite molécule et sa cible dans le contexte natif d'une cellule covalente. Plutôt que immobilisant la petite molécule dans une large résine volumineux, la molécule est plutôt modifiée chimiquement pour installer deux petits g fonctionnelleroupes: un groupement photoactivable qui permet une réticulation covalente à la protéine cible lors de l'irradiation avec une longueur d'onde particulière de la lumière, et un groupe rapporteur qui permet à la protéine cible à détecter et ensuite isolé. Les cellules vivantes sont traitées avec la sonde de photoaffinité, la sonde se lie de manière covalente et la réticulation de la protéine cible et le complexe sonde-protéine est ensuite isolée intacte. La spécificité de liaison à la cible sonde est mise en évidence en réalisant une expérience de compétition en parallèle, où un excès du composé parent est utilisé pour concourir à une distance de liaison de la sonde à la protéine cible.

La conception et la synthèse des sondes de photoaffinité varie considérablement d'une petite molécule à l'autre, et ne seront pas couverts par ce protocole; cependant, plusieurs excellentes discussions sur le sujet ont été publiés ^5-9. La considération principale est que la sonde conserve l'activité biologique du composé parent, par conséquent presumabment de liaison à la même cible (s). Relation structure-activité (SAR) des études doivent être effectuées pour déterminer quelles parties de la molécule peuvent être modifiés sans perte de bioactivité. Une variété de différents groupes chimiques ont été utilisés comme agents de reticulation, y compris photoactivables diazirine, la benzophénone, l' azide et aryle, qui présentent chacune des avantages et des inconvénients ^10. De même, il y a plusieurs étiquettes de reporteurs qui ont été utilisées pour isoler des protéines de liaison à la sonde. Les groupes rapporteurs peuvent être fonctionnels eux - mêmes, tels que la biotine couramment utilisés ou des marqueurs fluorescents, ou peuvent être des précurseurs qui nécessitent une fonctionnalisation supplémentaire postérieure à l'étape de photoréticulation, qui ont l'avantage d'être plus petite et donc moins susceptibles de compromettre l' activité biologique ^11.

Dans ce protocole, nous avons utilisé une sonde de photoaffinité contenant un groupe diazirine de photoréticulation et un alcyne terminal pour la fixation d'un groupe reporter par un Cu (I) -catalyzed Azide-Acétylène Sharpless-Huisgen cycloaddition (ou cliquez) Réaction ^12-15. Les études SAR, sonder la conception et la synthèse, et les résultats de ces études ont été publiés ailleurs ^16-18.

Protocol

NOTE: Ce protocole a été adapté de MacKinnon et Taunton ¹⁰ pour une utilisation dans des cellules vivantes.

1. Préparation des cellules cultivées

1. Préparer 6 cm des boîtes de culture de cellules stériles pour le nombre d'échantillons souhaités (voir ci-dessous).
   NOTE: Un plat de cellules est utilisée par condition de traitement, mais si plus de protéines est nécessaire 2 ou 3 plats peuvent être préparés par condition et combinés après irradiation UV.
   1. Préparer au moins 3 plats de cellules; Contrôle négatif avec du DMSO seulement (D), le traitement de la sonde seulement (P), et de la sonde + concurrent (C).
   2. Eventuellement, préparer un 4 ^ème plat comme aucun contrôle UV, à traiter avec la sonde mais non soumis à la lumière UV.
      Remarque: si des molécules multiples concurrents doivent être testés, tels que différents analogues de la petite molécule d'intérêt, préparer des plaques concurrentes supplémentaires si nécessaire.
2. Ajouter des cellules HEK293T à des boîtes de culture dans 4 milieux de culture ml. Utiliser 3,5 millions de caunes par plaque.
   REMARQUE: le nombre de cellules doit être déterminée pour chaque type de cellule de sorte que les cellules sont confluentes à près de 100% au début de l'expérience, afin d'obtenir le rendement maximal de protéine. Pour HUVEC, utiliser 0,3 millions de cellules par plaque. Une bonne approximation est de 1/10 des cellules dans un plat cm confluentes 15. des cellules HEK293T devraient être cultivées dans Dulbecco Modified Eagles Medium additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine.
3. Remettre les cellules dans l'incubateur de culture (37 ° C, 5% _CO2) pendant une nuit.

2. Le traitement des cellules et photoréticulation

1. Le lendemain, pré-aliquote les médicaments suivants dans 1,5 ml microtubes:
   1. Pour le premier traitement, ajouter 4 pl de DMSO à 2 tubes et 4 pl de 10 mM de concurrent ( par exemple, le composé parent non modifié) à 1 tube.
   2. Pour le deuxième traitement, ajouter 16 pi de DMSO à 1 tube et 16 pi de 50 &# 181; M photoaffinité sonde à 2 tubes.
      NOTE: La concentration optimale peut être différente pour les différentes sondes (voir la discussion), mais entre 200-500 nM est un bon point de départ (ici, nous utilisons 200 nM). La concentration du compétiteur doit être supérieure à celle de la sonde au moins 20 fois (ici, nous utilisons 10 uM). La concentration finale de DMSO ne doit être égale dans toutes les plaques et ne doit pas dépasser 0,5% (volume 20 ul).
2. Apportez les plaques de cellules dans la hotte de culture cellulaire et ajouter les médicaments pré-aliquote de l'étape 2.1.1 comme suit: Aspirer 1 ml de milieux de culture, la remise en suspension du médicament pré-aliquotés dans les médias, et en ajoutant le doucement à la chute de la plaque sage. Ajouter le DMSO à la (D) Plaque DMSO et la sonde (P) plaque, et ajouter le concurrent à la concurrence (C) plaque. Retourner les plaques dans l'incubateur de culture pendant 30 min.
3. Avec les lumières de la hotte de culture estompés, ajouter la sonde pré-aliquotés de l'étape 2.1.2 pour sonder (P) et de la concurrence (C) plaques et ajouter laDMSO à la plaque de DMSO (D), comme ci-dessus. Remettre les plaques à l'incubateur de culture pendant 1 heure.
4. Pendant l'incubation, préparer les éléments suivants; Un plateau de glace qui peuvent convenir à toutes les plaques; tampon de lyse glacé (PBS [pH 8,5] + inhibiteur de protéase 1x cocktail [complet EDTA libre, dilué de solution 50x stock faite dans l'eau]; 200 pl / plaque); microtubes étiquetés D, P ou C pour chacune des différentes conditions de traitement sur de la glace.
5. 15 min avant la fin de l'incubation de 1 h, mis en place la lampe UV (365 nm) dans la chambre froide et allumez-le pour réchauffer l'ampoule.
6. Après 1 heure d'incubation avec la sonde, placez les plats sur la glace. Laver les cellules doucement avec 5 ml PBS glacé (pH 7,4) pour éliminer l'excès sonde. Re-couvrir les cellules avec 4 ml PBS glacé.
7. Placer le plat de cellules centrées 3 cm sous la lampe UV sur le dessus d'un sac de glace pour réduire au minimum le chauffage de la lampe. Irradiation pendant 3 min. Retirer le plat sur le plateau de glace et de répéter pour tous les échantillons.
8. UNEirradiation près avoir, aspirer le PBS des cellules et ajouter 200 pi de PBS glacé (pH 8,5) avec des inhibiteurs de la protéase à chaque plaque. Détacher les cellules de la plaque à l'aide d'une raclette en caoutchouc et le transfert des tubes à centrifuger pré-étiquetés sur la glace.
9. Ajouter du SDS à une concentration finale de 0,4% (10 pl de SDS à 10% dans 250 ul de l'échantillon).
   ATTENTION: la poudre SDS est dangereux. Éviter d'inhaler la poudre SDS en portant un masque sur le nez et la bouche.
10. Lyse des cellules par sonication de la suspension pour 10 impulsions (sortie 1, cycle de service de 30%) et incuber sur la glace pendant 1 min avant une deuxième série de 10 impulsions.
11. Si nécessaire, retirez 2 pl de suspension et vérifier sous un microscope optique pour assurer la lyse cellulaire complète.
12. Faire bouillir les échantillons sur une plaque chauffante réglée à 95 ° C pendant 5 min pour terminer la lyse des cellules et dénaturer toutes les protéines.
13. Mesurer la concentration en protéine dans chaque échantillon en utilisant un dosage de protéines compatible avec les détergents spectrophotométrique, par exemple the Dc protéine test ^19, selon les instructions du fabricant, avec un spectrophotomètre pour mesurer l' absorbance à 750 nm.
14. Normaliser la concentration en protéine de 2,5 mg / ml (ou si les concentrations sont inférieures à 2,5 mg / ml, normalise l'échantillon avec la concentration en protéines plus basse) en y ajoutant du PBS pH 8,5 + 0,4% de SDS selon les besoins (par exemple, si les échantillons sont 5 mg / ml dans 250 ul, ajouter 250 ul de PBS, pH 8,5 + 0,4% de SDS pour obtenir une concentration finale de 2,5 mg / ml).

3. Fixation de Tag Fluorescent par Cliquez Chimie pour la visualisation des protéines marquées

1. Enlever 40 pi de lysat cellulaire et le transfert à un nouveau microtube. Maintenir les lysats restants pour une réaction avec de la biotine-azide (étape 4).
2. Ajouter les réactifs suivants dans l'ordre: 0,2 ul fluor-azoture (mM de solution 1 dans le DMSO), 0,58 ul PTCE (mM 100 dans de l'eau avec 4 équivalents NaOH ajouté, préparé frais), et 3,38 ul TBTA (1.7 mM dans un rapport de 4: 1 de t-butanol au DMSO). Vortex pour mélanger.
3. Ajouter 1,14 ul CuSO ₄ 5H ₂ O (50 mM dans l' eau) pour démarrer la réaction. Vortex brièvement et incuber à température ambiante pendant 30 min dans l'obscurité.
4. Ajouter 50 pi de tampon d'échantillon SDS 2x pour arrêter la réaction. À ce stade, exécutez les échantillons directement sur ​​un gel SDS-PAGE ²⁰ pour obtenir les meilleurs résultats, ou conserver à -20 ° C pendant la nuit si nécessaire.
5. Si les échantillons de gel, réchauffer pendant 5 min à 95 ° C avant le chargement sur le gel.
   REMARQUE: Etant donné que le poids moléculaire de la protéine cible est généralement pas connue à ce stade, il est recommandé de faire fonctionner 2 gels ayant des concentrations d'acrylamide différentes ( par exemple, 8% et 15%), ou d' un gel large gradient de plage de poids moléculaire ( à savoir, 4-15%), pour assurer une couverture complète du poids moléculaire.
6. Lorsque le front de colorant ait atteint la fin du gel, de continuer à exécuter le gel pendant 5 minutes pour assurer que tous les excès unreacted fluor-azoture a complètement quitté le gel.
7. Retirer le gel à un récipient avec ddH ₂ O et incuber pendant 10 min avec agitation douce, pour laver tous les excès de fluor-azoture.
8. Placer le gel sur une plaque de verre et analyser le gel à l'aide d'un scanner de gel Typhoon fluorescent selon les instructions du fabricant.

4. Fixation de biotine Tag par Click Chemistry for Affinity Purification des protéines marquées

1. Des lysats restants de l'étape 3.1, en utilisant la quantité maximale après la protéine de normalisation de telle sorte que tous les échantillons sont le même volume (par exemple, si après normalisation à 2,5 mg / ml, les volumes d'échantillons résultants sont 500, 550, et 600 ul, en utilisant 500 pi de chaque).
2. Pré-effacer les lysats en ajoutant 50 pi de billes streptavidine agarose à haute capacité, 2x pré-lavés avec du PBS (pH 7,4). Incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec rotation.
3. Pellet les billes par centrifugation à 1000 g pendant 3 min. Retirer til surnageant dans un nouveau tube sur la glace et jeter les perles.
4. Retirer 1-2% de l'échantillon de DMSO dans un nouveau tube marqué "entrée". Ajouter un volume équivalent de 2x SDS tampon d'échantillon et conserver à -20 ° C.
5. Par 500 pi de lysat, ajouter les réactifs suivants: 1,38 ul biotine-azoture (10 mM dans du DMSO), 5,5 pi PTCE, et 32,5 ul TBTA. Vortex pour mélanger.
6. Ajouter 11 ul CuSO ₄ 5H ₂ O par 500 pi de lysat et vortex brièvement. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
7. Ajouter 4 volumes d'échantillon d'acétone refroidi à -20 ° C. Vortex les échantillons et incuber pendant la nuit à -80 ° C pour précipiter les protéines complètement et retirer la biotine qui n'a pas réagi azide.
8. Centrifuger les échantillons à 17 000 g pendant 15 min à 4 ° C pour sédimenter les protéines précipitées.
9. Aspirer le surnageant complètement, et resolubiliser les protéines par traitement aux ultrasons dans 150 pl de PBS (pH 7,4) + 1% de SDS.
10. Ajouter 600 pl de PBS (pH 7,4) pour diluer la concentration de SDS à 0,2%.
11. Ajouter les échantillons de 30 ul prélavés billes de streptavidine-agarose de haute capacité et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec rotation.
12. Pellet les billes par centrifugation à 1000 g pendant 3 min. Aspirer le surnageant contenant les protéines non liées et défausse.
13. Ajouter 1 ml de tampon de lavage (NaCl 400 mM, Tris 50 mM, 0,2% de SDS, pH 7,4) aux billes, et incuber pendant 5 minutes à température ambiante avec rotation.
14. Répétez les étapes 4.12 et 4.13 3 fois.
15. Aspirer le tampon de lavage complètement des perles, et d'ajouter 30 ul de tampon d'échantillon 2 x SDS.
16. Incuber pendant 5 min sur un bloc C à la chaleur à 95 ° pour libérer les protéines des perles.
17. Centrifuger les billes pendant 1 min à 13 000 xg à la température ambiante.
    NOTE: A ce stade, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à ce que prêt à fonctionner SDS-PAGE. Si les échantillons de gel, réchauffer pendant 5 min à 95 ° C avant utilisation.
18. Avec attentionpipetter le tampon d'échantillon contenant des protéines hors des perles, et charger sur SDS-PAGE ²⁰ (voir considérations importantes ci - dessous). Les perles peuvent être sauvegardés pour rebouillage plus tard si nécessaire.
    NOTE: Pour la détection des protéines par coloration à l'argent, de meilleurs résultats sont obtenus en utilisant un gel épais de 1 mm. Si une bande doit être coupée du gel coloré à l'argent pour la spectrométrie de masse (MS) analyse, préparer tous les réactifs frais à partir de solutions stériles et laisser un puits vide entre les deux échantillons sur le gel. Pour chaque bande découpée dans la voie de la sonde, une tranche parallèle devrait être prélevé sur la voie de DMSO de sorte que les protéines de fond peuvent être soustraites. Pour la validation de la protéine ID par western blot, il est essentiel de charger également l'échantillon d'entrée de l'étape 4.4 lors de l'exécution du gel SDS-PAGE.
19. Suivre un protocole standard pour l'une ou l' autre coloration à l' argent ou ²¹ transfert de Western pour détecter la ²² protéine (s) cible.

Results

Les résultats présentés ici ont été obtenus avec une sonde de photo-affinité de l'itraconazole médicament antifongique, dont l'utilisation a été précédemment publiée ^16. Ces résultats démontrent l'utilisation de la technique de marquage par photoaffinité des cellules vivantes afin d'identifier avec succès une protéine de liaison à l'itraconazole majeure de 35 kDa en tant que protéine de la membrane dépendant de la tension Anion canal 1 (VDAC1).

Discussion

Différentes approches de l'identification des cibles de petites molécules peuvent être regroupées en deux catégories: de haut en bas, où le phénotype cellulaire du médicament est utilisé pour affiner ses cibles potentielles en fonction de leurs fonctions connues, ou bottom-up, où la cible est identifié directement par voie chimique ou génétique ^3. Top-down ou les études phénotypiques peuvent identifier certains processus cellulaires affectés par le médicament (par exemple, la transcription / trad...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)	Life Technologies	20490	Rendre frais jour d’utilisation. Préparez 100 mM de bouillon dans de l’eau avec 4 eq NaOH.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)méthyl] amine (TBTA)	AnaSpec	63360-50  ;	Préparez un stock de 1,7 mM dans un rapport de 4:1 entre le t-butanol et le DMSO, stockez à -20 ° ;C.
Sulfate de cuivre (CuSO4• ; 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	Préparez 50 mM de bouillon dans de l’eau, conservez-le à température ambiante.
Biotin-azide	Click Chemistry Tools	AZ104-100	Préparez un stock de 10 mM dans du DMSO, stockez-le à -20  ; ° ;C.
Alexa Fluor 647-azide  ;	Life Technologies	A10277	Préparer un stock de 1 mM dans DMSO, stocker à -20  ; ° ;C.
Lampe UV 365 nm	Spectroline	FC100	doivent être portées pendant le fonctionnement.
Comprimés inhibiteurs de protéase, sans EDTA	Roche Life Science	11873580001	Préparez une solution 50x dans l’eau et conservez-la à -20  ; ° ;C.
Sonificateur sonificateur	Branson	250	réglé sur la sortie 1, service 30 %.  ;
Scanner à gel fluorescent	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Utilisez le laser rouge pour détecter Alexa-fluor 647.
Kit de dosage des protéines Dc compatible avec les détergents	Bio-Rad	5000112
billes d’agarose streptavidine haute capacité.	Life Technologies	20359
Dulbecco’s Modified Eagles Moyenne, faible teneur en glucose	ThermoFisher Scientific	11885092
Sérum de veau fœtal, qualifié	ThermoFisher Scientific	26140079
Solution de pénicilline/streptomycine	ThermoFisher Scientific	15140122
Tampon d’échantillon SDS (2x)	ThermoFisher Scientific	Référence LC2676