Une blessure à la tête modèle Répétitive commotionnant chez la souris

Résumé

La commotion cérébrale est le type de traumatisme crânien le plus courant. Par conséquent, un modèle animal de commotion cérébrale répétitive, qui reproduit les caractéristiques importantes d’une blessure chez les patients, peut fournir un moyen d’étudier les commotions cérébrales de manière rigoureuse, contrôlée et efficace.

Résumé

Bien que la commotion cérébrale ou le traumatisme craniocérébral léger (TCLm) soit le cas le plus fréquent de traumatisme craniocérébral, il y a encore un manque de connaissances sur le traumatisme et ses effets. Pour mieux comprendre les commotions cérébrales, les animaux sont souvent utilisés parce qu’ils fournissent un modèle contrôlé, rigoureux et efficace. Des études ont adapté des modèles animaux traditionnels pour effectuer des TCL afin de stimuler la gravité des blessures légères en modifiant les paramètres des blessures. Ces modèles ont été utilisés parce qu’ils peuvent produire des lésions cérébrales morphologiquement similaires à l’état clinique et fournir un spectre de gravité des blessures. Cependant, ils sont limités dans leur capacité à présenter les caractéristiques identiques des blessures chez les patients. En utilisant un système d’impact traditionnel, un modèle de commotion cérébrale répétitive (rCHI) peut induire une commotion cérébrale légère à modérée de type humain. Le degré de lésion peut être déterminé en mesurant la période de perte de conscience (LOC) avec un signe d’arrêt transitoire de la respiration. Le modèle rCHI est avantageux à utiliser pour sa précision et sa simplicité dans la détermination des effets des TCL et des traitements potentiels.

Introduction

Commotion, également appelée légère lésion cérébrale traumatique (TCCL), est le cas le plus fréquent de lésion cérébrale traumatique (TBI) et affecte des millions de personnes dans les États-Unis. Commotions peut être difficile à diagnostiquer et il n'y a pas de remède spécifique pour une commotion cérébrale. Il y a une reconnaissance croissante et une preuve que le traumatisme mécanique légère résultant de blessures sportives, le combat militaire, et d' autres activités physiques d' engagement peut avoir des conséquences neurologiques cumulatifs et chroniques ^1,2. Cependant, il y a encore un manque de connaissances sur les commotions cérébrales et leurs effets. méthodologie actuelle limite les études de pathologie et le traitement chez l'homme car seule l'évaluation neurologique et l'évaluation de l'imagerie sont disponibles pour le diagnostic clinique. Les modèles animaux fournissent un moyen d'étudier les commotions cérébrales d'une manière efficace, rigoureuse et contrôlée avec l'espoir de diagnostic et de traitement du TCCL.

Des études ont adapté TBI traditionnellemodèles tels que l'impact corticale contrôlé (CCI), l'impact percussion de fluide (FPI), blessure à la chute de poids, et les blessures de souffle pour effectuer TCCL et stimulent les sévérités de blessures faibles en changeant les paramètres de blessures. Ces modèles sont avantageux d'utiliser en raison de leur capacité à reproduire un traumatisme cérébral morphologiquement semblables à ceux de l'état clinique; Cependant, ils ont aussi leurs propres limites. La gravité de la lésion induite par une blessure d'accélération (poids chute) est souvent très variable. Les deux résultats de la CCI légère - hémorragie méningée et contusion focale - ne sont pas comparables avec les commotions cérébrales humaines typiques. CCI et FPI exigent une craniotomie, qui ne sont pas cliniquement pertinente, alors que les blessures de souffle est un modèle plus controversée en ce qui concerne les différentes positions de l' exposition et la pression maximale des mesures, ainsi que des blessures secondaires variable au cours de l'exposition ^_3-6. Un modèle mis à jour des animaux concussive qui peut traduire la recherche pré-clinique dans le setti cliniqueng est nécessaire dans la recherche.

La question clé dans la modélisation légère TBI est de définir la gravité des blessures expérimentales, qui reproduit le plus étroitement la blessure dans un cadre clinique. Récemment, différents groupes de recherche ont développé le traumatisme crânien fermé ou un traumatisme crânien concussive (CHI) modèle ^7-10. CHI est une modification du CCI sans craniotomie, mais il utilise toujours un système d'impact magnétique électronique traditionnelle pour générer un choc de la tête. Un CHI peut induire une commotion cérébrale allant de légère à modérée en ajustant les paramètres d'impact. Perte de conscience (LOC) peut être observée immédiatement après un choc en détectant une diminution de la fréquence respiratoire ou la cessation temporaire de la respiration. La période de LDC est utilisée pour déterminer la gravité de la blessure. Ce document comprend une version légèrement améliorée et mise à jour d'un modèle répétitif CHI (rCHI) chez la souris, avec un protocole détaillé étape par étape et des résultats représentatifs. La rCHI stratégies de recherche de modèle, unre bénéfique dans la détermination des effets et des traitements potentiels TCL, surtout parce qu'il n'y a pas de modèle animal capable d'imiter tous les changements pathologiques induits par une commotion cérébrale.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées en vertu des protocoles # 201207692 approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Floride et en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Animal Care

1. Utilisez 3-4 mois vieux mâles C57BL / 6J. Fournir la literie, matériel de nidification, de la nourriture et de l' eau ad libitum. Garder la souris dans des températures ambiantes contrôlées à 20 - 22 ° C avec de la lumière / 12 h-cycles sombres 12 h constants.

2. Pré-impaction Préparation

1. Joindre une silicone pointe en métal recouvert de caoutchouc sur mesure à un dispositif d'impact stéréotaxique électromagnétique. Assurez - vous que le fond plat de la pointe est parallèle à la surface de la pointe de la sonde (figure 1A).
2. Anesthetize la souris avec 4% d'isoflurane suivi d'entretien de l'anesthésie de 2,5% d'isoflurane. Vérifier l'anesthésie par l'intermédiaire du débitmètre. Monitor le niveau d'anesthésie jusqu'à ce que l'animal atteint un niveau chirurgical de l'anesthésie en montrant la perte de retrait de la pédale réflexe.
3. Placez la souris dans une position couchée sur un coussin chauffant. Utilisez un cône de nez en forme d'entonnoir pour garder la souris sous anesthésie. Complètement raser la tête à l'aide d'une tondeuse. Utilisez la vaseline pommade ophtalmique sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.

3. Paramètres d'impact Réglage

NOTE: Le système d'impact comprend un boîtier de commande pour définir les paramètres d'impact, un actionneur pour effectuer l'impaction, et un cadre stéréotaxique numérique avec 3 axes de mouvement.

1. Pré-régler la vitesse du dispositif d'impact à 4 m / s et le temps de séjour à 240 msec sur le boîtier de commande.

4. Positionnement du Centre d'impact

1. Mettez un coussin chauffant souple sous le corps de l'animal pour maintenir la température du corps près de 39 ° C. Monter la souris dans un cadre stéréotaxique dans un prone position avec les barres d'oreilles extrémités franches.
2. Abaisser la pointe d'impact près de la tête de la souris en déplaçant le Z-pilote. Réglez la pointe d'impact plat (9 mm de diamètre) en déplaçant le X et Y conducteurs à mi-chemin de coordonnées cible au-dessus de la suture sagittale.
3. Assurez - vous que l' un des bords de la pointe d'impact verticalement parallèle à une ligne horizontale imaginaire tracée entre les deux oreilles (figure 1C). Le centre de l'impact correspond à la mi-chemin sagittal central de suture entre les sutures interfrontal et lambdoïdes (interauraux 9 mm à Interaural 0 mm, latéral 4,5 mm).

5. Impact Profondeur Réglage

1. Pour définir correctement la profondeur de l'impact, utilisez la pointe de la sonde supplémentaire pour remplacer la pointe d'impact de caoutchouc silicone isolé.
2. Pour assurer qu'il n'y a pas de décalage du centre d'impact après des conseils de commutation, réglez le X et le canal Y sur le panneau de commande stéréotaxique numérique à zéro avant de changer les pointes.
3. Déplacez le probe pointe vers le centre de la zone d'impact en déplaçant manuellement les X et Y lecteurs.
4. capteur de contact Clip à la queue de la souris.
5. Déplacer l'impacteur (Z lecteur) vers le bas jusqu'à ce que la pointe de la sonde touche la surface du site d'impact.
6. Réglez le canal Z sur le panneau de commande stéréotaxique à zéro.
7. Déplacez la pointe d'impact vers la zone d'impact en réglant manuellement X et Y conducteurs (PAS les zéro boutons sur le panneau de commande stéréotaxique numérique) jusqu'à ce que X et Y conducteurs sont nuls (où la pointe d'impact a été préalablement positionné).
8. Dégager l'actionneur en déplaçant le commutateur de retrait sur le boîtier de commande. Déplacer manuellement l'impacteur vers le bas (pilote Z) de 4 mm.

6. impact

1. Déclencher l'impact en cliquant sur le bouton d'impact sur le boîtier de commande et d'atteindre une profondeur de 4 mm de déformation.

7. Post-impaction

1. Mesurer le temps écoulé entre l'impact jusqu'au premier souffle de la souris à l'aide d'une minuterie.
2. Retirer l'animal de l'instrument et les placer sur un tampon chaud pour maintenir leur température corporelle. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.
3. Autoriser la récupération avant de retourner l'animal de retour dans une cage propre. Ne retournez pas un animal à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
4. Observer et peser les souris par jour. Si les souris montrent des signes de douleur, intrapéritonéale les injecter avec Meloxicam à 1 - 2 mg / kg toutes les 12-24 heures.

8. impaction Répétitive

1. Donner les souris blessures supplémentaires aux jours 4, 7 et 10 après la blessure initiale (intervalle de 72 heures entre les impacts).

9. immunohistochimie (IHC)

1. perfusion Transcardial
   1. Anesthetize les souris par injection intrapéritonéale avec 200 m / kg pentobarbital.
   2. Évaluer et assurer chirurgicale plan anesthésie par un pincement de l'orteil. Secondeure la souris en position couchée en collant doucement les pattes et les pattes arrière sur une surface de travail de styromousse dans une hotte chimique.
   3. Faire une incision à travers la peau le long de la ligne médiane thoracique de juste sous le processus xiphoïde à la clavicule. Faire deux incisions supplémentaires de la peau au processus xiphoïde et continuer sur la base de la cage thoracique ventrale latéralement.
   4. Ouvrez la cavité thoracique et d'exposer le coeur en coupant à travers la musculature thoracique et cage thoracique.
   5. Fixer le cœur battant avec une pince contondants et de faire une 1 - mm incision 2 dans le ventricule gauche.
   6. Insérer immédiatement une aiguille papillon dans l'oreillette droite. Commencez la perfusion de 20ml solution saline en poussant la seringue lentement.
   7. Passer de solution saline à 4% de paraformaldehyde. Poursuivre la perfusion avec 20 ml de paraformaldéhyde.
   8. Décapitez la souris et enlever la peau avec des ciseaux. Isoler le cerveau du crâne à l'aide d'un coupe-os.
2. Cryostat sectionnant
   1. les tissus du cerveau Intégrer dans la température optimale de coupe (OCT) formulation et le gel à -80 ° C. Placer le cerveau dans le cryostat dans une orientation sagittale. coupes de cerveau Couper 5 um d'épaisseur.
3. tachant
   1. Sécher les sections congelées à la température ambiante pendant 1 h.
   2. Incuber les lames avec 100 ul de sérum de chèvre à 2% et 0,1% de Triton X-100 dans du tampon phosphate salin (PBS) pendant 1 heure à température ambiante.
   3. Laver les lames 3 fois avec 300 pi de PBS. Puis incuber les lames avec anti-GFAP (1: 200) ou de l'anticorps anti-ferritine (1: 200) séparément pendant une nuit à 4 ° C.
   4. Laver les lames 3 fois avec 300 pi de PBS. Ensuite incuber les lames pendant 2 heures à la température ambiante avec un anticorps secondaire conjugué à la biotine.
   5. Laver les lames 3 fois avec 300 pi de PBS. Puis incuber les lames avec complexe (ABC) solution avidine-biotine (01h50) à la température ambiante pendant 30 min.
   6. Laver les lames 3 fois avec 300 pi de PBS. Puis laisser incuber à la 3,3'-diaminobenzidine solution (DAB) de substrat (50 ml de PBS, 10 ul de H ₂ O _2, 10 mg de DAB comprimé, le filtre avant utilisation) pour 5-8 minutes. Observer les lames au microscope jusqu'à ce que les cellules positives apparaissent.
   7. Rincer les lames à l'eau courante du robinet lente pendant 5 min. Nettoyer les lames avec un laboratoire essuyez. Montez ensuite les sections avec un milieu de montage et lamelle.

Résultats

Dans ce modèle (figure 1 AC), il y avait de brèves périodes de halètement et peu profondes respirations. Une perte de conscience (inconsciente) est définie comme une diminution de la fréquence respiratoire ou de la cessation temporaire de la respiration avant de reprendre une respiration normale. Un impact sur le centre de la tête a causé une perte de conscience à court terme (7,5 ± 4,7, 7,8 ± 5,5, 10,2 ± 8,8, 9,5 ± 8,0 sec à chaque impact séparément, figure 1D)....

Discussion

Pour imiter des lésions cérébrales morphologiquement similaires à l'état clinique, les symptômes post-commotion cérébrale sont attendus. les symptômes post-commotion cérébrale comprennent généralement des maux de tête, des étourdissements, des vertiges, la fatigue, la mémoire et les problèmes de sommeil, problèmes de concentration, ainsi que l'anxiété et humeur dépressive. Puisque les symptômes somatiques peuvent pas encore être mesurable dans des modèles animaux, les changements de moteur et la fonction cogniti...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
appareil d’anesthésie	Eagle Eye Anesthesia, Inc	Modèle 150  ;	anesthésie
Impacteur électromagnétique	LeicaBiosystems	Impact One Impactor	perform impaction
Instrument stéréotaxique numérique	LeicaBiosystems	39462501	souris et pointes de positionnement
Pointe métallique recouverte de caoutchouc Sicilone	Outil de précision & Ingénierie, Gainesvill FL	pointe d’impact	sur mesure
Tondeuse tout-en-un au lithium-ion	WAHL Home Products	9854-600	shave mouse hair
paper clips	sonde	sur mesure
Applicateurs à pointe de coton	MEDLINE	MDS202055	tête de gommage avec solution saline
Tissue Tek O.C.T.	ASKURA FINETEK USA INC	4583	enrobage tissulaire
anti-GFAP	Dako	CA93013	anticorps pour IHC
anti Ferritine	Sigma	F6136	anticorps pour IHC
VECTASTAIN Elite ABC  ; kit	Vector laboratories	PK-6100	Système de détection IHC
Permount Montage Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Aperio XT ScanScope scanner	Leica Microsystems Inc,balayage		de lames
Leica AutoStainer XL	Leica the pathology Company	ST2010	H& E coloration
DAB  ;	Système de détection IHC	sigma	D3939

pointe de