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Article de méthode

Modèle in vivo pour tester l' effet de l' hypoxie sur la tumeur métastase

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DOI :

10.3791/54532

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9 décembre 2016

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1Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University Medical Center, 2Department of Nursing, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 3Department of Human Science, Georgetown University, School of Nursing and Health Studies, 4School of Medicine, Georgetown University Medical Center, 5Department of Pathology and Neuropathology, Medical University of Gdańsk, 6Department of Oncology, Georgetown University Medical Center, 7Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit le développement d’un modèle animal qui permet de tester directement les effets de l’hypoxie tumorale sur les métastases et de déchiffrer les mécanismes de son action. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur le sarcome d’Ewing, une approche similaire peut être appliquée à d’autres types de tumeurs.

Résumé

L’hypoxie a été impliquée dans les métastases du sarcome d’Ewing (SE) par des observations cliniques et des données in vitro, mais les preuves directes de son effet pro-métastatique font défaut et les mécanismes exacts de son action ne sont pas clairs. Ici, nous rapportons un modèle animal qui permet de tester directement les effets de l’hypoxie tumorale sur la dissémination des SE et d’enquêter sur les voies sous-jacentes impliquées. Cette approche combine deux stratégies expérimentales bien établies, la xénogreffe orthotopique de cellules ES et la ligature de l’artère fémorale (FAL), qui induit une ischémie des membres postérieurs. Des cellules ES humaines ont été injectées dans les muscles gastrocnémiens de souris SCID/beige et les tumeurs primaires ont été laissées croître jusqu’à une taille de 250 mm3. À ce stade, soit les tumeurs ont été excisées (groupe témoin), soit les animaux ont été soumis à la FAL pour créer une hypoxie tumorale, suivie d’une excision de la tumeur 3 jours plus tard. L’efficacité de FAL a été confirmée par une augmentation significative de la liaison de l’hypoxyprobe-1 dans le tissu tumoral, une nécrose tumorale sévère et une inhibition complète de la croissance tumorale primaire. Il est important de noter que, malgré ces effets directs de l’ischémie, une dissémination accrue des cellules tumorales des tumeurs hypoxiques a été observée. Cette stratégie expérimentale permet une analyse comparative des propriétés métastatiques de tumeurs primaires de même taille, mais de niveaux d’hypoxie significativement différents. Il fournit également une nouvelle plate-forme pour évaluer davantage la base mécaniste des altérations induites par l’hypoxie qui se produisent lors de la progression tumorale métastatique in vivo. De plus, bien que ce modèle ait été établi à l’aide de cellules ES, nous prévoyons que cette stratégie expérimentale pourra être utilisée pour tester l’effet de l’hypoxie dans d’autres sarcomes, ainsi que dans des tumeurs implantées orthotopiquement dans des sites avec une voie d’approvisionnement en sang bien définie.

Introduction

Le sarcome d'Ewing (ES) est une tumeur maligne agressive affectant les enfants et les adolescents. 1 Les tumeurs se développent dans les tissus mous et les os, généralement dans les membres. Alors que la présence de métastases est le plus puissant facteur pronostique défavorable pour les patients ES, les mécanismes sous-jacents à leur développement restent floues. 2 est une tumeur hypoxie des quelques facteurs impliqués dans la progression ES. ES chez les patients, la présence de zones non perfusé dans le tissu de la tumeur est associée à un mauvais pronostic. 3 In vitro, l' hypoxie augmente invasivité des cellules ES et déclenche l' expression de gènes pro-métastatiques. 4-6 Cependant, malgré ces éléments de preuve, aucune preuve directe pour ES induite par l' hypoxie progression et la propagation existe. En outre, les mécanismes par lesquels l'hypoxie exerce de tels effets sont, à l'heure actuelle, inconnus. Par conséquent, nous avons créé un modèle in vivo pour combler l'écart entre les existants des données in vitro et obser cliniquevations. Ce système modèle permet de tester directement les effets de l' hypoxie sur les tumeurs qui se produisent dans leur environnement naturel, en utilisant l' imagerie par résonance magnétique (IRM) pour suivre la progression tumorale et les métastases in vivo en combinaison avec ex vivo analyses pathologiques et moléculaires (figure 1).

Comme aucun modèle transgénique établi des ES est actuellement disponible, les études in vivo sur les propriétés métastatiques de ces tumeurs reposent sur des injections de cellules humaines dans des souris immunodéprimées. Bien que l'utilisation d'animaux déficients immunologiquement peut sous-estimer l'impact du système immunitaire sur la progression de la maladie, la capacité d'utiliser des cellules humaines augmente traductibilité de ces études. Parmi les modèles de xénogreffes différents, les injections systémiques dans la veine caudale sont les plus faciles à réaliser, mais ils omettent les étapes initiales de cellules tumorales intravasation et d'échapper à partir du site principal de la croissance. 12/07 D'autre part, orthoto pic xénogreffe, qui implique des injections de cellules tumorales dans les os (fémur, côtes) ou les muscles, est techniquement plus difficile, mais aussi biologiquement plus pertinentes pour le cancer humain. 13-16 Cependant, dans le passé, le taux élevé de morbidité associée à la croissance rapide des tumeurs primaires a souvent nécessité l' euthanasie des animaux avant le développement de métastases. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle préalablement établi des injections de cellules dans le muscle gastrocnémien, suivie par l'excision de la tumeur primaire résultante combinée avec un suivi longitudinal de la progression métastatique par IRM. 17,18 Ces injections dans le muscle gastrocnémien à proximité du tibia permettent la croissance tumorale dans deux ES naturelles environnements - les muscles et les os - et entraîner des métastases à distance à des endroits généralement affectés chez les humains. 18 Ainsi, ce modèle récapitule avec précision les processus métastatiques qui se produisent chez les patients ES lors de la progression de la maladie.

tente "> La localisation des tumeurs primaires dans le hindlimb inférieur facilite également le contrôle précis de l'approvisionnement en sang dans le tissu tumoral. artère fémorale ligature (FAL) est une technique bien établie utilisée dans la recherche de l'angiogenèse pour bloquer le flux sanguin vers les régions distales la jambe et étudier vascularisation des tissus en réponse à une ischémie. 19,20 importante, la chute initiale dans le flux sanguin est suivi par une sûreté ouverture du vaisseau et la reperfusion tissulaire observée à environ 3 jours après la FAL. 20 Ainsi, lorsqu'il est effectué dans un membre porteur d'une tumeur, ce modèle recrée les événements hypoxie / reperfusion qui se produisent naturellement dans les tumeurs à croissance rapide et permet l'échappement des cellules tumorales métastatiques dues à la restauration de la perfusion du hindlimb inférieure via les vaisseaux collatéraux nouvellement ouverts. 21 Fait important, cette procédure doit être effectuée lorsque la taille de la tumeur est suffisamment faible pour prévenir l'hypoxie excessive dans les tumeurs témoins (typiquement au porteur d'une tumeur veau volume de 150-250 mm 3), assurant des différences significatives dans les niveaux de l' hypoxie tumorale entre les groupes témoins et FAL-traités.

Outre le suivi longitudinal de l'effet de l'hypoxie sur ES latence et la fréquence des métastases, ce modèle permet également la collecte des tissus et le développement de nouvelles lignées cellulaires à partir des tumeurs primaires et des métastases. Surtout, les travaux antérieurs établi que des lignées de cellules de métastases dérivées présentent un potentiel métastatique accrue sur la réintroduction d'animaux, ce qui indique que la diffusion de la tumeur est associée à des changements permanents dans le phénotype de cellules tumorales et validant ainsi l'utilisation de ces lignées de cellules pour déchiffrer les processus métastatiques. 18 Collectivement, ces modèles peuvent maintenant être utilisés pour les analyses génétiques et moléculaires nécessaires à l' identification des voies métastatiques induite par l' hypoxie.

Comme l'hypoxie est un facteur pro-métastatique améliorant la malignité de divers tumors, notre modèle peut être utilisé comme une plate-forme pour étudier le rôle de l'hypoxie dans d'autres types de tumeurs qui se développent naturellement dans les membres, comme l'ostéosarcome et le rhabdomyosarcome. 21-23 En outre, une approche similaire peut être appliquée à des tumeurs malignes en croissance dans d' autres localisations anatomiques avec une voie d'approvisionnement en sang bien défini. En fin de compte, le modèle peut être modifié et son utilité en outre étendu, en fonction des besoins individuels de recherche.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université de Georgetown.

1. Préparation des cellules pour orthotopiques Injections

  1. Les cellules ES humaines Culture dans des conditions normales. Consommerait environ 15 cm, une plaque de culture cellulaire ne dépassant pas 70% de confluence pour l'injection de 5 souris.
    NOTE: Pour cette étude, des cellules SK-ES1 ont été cultivées dans du milieu de McCoy 5A avec 15% de sérum bovin fœtal (FBS), sur des plaques revêtues de collagène et les cellules TC71 ont été cultivées dans du RPMI avec 10% de FBS et 1% de 4- (2-hydroxyethyl ) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES). Les deux milieux ont été supplémentés avec des antibiotiques - la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 pg / ml) et de Fungizone (1 pg / ml).
  2. Laver les cellules ES avec du tampon phosphate salin (PBS) et trypsiniser à 70% de confluence avec de la trypsine à 0,25% d'acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 5 min.
  3. Retirez les cellules ES de la plaque avec la culture cellulaire media, puis centrifuger pendant 5 min à 200 x g à température ambiante. Re-suspendre les cellules ES dans 10 ml de PBS froid puis compter le nombre de cellules.
  4. Centrifugeuse cellules ES pour 5 min à 200 xg à la température ambiante, puis remettre en suspension à 2 x 10 7 (SK-ES1) ou 10 7 (TC71) cellules par ml dans du PBS froid. Gardez la suspension cellulaire finale sur la glace tout en effectuant des injections.

2. Injection orthotopique de cellules ES dans Gastrocnemius Muscle

  1. Utilisez 4-6 semaine vieux SCID femelle / souris beige.
  2. Pour injecter des cellules ES, tenir doucement la souris et stabiliser sa jambe gauche entre les quatrième et cinquième doigts, exposant le côté médial de la patte arrière inférieure.
  3. En utilisant une aiguille de 28 G ½, injecter 0,1 ml de la suspension de cellules préalablement préparée qui contient soit 2 x 10 6 (SK-ES1) ou 10 6 cellules (TC71) ES dans le muscle gastrocnémien (figure 2A).
    NOTE: Bien que le volume maximum pour inj intramusculaireexions est généralement 0,05 ml, pour cette procédure particulière l'augmentation du volume à 0,1 ml est nécessaire en raison du nombre de cellules haute injecté. Cette procédure a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université de Georgetown.
    1. Insérez l'aiguille dans le muscle gastrocnémien à environ 30 en avant - angle de 45 degrés dans la direction de la crête tibiale / tubérosité.
    2. Légèrement retirer l'aiguille une fois qu'il touche la crête tibiale / tubérosité. Injecter lentement la solution de suspension cellulaire, retirant progressivement l'aiguille pour relâcher la pression.
  4. Surveiller les souris injectées au cours des 24 heures suivant les signes de détresse.
    NOTE: Les chercheurs ayant moins d'expérience dans la manipulation des animaux devrait envisager anesthésier les souris pour les injections de cellules tumorales. Certaines institutions peuvent nécessiter une anesthésie pour des raisons de sécurité.

3. Suivi de la croissance tumorale primaire

  1. Surveiller la croissance des tumeurs primaires daily jusqu'à ce que la taille de la tumeur atteint le volume souhaité.
    Remarque: Dans l'étude actuelle, un volume de veau de 250 mm 3 a été utilisé comme point de l'expérience (figure 2B) de départ. En règle générale, il faut environ 1 - 2 semaines pour que les tumeurs atteignent cette taille.
    1. Mesurer la taille de veau quotidien avec étriers numériques via ses longueurs médio-latérale et antérieure-postérieure.
    2. Déterminer le volume du mollet par la formule (D xd 6/2) x 3,14 où D est le diamètre plus long et d est le diamètre plus court de la patte arrière inférieure portant une tumeur.
      REMARQUE: La taille du mollet normale de la souris adulte est d'environ 40 - 50 mm 3. Son volume augmentera en raison de la croissance tumorale et aux stades ultérieurs du veau sera principalement composé de tissu tumoral.

4. Artère fémorale Ligation (FAL) pour Induire hypoxie dans la tumeur de membres postérieurs portant

  1. Préparer les outils chirurgicaux nécessaires à cette opération: CURved ou pinces fines pointues, pointues des pinces, des ciseaux chirurgicaux et un porte-aiguille. Stériliser ces outils avant l'intervention chirurgicale en utilisant un autoclave ou un stérilisateur à chaud perle. En outre, avoir des cotons-tiges fines prêtes pour cette chirurgie.
    NOTE: Il est recommandé que les outils soient re-stérilisées aux conseils, au besoin au cours de la procédure.
  2. Injecter agent analgésique (carprofène 5 mg / kg) par voie sous cutanée (SQ). Pour détecter et confirmer l'hypoxie, injecter hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
    Remarque: cette dose équivaut à 1,5 mg par souris et est obtenue en injectant 0,1 ml d'une solution hypoxyprobe 15 mg / ml dans du PBS par voie intraperitoneale (IP). Le hypoxyprobe est ensuite post-mortem détectable dans les tissus animaux par immunohistochimie.
  3. Placer la souris dans une chambre d'induction d'anesthésie contenant de 3 à 5% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit de 1 L / min.
  4. Laisser la souris dans la chambre d'aspiration jusqu'à ce qu'il soit insensible à des stimuli externes. Ensuite, retirer l'animal du ichambre nduction. Placer l'animal dans la position couchée sur un champ stérile placé au sommet d'un coussin chauffant sur la surface de fonctionnement. Utiliser un cône d'entrée pour le relier à un flux continu de 1-3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit de 0,8 L / min.
    1. Appliquer une pommade ophtalmique non-médicamenteux stérile pour chaque œil pour éviter le dessèchement de la cornée. Pour épiler soigneusement la zone chirurgicale, appliquez une crème d'épilation, laissant sur la peau pendant plus de 10 sec. Ensuite, essuyez la crème d'épilation à l'aide d'un tampon éthanol de préparation.
  5. Étendre et sécuriser le hindlimb avec un morceau de ruban adhésif d'environ 45 degrés par rapport à la ligne médiane de la souris. Une fois que le hindlimb est sécurisé, essuyez la peau exposée avec 10% de povidone / iode tampon / solution, suivie par l'éthanol, en répétant deux fois plus chacune. Pour la suite de l'intervention chirurgicale, en utilisant un microscope stéréo pour obtenir une vue agrandie de la région de la patte arrière.
  6. En utilisant des pinces pointues et des ciseaux chirurgicaux, faire une incision de la skdans, environ 1 cm de long, de la mi-cuisse vers la région inguinale. En utilisant des tampons de coton fin salins-humidifié, brosser doucement le tissu adipeux sous-cutané entourant le muscle de la cuisse.
  7. révéler soigneusement l'artère fémorale sous-jacente par l'intermédiaire de dissection à travers le tissu adipeux sous-cutané. Stabiliser la plaie et champ chirurgical pour exposer la vascularisation du milieu du haut du muscle adducteur.
  8. En utilisant une pince fine, délicatement percer à travers la gaine fémorale membraneuse pour exposer le faisceau neurovasculaire. L'utilisation d'un ensemble propre de pinces fines, disséquer et séparer l'artère fémorale de la veine fémorale et du nerf à l'emplacement proximal près de l'aine, distale du ligament inguinal. Faites preuve de prudence pour éviter de percer la paroi de la veine fémorale.
  9. Après dissection, passer un brin de 6-0 suture de soie sous l'artère fémorale et distale par rapport à la branche de l'artère fémorale circonflexe latérale (LCFA). Obturer l'artère fémorale à l' aide doubles noeuds (figure 3).
  10. Fermer l'incision en utilisant 6-0 sutures en polypropylène. Après la fermeture de l'incision, injecter SQ 0,5 ml de solution saline chaude pour la thérapie de l'équilibre des fluides. Placez l'animal sur le dessus d'un tampon chaud drapé dans la cage de récupération et de surveiller en continu jusqu'à éveillé.
  11. Surveiller les animaux pendant 6 premières heures après la chirurgie et injecter l'agent analgésique (carprofène 5 mg / kg, SQ) chaque jour pendant 3 jours. Retirer les sutures 10 jours post-opératoires à l'aide de ciseaux stériles.

5. primaire Excision de la tumeur par Leg Amputation

REMARQUE: amputer la patte arrière inférieure portant une tumeur lorsque la taille de veau atteint 250 mm3 pour le groupe témoin ou 3 jours après la FAL du groupe hypoxique.

  1. Raser les poils de la branche portant la tumeur du tibia distal par rapport à la région pelvienne avec une tondeuse à cheveux tout en maintenant doucement l'animal. Injecter l'agent analgésique (carprofène 5 mg / kg, SQ) avant la procédure.
  2. Placez la souris dans une induction de l'anesthésie chambre contenant de 3 à 5% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit de 1 L / min. Laisser la souris dans la chambre d'aspiration jusqu'à ce qu'il soit insensible à des stimuli externes. Ensuite, retirer l'animal de la chambre d'induction.
  3. Placez l'animal dans la position couchée sur le côté droit sur un champ stérile placé sur un coussin chauffant sur la surface de travail. Utiliser un cône d'entrée pour le relier à un flux continu de l'isoflurane: 1 - 3% dans 100% d'oxygène à un débit de 0,8 L / min. Appliquer une pommade ophtalmique non-médicamenteux stérile pour chaque œil pour éviter le dessèchement de la cornée
  4. Préparer le site chirurgical en utilisant 10% de povidone / iode tampon / solution, puis de l'éthanol, en répétant 3 fois. Appliquer une gaze stérile (par exemple drap chirurgical) sur la souris pour obtenir un champ chirurgical stérile.
  5. Faire une incision cutanée médiane fémorale circonférentielle, suivie par dissection et la rétraction de la peau proximalement. Exposer le pédicule neurovasculaire médial du fémur sur le côté médian de la jambe, puis ligaturerprès du ligament inguinal en utilisant 4-0 enduit (polyglactine 910) du matériel de suture absorbable.
  6. Effectuer une transection de mi-fémoral de groupes musculaires avec des ciseaux, suivi par dissection des tissus mous de l'articulation coxofémorale. L'utilisation d'un coupe-os, effectuer une ostéotomie mi-fémorale. En utilisant un coton-tige bien stérile ou une éponge de gélatine absorbable, appuyez doucement sur le site de l'ostéotomie pour minimiser et prévenir les saignements.
  7. Fermez la peau sus-jacente en utilisant des agrafes chirurgicales et injecter 0,5 ml de solution saline chaude SQ pour la thérapie de l'équilibre des fluides. Placez l'animal sur le dessus d'un tampon chaud drapé dans la cage de récupération et de surveiller en continu jusqu'à éveillé.
  8. Après la chirurgie, prélever des échantillons de tissus provenant de tumeurs primaires pour l'ARN, l'ADN ou l'isolement des protéines, snap gel dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Pour la culture de cellules primaires, prélever des échantillons de tissus à cette étape, comme décrit dans la section 9 ci-dessous. Fixer le tissu du membre restant dans 10% de formaline neutre tamponnée pour histologie et immunochemisessayer, y compris hypoxyprobe-1 détection.
  9. Surveiller les animaux pour la locomotion, la douleur et la consommation alimentaire au cours des 6 premières heures après la chirurgie, puis tous les jours pendant 3 jours. Injecter l'agent analgésique (carprofène 5 mg / kg, SQ) par jour pendant 3 jours. Retirez les clips de la plaie 10 jours après l'amputation à l'aide d'un clip décapant blessure.

6. Les souris de surveillance pour la présence de métastases

  1. Observer les souris tous les jours et les évaluer pour les signes cliniques de métastases au moins deux fois par semaine.
    1. Observer les animaux pour la présence de macrométastases présentant comme des masses qui se développent dans divers endroits, typiquement les épaules, les jambes et les mâchoires controlatéral. À cette fin, palper soigneusement la tête, le cou et les régions axillaires et hindlimb controlatéral. Vérifiez les métastases des organes internes par distension abdominale ainsi que l'IRM.
    2. Vérifier la présence de métastases pulmonaires en appuyant sur le processus xiphoïde (l'extrémité inférieure du sternum) avec indépenx doigt. 24
      NOTE: Cette pression diminue la capacité de respiration diaphragmatique. Les souris présentant des métastases pulmonaires avancés montrent des signes de détresse respiratoire qui se manifeste par une respiration laborieuse.
    3. Observer les animaux pour des symptômes neurologiques, tels que la paralysie de la jambe et l'ataxie suggérant des métastases du système nerveux central.
    4. Surveiller les souris au moins une fois par semaine pour la perte de poids, comme une indication de la progression de la maladie potentielle. perte de poids corporel supérieur à 15% du poids avant la procédure est considérée comme un critère humain.

7. Imagerie par résonance magnétique (IRM) pour détecter les métastases

  1. Effectuer une IRM pour détecter les métastases à des points temporels souhaités. 18
    NOTE: Dans l'étude actuelle, un spectromètre horizontal 7-Tesla a été utilisé. L'IRM a été réalisée à 15 jours et 35 post-amputation pour les cellules SK-ES1 et au jour 15 pour TC71 cellules.
  2. Placez la souris dans une induction chambe d'anesthésier contenant 1 à 3% d'isoflurane dans un mélange gazeux de 30% d'oxygène et 70% d'oxyde d'azote.
  3. Laisser la souris dans la chambre d'aspiration jusqu'à ce qu'il soit insensible à des stimuli externes. Ensuite, retirer l'animal de la chambre d'induction.
  4. Transférer la souris anesthésiés sur un support stéréotaxique avec la respiration et de contrôle On température avec l'administration continue de 1,5% d'isoflurane et 30% d'oxyde nitreux. Appliquer une pommade ophtalmique non-médicamenteux stérile pour chaque œil pour prévenir la sécheresse de la cornée. L'image que l'animal soit dans une bobine de volume de souris 40 ou 23 mm Bruker pour le corps entier ou l'imagerie du cerveau, respectivement.
  5. Utilisez un, T2-séquence pondérée en deux dimensions RARE: TR = 3,000 msec, TE = 24 msec, matrice = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, épaisseur de coupe = 0,5 mm, le facteur RARE = 4 et moyennes = 4. 18
  6. Placez l'animal dans une cage de récupération à chaud et de surveiller en continu jusqu'à éveillé.
    REMARQUE: La souris va récupérer rapidement depuis un plan peu profond de l'anesthésie est utilisé.
  7. Surveiller les animaux pendant les 6 premières heures après l'imagerie pour vous assurer qu'il n'y a pas d'effets indésirables de l'anesthésie.

8. Euthanasie et Necropsy

  1. Euthanize les souris une fois que les animaux présentent des métastases détectables par IRM et / ou les symptômes cliniques de la progression de la maladie.
    NOTE: Dans l'étude actuelle, les souris ont été sacrifiées aux jours 50 et 25 post-amputation pour les animaux portant SK-ES1 et TC71 xénogreffes, respectivement. Dans certains cas, l'euthanasie antérieure était nécessaire en raison d'une charge élevée de métastases.
  2. Euthanize les souris par exposition au CO 2 à 1,5 L / min (CO 2 à 10 - 30% de la chambre d'euthanasie vol / min). Pour assurer la mort des animaux, effectuer la dislocation cervicale après CO 2 exposition.
  3. Vaporiser la totalité de la souris avec 70% d'éthanol et le placer dans la hotte à flux laminaire. Recueillir le sang par ponction cardiaque en utilisant une aiguille 25 G ½ avec une seringue de 1 ml et le transfert à une collecte de sang tuêtre contenant 2 mg d'EDTA.
  4. Collecter les tissus suivants: la rate, les glandes surrénales, les ovaires, les reins, le foie, les poumons, le cerveau, la jambe droite, la moelle osseuse à la fois humérus et la colonne vertébrale, ainsi que des métastases macroscopiques présentes dans d'autres endroits. 25,26
  5. Fixer la moitié de chaque tissu dans 10% de formaline neutre tamponnée pour l'histologie et de l'immunochimie, y compris hypoxyprobe-1 détection. Snap geler l'autre moitié dans de l'azote liquide, puis stocker à -80 ° C pour l'ARN, l'ADN ou l'isolement des protéines. 25,26 Pour la culture de cellules primaires, recueillir des échantillons de tissus comme décrit au paragraphe 9 ci - dessous.

9. Culture cellulaire primaire

  1. Pour effectuer la culture de cellules primaires, disséquer les tissus du membre amputé (section 5 ci-dessus) ou lors de la nécropsie (article 8 ci-dessus) dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire.
  2. Préparer la culture cellulaire support approprié pour la lignée cellulaire utilisée pour les injections orthotopique, complété avec de la pénicilline (200 unités / ml),la streptomycine (200 ug / ml), fungizone (1 pg / ml) et 0,2% mycoplasmes antibiotique prophylactique. Placer 2,5 ml du milieu de culture primaire dans une plaque de culture cellulaire de 6 cm.
  3. Sélectionner des zones de tissu tumoral viable à partir de tumeurs primaires ou des métastases, puis isoler deux ou trois segments de 2-3 mm en utilisant chacun des ciseaux stériles.
    NOTE: le tissu tumoral Viable se trouve généralement sur les bords de la tumeur et peut être discriminé de la nécrose par sa couleur rose ou rougeâtre, lustre significative et l'apparence générale humide. En revanche, les tissus nécrosés est souvent observée dans le centre de la tumeur et présente comme une crème masse blanchâtre / couleur avec une apparence de fromage terne. 27
  4. Transférer les segments isolés sur une plaque de culture cellulaire de 6 cm contenant un milieu de culture primaire décrite à l'étape 9.2.
  5. les cellules de culture dans des conditions standard, telles que décrites dans la section 1 (NOTE) et 9.2. 18,28 Vérifiez la culture pour l' excroissance cellulaire résultant des morceaux de tissu, which devrait être observé dans quelques jours. Une fois que les cellules atteignent la confluence, trypsiniser et les propager selon des techniques de culture cellulaire standard.
    REMARQUE: La culture cellulaire primaire peut ensuite être utilisé pour évaluer la croissance et les propriétés métastatiques des cellules dérivées de contrôle et hypoxiques de tumeurs, ainsi que leurs caractéristiques moléculaires, comme décrit précédemment. 18

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Résultats

Suite à l' injection de cellules ES dans le muscle gastrocnémien, les tumeurs primaires sont autorisées à croître à une taille de veau de 250 mm 3 (figure 1, 2). Le temps nécessaire pour que les tumeurs pour atteindre ce volume est généralement compris entre 10 - 15 jours pour TC71 à 20-25 jours de xénogreffes SK-ES1, respectivement. Les tumeurs à un volume de veau de 250 mm 3 présentent un degré d'hypoxie endogène relativement faible (envir...

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Discussion

Notre modèle implique la comparaison des métastases dans les deux groupes expérimentaux - un groupe de contrôle, où on laisse les tumeurs se développer dans la patte arrière suivie d' une amputation après avoir atteint un volume de veau de 250 mm 3, et un groupe hypoxie exposée, dans laquelle l' une tumeur hindlimb roulement est soumise à un FAL au même volume, suivie par une amputation 3 jours plus tard. Bien que, dans ces expériences, les tumeurs traitées par FAL sont amputés avec un léger retard pa...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) : UL1TR000101 (précédemment UL1RR031975) par le biais du Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 et 1R21CA198698 à JK. L’IRM a été réalisée dans le laboratoire de recherche en imagerie préclinique (PIRL) du Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center et le traitement des tissus dans le cadre de l’histopathologie et de la ressource partagée sur les tissus du Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center, tous deux soutenus par la subvention P30-CA051008 du NIH/NCI. Les auteurs remercient Dan Chalothorn et James E. Faber, du Département de biologie cellulaire et de physiologie de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, pour leur aide dans l’angiographie par rayons X post-mortem et pour leur apport et leur expertise sur la collatérogenèse.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
SK-ES1 Cellules du sarcome d’Ewing humain (ES)ATCC
TC71 CellulesAimablement fourni par le Dr. Toretsky
McCoy’s 5A (modifié) MediumGibco par Life Technologies12330-031
RPMI-1640ATCC30-2001
PBSCorning Cellgro21-040-CV
FBSSigma-AldrichF2442-500mL
0,25 % Trypsine-EDTA (1x)Gibco de Life Technologies25200-056
Pénicilline-StreptomycineGibco de Life Technologies15140-122
Fungizone® ; AntimycosiqueGibco de Life Technologies15290-018
MycoZap&trade ; ProphylactiqueLonzaVZA-2032
Collagène de type I Queue de rat haute concentrationBD Biosciences354249
SCID/beigesouris Harlan ou Charles River250 (Charles River) ou 18602F (Harlan)
1 ml Seringues d’insuline avec fixation permanente 28  ; G & frac12 ; aiguilleBD329424
Saline (chlorure de sodium injectable à 0,9 %, USP)Hospira, INCNDC 0409-7984-37
Pieds à coulissenumériques World Precision Instruments, Inc501601
Outils chirurgicauxOutils de sciences
Rimadyl (Carprofène) Injectable  ;Zoetis
Hypoxyprode-1 (chlorhydrate de pimonidazole solide)HPI, IncHP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)HPI, IncCCI-103F-250mg
Povidone-iode SwabstickPDIS41350
Tampon de préparation à l’alcool stérileFisher HealthCare22-363-750
LubriFresh P.M. (lubrifiant pour les yeux pommade)  ;Major PharaceuticalsNDC 0904-5168-38
VWR Sous-couches absorbantes avec barrière imperméable contre l’humiditéVWR56617-014  ;
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper avec lame de taille 50Oster078005-050-002 (tondeuse), 078919-006-005 (lame)
Nair Lotion à l’huile pour bébéChurch & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0Surgical Specialties Corp752B
Suture prolène (polypropylène) 6-0Ethicon8680G
Vicryl (polyglactin 910) suture 4-0  ;EthiconJ386H
Fisherbrand Applicateurs (Coton purifié)Fisher Scientific23-400-115
GelFoam Éponges dentaires résorbables - Taille 4Pfizer Pharmaceutical9039605
Autoclip Wound Clip ApplierBD427630
Stéréo MicroscopeOlympusSZ61
Autoclipremover BD
ClipAound BD427631
MRI 7 TeslaBruker Corporation
Paravision 5.0 logicielBruker Corporation
CO2 Système d’euthanasieVetEquip
25 G 5/8 Aiguille (pour ponction cardiaque)BD305122
seringue de 0,1 ml (pour ponction cardiaque)TerumoSS-01T
K3-EDTA Micro tube 1,3 mlSarstedt41.1395.105
10 % Neutre Ambré FormolFisher ScientificSF100-4
ES humaines fines427637

Références

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