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Article de méthode

Imagerie cellulaire Viabilité sur Echafaudages non transparents - Utilisation de l'exemple d'un roman en maille de titane Implant

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DOI :

10.3791/54537

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7 septembre 2016

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1Siegfried Weller Institute for Trauma Research at the BG Trauma Center, Eberhard Karls Universität Tübingen, 2Department of Orthopaedics, BG Trauma-Center, 3Buck GmbH and Co.KG

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une technique d'imagerie fluorophore sur la base pour détecter la viabilité des cellules sur un échafaudage en titane non-transparent, ainsi que pour détecter des aperçus des impuretés d'échafaudage. Ce protocole répare l'inconvénient d'imager les interactions cellule-cellule ou cellule-métal sur des échafaudages non transparents.

Résumé

La dégénérescence du disque intervertébral et la hernie discale sont l’une des principales causes de douleurs lombaires. L’appauvrissement de la matrice extracellulaire, culminant dans l’extrusion du noyau pulpeux (NP), entraîne la destruction du disque intervertébral. Les traitements chirurgicaux actuellement disponibles réduisent la douleur mais ne restaurent pas la fonctionnalité mécanique de la colonne vertébrale. Afin de préserver les caractéristiques mécaniques de la colonne vertébrale, le remplacement total du disque ou du noyau est donc devenu un grand intérêt. Cependant, cette ère de l’arthroplastie est encore à l’état d’immaturité, car aucun des produits existants n’a été évalué cliniquement.

Cette étude vise à tester la biocompatibilité d’un nouvel implant de noyau composé de fils de titane tricotés. Malgré tous les avantages mécaniques, le matériau a ses limites pour l’analyse optique conventionnelle car l’implant résultant n’est pas transparent. Nous présentons ici une stratégie qui décrit la visualisation in vitro, le suivi et les tests de viabilité des cellules ostéochondro-progénitrices sur l’échafaudage. Ce protocole peut être utilisé pour visualiser l’efficacité du protocole de nettoyage ainsi que pour étudier la biocompatibilité de ces échafaudages et d’autres échafaudages non transparents. De plus, ce protocole peut être utilisé pour montrer le modèle d’adhérence des cellules ainsi que la viabilité cellulaire et les taux de prolifération sur/dans l’échafaudage. Cet essai de biocompatibilité in vitro fournit un outil propice pour analyser l’interaction cellule-matériau dans des échafaudages non transparents et opaques.

Introduction

La lombalgie chronique est une maladie multifactorielle. L'intérêt dans une option de traitement peu invasif pour la maladie dégénérative du disque a augmenté depuis les années 1950. Jusqu'à aujourd'hui, la fusion de plusieurs segmentaire de la colonne vertébrale est le traitement le plus largement utilisé. Depuis, cette méthode conduit souvent à des limitations de la mobilité du segment affecté 1,2, l' exploration de l'ère de l' arthroplastie est devenu un grand intérêt. Des progrès considérables en remplacement de disque et le noyau remplacement total est devenu une bonne alternative pour traiter les douleurs chroniques au dos 1. Malgré les énormes progrès, aucune des méthodes a été évaluée cliniquement. Les implants de noyaux moins rigides représentent une alternative prometteuse pour le remplacement total du disque, à condition que l'anneau fibreux est intact 3,4. Cependant, les implants actuellement présents noyau sur le marché sont souvent associées à des complications comme les changements dans le corps vertébral, dislocation, vertical perte du disque et t la hauteuril manque de nécessaire rigidité mécanique associée 5. Afin de pallier aux inconvénients actuels, un nouvel implant de noyau en fils tricotés de titane a été développé avec succès 6. En raison de la structure tricotée unique, cet échafaudage nouvellement développé a montré des caractéristiques biomécaniques distingués, par exemple, fonction d' amortissement, la taille des pores, la capacité de chargement et de fiabilité 7. Dans le but de tester la biocompatibilité de ce nouvel implant de noyau, représenté dans les limites sévères (optique) des techniques d'analyse attribuées à caractère non transparent de l'implant.

Afin de tester la biocompatibilité, l' interaction cellule-métal joue un rôle prépondérant 10/08. Une interaction entre les cellules et l'échafaudage est nécessaire pour la stabilisation et par conséquent pour l'intégration de l'implant mieux dans le système hôte. Cependant, une augmentation de la profondeur de croissance intérieure peut altérer les propriétés mécaniques de l'échafaudage. Visant à investigate si la surface de l'échafaudage fournit une base pour la fixation cellulaire, la prolifération et la différenciation ou si le métal affecte la viabilité des cellules, il est important de résoudre le problème commun bien connu de l'imagerie de cellules sur / dans les échafauds non transparentes et opaques. Afin de surmonter cette limitation plusieurs fluorescent techniques basées ont été explorées. Les entreprises offrent une large gamme de fluorophores pour visualiser les cellules vivantes, des compartiments cellulaires, ou des états cellulaires spécifiques même 11. Fluorophores pour cette expérience ont été choisis avec l'aide de l'outil visualiseur spectrale en ligne afin d'adapter au mieux notre microscope fluorescent.

La stratégie développée pour l'analyse des cellules comportement adhérent sur / dans l'échafaudage de titane tricoté non-transparent comprend les éléments suivants: 1) fluorescent (protéine fluorescente verte / GFP) marquage des cellules osteochondro-progénitrices pour permettre le suivi des cellules sur la échafaud, 2) la mesure de la viabilité (mitoactivité chondrial) des cellules, et 3) la visualisation de cellule à cellule et des interactions cellulaires matériau au sein de l'échafaudage. La procédure présente l'avantage qu'il peut être facilement transféré à d'autres cellules adhérentes et autres échafaudage non transparente ou opaque. En outre, la viabilité et la structure de croissance interne peuvent être contrôlés pendant plusieurs jours, il peut donc être utilisé avec des quantités limitées de matériau d'échafaudage ou de cellules.

La présente étude démontre l'utilisation réussie de notre protocole actuel pour mesurer la viabilité cellulaire et de visualiser modèle dans la croissance des cellules progénitrices osteochondro-sur / dans l'échafaudage de titane tricoté non-transparent. En outre, les protocoles développés pourraient être utilisés afin de déterminer les impuretés d'échafaudage et de vérifier les protocoles de nettoyage.

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Protocole

REMARQUE: Les cellules précurseurs immortalisés stromales mésenchymateuses humaines (SCP-1 cellules) ont été utilisés pour les expériences. SCP-1 cellules ont été fournies par le Prof. Matthias Schieker 12.

1. Extension du SCP-1 cellules

  1. Avant de travailler avec les cellules SCP-1, bien nettoyer la zone de travail (désigné biosécurité cabinet I) avec des gants éthanol à 70% (v / v) portant.
  2. Dans l'enceinte de sécurité biologique nettoyé préparer un volume approprié de milieu de culture cellulaire en mélangeant les composants requis , comme indiqué dans le tableau 1. Afin de préserver la stérilité du milieu de base, ajouter des suppléments en passant à travers des filtres stériles avec une taille de pores de 0,22 um.
    1. Pour éviter la contamination, préparer le milieu au moins 24 heures avant l'utilisation. Afin de tester la stérilité, incuber 1 ml de milieu dans une plaque de culture cellulaire sans cellules dans l'incubateur de culture cellulaire standard: 37 ° C, 5% de CO 2, 20% de O 2 et 90% d' humidité. Après24 h, vérifier moyenne au microscope en utilisant un grossissement d'au moins 200X.
  3. Maintenir SCP-1 cellules dans un incubateur de culture cellulaire standard avec la condition de soutien: 37 ° C, 5% de CO 2, 20% O 2 et 90% d' humidité.
  4. Pour l'entretien et l'expansion, cultiver les cellules SCP-1 jusqu'à ce qu'ils atteignent 80-90% de confluence. Au cours de cette période de temps la culture, changer moyenne tous les 2-3 jours. Après avoir atteint 80 à 90% de confluence, divisé SCP-1 des cellules (en général un rapport 1: 2) pour le passage suivant ou d'une plaque d'extension pour les expériences (comme indiqué).
  5. Pour séparer les cellules SCP-1, préchauffer le milieu de culture à 37 ° C et à décongeler trypsine / EDTA en utilisant un bain d'eau à 37 ° C.
  6. Complètement aspirer le milieu de culture des cellules confluentes 80-90% et le jeter dans un conteneur de déchets.
  7. Laver les cellules au moins deux fois avec du DPBS (phosphate de Dulbecco sans sérum physiologique tamponné au magnésium et de calcium, pH 7,2).
    1. Pipeter un volume approprié deDPBS sur les cellules (5 ml de DPBS pour un flacon de culture T75 et 12 ml pour une fiole de culture T175).
    2. Aspirer DPBS soigneusement et le jeter dans un conteneur de déchets.
  8. Pipeter un volume approprié de 0,25% de trypsine / EDTA sur les cellules (1 ml de DPBS pour un flacon de culture T75 et 2 ml pour une fiole de culture T175) et on incube pendant 5-10 min à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire standard avec 5 % de CO 2, 20% de O 2 et 90% d' humidité.
  9. Détacher les cellules en appuyant sur le récipient et assurer que toutes les cellules sont détachées de la matière plastique de culture (trypsinisation) en observant les cellules flottantes sous le microscope.
  10. Inactiver la réaction de la trypsine par addition de 10 ml de milieu de culture. Mélanger la trypsine et les cellules avec le milieu soigneusement par pipetage répété.
  11. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de réaction et centrifuger à 600 g pendant 10 min à température ambiante.
  12. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de culturemoyen.
  13. Compter les cellules par Trypan Bleu méthode d'exclusion comme décrit dans le protocole 2.
  14. Ensemencer les cellules en fonction de la conception expérimentale.

2. Comptage de SCP-1 cellules

  1. Effectuer un comptage des cellules viables (bleu Trypan méthode d'exclusion) des cellules remises en suspension en utilisant un hémocytomètre.
  2. Avant le nombre de cellules, nettoyer le hémocytomètre en utilisant l'eau du robinet. Sécher les composants hémocytomètre en utilisant un tissu non pelucheux. Assembler par humidifier le couvercle en verre et en le pressant inverse sur les deux coureurs de verre de chaque côté de la zone de comptage. Veiller à ce que les anneaux newtoniens sont visibles sur les coureurs de verre (Figure 1).
  3. Prenez 10 pi des cellules remises en suspension et mélanger avec 10 pi de solution à 0,1% Trypan bleu pour obtenir un facteur de dilution de 2.
  4. Charge 10 pi de l'échantillon total sur la chambre de hémocytomètre préalablement nettoyé et assemblé.
  5. Comptez le nombre de direct (blanc / cellules transparentes) et morts(noyaux bleus) cellules sur les carrés 4x4 (voir la figure 1B).
  6. Calculer le nombre total de cellules suivant la formule donnée:
    figure-protocol-1

3. GFP Transfection de SCP-1 cellules

NOTE: Afin d'observer SCP-1 la croissance des cellules sur et dans l'échafaudage de titane tricoté sur une certaine période de culture, nous avons marqué les cellules avec une protéine fluorescente verte (GFP). La surexpression de la protéine GFP est obtenue par infection avec des particules d'adénovirus codant pour la GFP. incompétence de réplication (-E1 / -E3) adénovirus particules codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) ont été utilisés pour infecter SCP-1 cellules. Les particules virales ont été obtenues auprès du Prof. Steven Dooley 13 en recueillant le surnageant de culture de l' adénovirus recombinant (Ad5-GFP) , les cellules HEK293T transfectées (de laboratoire de biosécurité II). Trois répétés de congélation (-80 ° C) et le dégel (37 ° C dans le bain d'eau) cycles assuré qu'aucune HEcellules K293T restent viables pour produire de nouvelles particules virales. L'utilisation de ce stock de semences adénovirus peuvent efficacement infecter les cellules SCP-1 sans produire de nouvelles particules virales. Ainsi, les cellules infectées peuvent être traitées dans un laboratoire de biosécurité I.

  1. Remettre en suspension les cellules cibles (cellules SCP-1) avec une densité d'ensemencement de 50.000 cellules / ml dans du milieu de culture. La pipette 2 ml par puits dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits.
  2. Incuber à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire standard; 5% de CO 2, 20% de O 2 et 90% d' humidité, jusqu'à ce que SCP-1 cellules atteignent une confluence de 70 à 80%.
    REMARQUE: confluence dépend de la densité d'ensemencement des cellules. Pour les conditions ci-dessus mentionnées, SCP-1 cellules atteignent une confluence de 70-80% en 1,5-2 jours.
  3. A une confluence de 70-80%, sans aspirer le milieu de culture ajouter 100 pi de la graine d'adénovirus mère par 1 ml de milieu de culture.
    1. Déterminer la plage de concentrations individuellement en fonction de la quantité de particules de virus dans chaque virus seed stocks préparation. Dans le cas où l'efficacité de l'infection est trop faible, de purifier et de concentrer les particules virales en utilisant divers kits disponibles dans le commerce.
  4. Incuber pendant une heure dans l'incubateur de culture cellulaire standard à 37 ° C (5% de CO 2, 20% de O 2 et 90% d' humidité).
  5. Retirez le milieu de culture contenant le stock de semences de virus et de recueillir pour l'élimination. Ajouter milieu de culture frais 2 ml par puits d'un 6-bien-culture-plaque pour reconstituer.
    1. Assurez-vous que avant l'élimination, particule virale contenant du milieu est autoclavé.
  6. Évaluer l'expression de la GFP intracellulaire (efficacité d'infection) 24 heures après l'infection en utilisant un microscope à fluorescence avec une GFP LED cube / jeu de filtres.
    1. Observez la morphologie des cellules (Figure 2). Les cellules de désolidarisation de la matière plastique de culture peuvent donner des résultats faussement positifs.

4. Nettoyage de Bonneterie titane échafauds

  1. Placet jusqu'à 5 échafauds dans un tube à réaction de 50 ml.
  2. Laver l'échafaudage (épaisseur 6-7 mm) trois fois avec 30 ml d'eau distillée désionisée pendant 20 minutes à la température ambiante, en utilisant des conditions de rotor (8 xg).
  3. Remplacer l'eau distillée désionisée avec 30 ml de 1% (p / v) de Triton-X-100 solution (dissous dans de l'eau distillée désionisée), puis laver les échafauds une fois pendant 20 min à température ambiante, en utilisant des conditions de rotor (8 xg) .
  4. Jeter la solution de Triton-X-100 suivie d'un lavage avec 30 ml d'eau distillée désionisée deux fois (5 min à chaque fois à la température ambiante), le maintien des conditions de rotor (8 xg).
  5. Remplacer l'eau distillée désionisée. Rincer le échafauds séquentiellement avec qualité réactif 99% d'acétone, isopropanol à 99% et 99% d'éthanol (30 ml chacune) pour 2 x 5 min chacun dans un bain à ultrasons (~ 50 Hz, 50 W, 220-240 V).
  6. Laver de nouveau trois fois avec 30 ml d'eau distillée désionisée pendant 5 min, en maintenant constant le bain de traitement par ultrasons.
  7. Placez le Scaffolds sur un tissu non pelucheux afin d'aérer sécher pendant la nuit à la température ambiante.
  8. Autoclave l'échafaud pendant 15 min à 121 ° C avec 15 psi.
  9. Confirmer le protocole de nettoyage par fluorescence indirecte comme décrit dans le protocole 5.

5. Imagerie Scaffold Structures par immunofluorescence indirecte

REMARQUE: Le présent protocole décrit l'imagerie des structures d'échafaudage par fluorescence indirecte en utilisant le fluorophore sulforhodamine B qui donne une fluorescence rouge vif à une longueur d'onde ex / em de 565/586 nm. Cependant, le fluorophore peut être changé pour un meilleur ajustement pour les réglages du microscope donnés ou possible auto-fluorescence de l'échafaudage.

  1. Préparer la solution sulforhodamine B de coloration (0,04%) dans de l'acide acétique à 1% et conserver à température ambiante à l'abri de la lumière.
  2. Prenez une plaque de culture tissulaire de 24 puits et de plonger l'échafaud nettoyé dans 500 pi de la solution de coloration sulforhodamine B en le plaçant inside le puits en utilisant une pince.
  3. Capturez les images négatives de l'échafaudage en utilisant un microscope à fluorescence.
    1. Prenez des photos avec une DP LED cube / filtre défini avec une longueur d'onde d'excitation de 531/40 nm et une longueur d'onde d'émission de 593/40 nm. Vous pouvez également choisir l'excitation et d' émission de longueur d' onde adéquate avec l'aide de la fluorescence spectrale spectateur 20. Sulforhodamine B a son excitation de pic à 578 nm et son pic d'émission à 593 nm.
    2. Afin de visualiser la structure d'échafaudage, de prendre des photos à des grossissements inférieurs, par exemple, 4X ou 10X (Figure 3). L' utilisation de ces images, déterminer les caractéristiques, par exemple, la taille des pores et la forme avec l'aide de l'ImageJ.
    3. Afin de détecter les impuretés d'échafaudage, de prendre des photos à des grossissements plus élevés, par exemple, 20X ou 40X, étant donné que cela va limiter la profondeur d'analyse. Veiller à ce que les particules de saleté / substances ne sont pas visibles (voir les résultats représentatifs; Figure 3).

6. biocompatibilité in vitro Dosage

  1. Préchauffer le milieu de culture à 37 ° C dans un bain d'eau.
  2. Prenez une plaque de culture tissulaire 24 puits et en utilisant une pince, placez les échafauds nettoyés et stérilisés dans chaque puits de test aseptique. Travailler sous l'enceinte de sécurité biologique pré-nettoyée I!
  3. Faire tremper / incuber les échafauds avec un milieu de culture pendant environ 15 min (500 pi par puits d'une plaque de culture tissulaire de 24 puits), afin d'éliminer l'air à l'intérieur de l'échafaudage.
  4. Pendant ce temps, remettre en suspension les cellules 500000 SCP1 Ad-GFP infectées dans 1 ml de milieu de culture.
  5. Après 15 min d'échafaudage de trempage, aspirer le milieu complètement l'échafaud.
  6. Pour l'ensemencement des cellules sur l'échafaud, distribuer 100 pl de suspension cellulaire avec précaution sur l'échafaud (qui est placé dans la plaque de 24 puits) surface. Maintenir un volume de suspension cellulaire pendant l'ensemencement des cellules, de manière à assurer qu'aucun fluide circule out de l'échafaud.
  7. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire standard (5% de CO 2, 20% de O 2 et 90% d' humidité).
  8. Ajouter 500 ul plus milieu de culture et incuber pendant 24 heures dans l'incubateur de culture cellulaire standard (37 ° C, 5% de CO 2, 20% O 2 et 90% d' humidité).
  9. Évaluer le motif d'adhérence cellulaire et de la cellule d'étalement sur la surface de l'échafaudage à l'aide d'un microscope à fluorescence.
    1. Prenez des photos avec une GFP LED cube / filtre défini avec une longueur d'onde d'excitation de 470/22 nm et une longueur d'onde d'émission de 510/42 nm. Vous pouvez également choisir l'excitation adéquate et d'onde d'émission à l'aide de la visionneuse spectrale fluorescence. GFP a son excitation de pic à 488 nm et son pic d'émission à 507 nm.
    2. Afin de visualiser l' adhérence cellulaire modèle de capturer des images à des grossissements inférieurs, par exemple, 4X ou 10X (figure 4). Afin d'observer l'étalement cellulaire un mag supérieurnification (au moins 100X) est nécessaire - limiter la profondeur de mise au point.
  10. Pour évaluer davantage l' épandage sur la surface d'échafaudage cellulaire, fixer les cellules avec 4% de formol et de procéder à la coloration de fluorescence conventionnelle des structures cellulaires, par exemple, des filaments d'actine (phalloïdine). Cependant, l' adaptation des temps d'incubation et le marquage fluorescent des anticorps afin d'adapter les caractéristiques d'échafaudage individuels, par exemple, les temps de diffusion ou auto-fluorescence 14.
  11. Le lendemain, changer le milieu de culture pour éliminer les cellules non-adhérentes.
  12. Calculer le pourcentage de cellules adhérentes sur l'échafaud par la résazurine mesure de conversion comme décrit dans le protocole 7.

figure-protocol-2
Figure 5: Chronologie de l' essai in vitro (A) Montage expérimental pour le placage des cellules.. (B ) Illustration de la procédure, en insistant sur ​​l' importance du protocole de début et de validation de la fonctionnalité cellulaire jusqu'au jour 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

mesure 7. résazurine Conversion

REMARQUE: résazurine essai de conversion est utilisée pour mesurer l'activité mitochondriale et donc indirectement la prolifération cellulaire. Réduction de la résazurine à la résorufine génère un signal fluorescent, qui est basé sur l'activité mitochondriale associée au nombre de cellules viables (Figure 7A).

  1. Complètement aspirer le milieu de culture des cellules SCP-1 et le jeter dans un conteneur de déchets.
  2. Laver les cellules SCP-1 une fois avec DPBS pour éliminer les cellules détachées. Ajouter 500 DPBS ul par puits de la plaque de culture tissulaire de 24 puits contenant SCP-1 cellules sur l'échafaud.
  3. Couvrir les cellules avec un h nécessaireontant de solution de résazurine de travail stérile (0,25% de résazurine dans un milieu de culture) et incuber à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire standard (5% de CO 2, 20% de O 2 et 90% d' humidité) pendant 30 min.
    1. Prenez note que; le temps d'incubation dépend du type de cellule et la densité cellulaire. Elle peut varier entre 10 minutes et 6 heures. temps d'incubation Optimisé pour SCP-1 cellules est de 30 min.
  4. En tant que contrôle d'arrière - plan, y compris au moins un puits avec la solution de travail de la résazurine , mais sans cellules, qui est mis à incuber à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire standard (5% de CO 2, 20% de O 2 et 90% d' humidité) pour le même quantité de temps.
  5. Transfert 100 ul conditionnés surnageant de chaque puits de la plaque de culture tissulaire de 24 puits dans une plaque à 96 puits.
  6. Laver les cellules restantes trois fois avec 1 ml DPBS pendant 5 min à température ambiante afin d'éliminer la solution de travail de résazurine résiduel. Après le troisième lavage ajouter un milieu de culture to les implants avec SCP-1 cellules (500 ul par puits de la plaque de culture tissulaire de 24 puits) et poursuivre l' incubation à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire standard (5% de CO 2, 20% O 2 et 90% d' humidité) pour d'autres mesures de temps de parcours.
    1. Assurez-vous de mettre en place réplicats à cette étape (2-4) afin de minimiser les erreurs de pipetage.
  7. En attendant, placer la plaque à 96 micropuits dans le lecteur de microplaques et de mesurer la fluorescence de la résorufine formée.
    1. Afin de réduire le signal de fond, de mesurer la fluorescence à une longueur d'onde d'excitation de 545 nm et une longueur d'onde d'émission de 585 nm.
    2. Vous pouvez également choisir l'excitation adéquate et d'onde d'émission à l'aide de la visionneuse spectrale fluorescence. Résorufine a son excitation de pic à 572 nm et son pic d'émission à 585 nm. L'intensité du signal donné est une moyenne de 25 lectures individuelles (25 flashs par puits).
  8. Mesurer la fluorineescence de résorufine formée dans un milieu conditionné, en utilisant une optique de fond.
    1. Prenez note que le gain dépend de la quantité moyenne de résazurine converti et peut varier entre 10 et 4000. Ajuster le gain du lecteur de microplaques individuel utilisé par pipetage une courbe standard de résorufine, de telle sorte que le signal fluorescent est inférieure à 80% de l'intensité maximale du signal détectable (dans ce cas, 20 000). Le gain optimisé pour SCP-1 cellules est de 800.
  9. Soustraire le signal de fond (résazurine solution de travail sans cellules) à partir du signal des échantillons d'essai.
  10. En fonction de la configuration expérimentale / fin, procéder à d'autres étapes:
  11. Calculer le pourcentage de viabilité des cellules sur l'échafaud en utilisant une courbe standard. Faire une courbe standard individuelle séparément pour chaque lignée cellulaire utilisée.
  12. Analyser la croissance / prolifération cellulaire par l'estimation de l'augmentation relative de la conversion de la résazurine pendant toute la durée de la culture. Pour ce calcul, définissezla conversion de résazurine le jour 1 comme référence. Fraîchement préparer la solution de travail de résazurine pour ce genre d'analyse. En outre, des temps d'incubation doivent être égaux entre les différentes mesures.
  13. Répétez l'ensemble du protocole de mesure de la conversion résazurine au moins trois fois pour obtenir des résultats cohérents.

8. Coloration en direct mort

  1. Plaque les cellules SCP1 sur l'échafaud avec une densité de semis de 50.000 cellules / échafaudage et lui permettre de se développer sur l'échafaud en gardant les conditions de culture cellulaire standard (voir protocole 1 et 2).
  2. Après 24-48 h Aspirer complètement le milieu de culture des cellules SCP-1 et le jeter dans un conteneur de déchets.
  3. Laver les cellules SCP-1 une fois avec DPBS pour éliminer les cellules détachées. Ajouter 500 ul de DPBS par puits de la plaque de culture tissulaire à 24 puits et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
  4. Tache SCP-1 en utilisant les fluorophores (les trois taches en même temps):
    1. À partir de maintenantgarder les échafauds dans l'obscurité afin de protéger le fluorophores blanchiment de la lumière du jour!
    2. Définir un temps d'incubation de 30 min pour permettre une répartition égale tout au long de l'échafaud. Si le transfert à d' autres échafauds, assurez - vous d'optimiser les temps d'incubation pour adapter les caractéristiques d'échafaudage individuels (taille des pores, la profondeur de l' échafaudage, etc.).
    3. Afin de détecter les cellules viables sur l'échafaud, colorer les cellules avec calcéine AM à une concentration finale de 2 uM (en milieu de culture).
    4. Afin de détecter toutes les cellules sur l'échafaud, colorer les cellules avec Hoechst 33342 à une concentration finale de 0,002 pg / pl (en milieu de culture).
    5. Afin de détecter les cellules mortes, incuber l'échafaud avec éthidium homodimère à une concentration finale de 4 uM (dans un milieu de culture).
  5. Après le temps d'incubation, laver les cellules 3 fois avec du DPBS (1 ml par puits) pour chaque 5 min à température ambiante.
  6. Prendre immédiatement l'images en utilisant un microscope à fluorescence.
    1. Prenez des photos de la calcéine (cellules vivantes) avec une GFP LED cube / jeu de filtres (excitation et d'émission de longueur d'onde de 470/22 nm et 510/42 nm, respectivement). Vous pouvez également choisir une excitation adéquate et d'onde d'émission à l'aide de la visionneuse spectrale fluorescence. Calcéine a son excitation de pic à 488 nm et son émission de pic à 507 nm. Remarque: Assurez-vous de ne pas utiliser les cellules transfectées GFP pour la coloration fluorescente avec calcéine ou d'autres taches fluorescentes vertes.
    2. Prenez des photos de la Hoechst 33342 avec un DAPI LED cube / filtre défini avec une longueur d'onde d'excitation de 357/44 nm et une longueur d'onde d'émission de 447/60 nm. Vous pouvez également choisir l'excitation adéquate et d'onde d'émission à l'aide de la visionneuse spectrale fluorescence. Hoechst 33342 a son excitation de pic à 347 nm et son pic d'émission à 483 nm.
    3. Prenez des photos de l'homodimère d'éthidium avec un cube / jeu de filtres DP LED (excitation et d'émission de longueur d'onde of 531/40 et 593/40 nm nm, respectivement). Vous pouvez également choisir l'excitation adéquate et d'onde d'émission à l'aide de la visionneuse spectrale fluorescence. Éthidium homodimère a son excitation de pic à 530 nm et son pic d'émission à 618 nm.

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Résultats

Les résultats préliminaires ont montré que le nouvel implant de noyau décrit non seulement a de bonnes caractéristiques d'amortissement, mais aussi est biocompatible avec SCP-1 cellules. Au cours du processus de l'implant de la production, il entre en contact avec des substances solides corrosifs et toxiques (lubrifiant, mordançage solution, électro-polissage). Avec l'aide de techniques indirectes de coloration fluorescente , nous avons pu visualiser les impuretés restantes e...

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Discussion

La surface de l' échafaudage joue un rôle important dans son interaction avec les tissus environnants in vivo , en déterminant ainsi la longévité des implants fonctionnels. Par conséquent, la biocompatibilité de l'échafaudage est étudié par des essais in vitro en utilisant des cellules (lignée cellulaire SCP1), lorsque plaqué sur les échafauds.

techniques de microscopie qui fonctionnent bien avec échafauds minces et optiquement transparents sont mal adaptés pour les...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. Aucune partie du travail a été ou est actuellement à l'étude pour publication ou a été publiée ailleurs.

Remerciements

Le projet est financé en partie par Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. La taxe de publication a été couvert par le traumatisme hôpital BG Tübingen, Allemagne.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
6/24/48 plaques de culture, Fiole de culture T25/ T75Greiner Bio-One GmbH*
* Plaques 24 puitsGreiner Bio-One GmbHCELLSTAR 662 160
* 48 plaques de puitsCorning Incorporated USA3548
* Plaques 6 puitsFalcon353046
* T25Greiner Bio-One GmbH690 175
* T75Greiner Bio-One GmbH658 175
Acide acétique, purum &ge ; 99.0 %Carl Roth3738.4
AcétoneCarl Roth5025.1
Axioplan-2  ;Carl Zeiss, Allemagne
Enceintes de sécurité biologiqueThermo Scientificsafe 2020
Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM)Sigma17783
Cell Culture IncubtatorBinder, Tuttlingen, Germany9040-0078
Unité de filtration (0.22 µ ; m)Millipore, IRLSLGP033RS
Centrifugeuses 5810 R et 5417 RThermo Fisher Scientific, NYMegafuge 40R
Dimethylsulfoxyde (DMSO)Carl Roth4720.2
Dulbecco' s PBS sans Ca & MgSigmaH15-002
Éthanol à 99 %  ; SAV liquid prod. GmBH475956
Ethidium homodimèreSigma46043
EVOS Système d’imagerie par fluorescencetechnologiesAMF4300
Fetal Bovine Serum (FCS)Gibco10270-106
HemocytometerHausser Scientific, PA, USA
Hoechst 33342Sigma14533-100MG
Implant de noyau de titane tricotéBuck co & KG, Allemagne
MEM Alpha Modification avec Glutamine sans nucléosideSigmaE15-832
Lecteur de microplaques OmegaBMG Labtech, AllemagneFLUOstar Omega
Pénicilline/StreptomycineSigmaP11-010
Sel de sodium de résazurineSigma199303-1G
Sel de sodium de sulforhodamine BSigmaS1402-1G
Rotateur de tube à essaiLabinco B.V., Pays-BasModèle LD-76
TRIS (hydroxyméthyl) aminométhaneCarl RothAE15.1
TritonCarl Roth3051.2
Trypan Blue 0.5 %Carl RothCN76.1
Trypsine/EDTASigmaL11-004
Life

Références

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