Article de méthode

Création et la Transplantation d’une feuille adipeux dérivées de cellules souches (ASC) dans un modèle de cicatrisation diabétique

DOI :

10.3791/54539

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4 août 2017

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1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Cellules souches dérivées d’adipeux (ASCs) sont facilement isolées et récoltées dans la graisse des rats normaux. Feuilles de NCP peuvent être créés à l’aide de la cellule-fiche technique et peuvent être transplantés dans Zucker rats gras diabétiques présentant pleine épaisseur défauts avec OS exposé de l’épiderme et ensuite recouvert d’une double couche de peau artificielle.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La peau artificielle a obtenu des résultats thérapeutiques considérables dans la pratique clinique. Toutefois, les traitements de peau artificielle pour plaies chez les diabétiques avec débit sanguin entravé ou grandes plaies pourraient être prolongées. Thérapies cellulaires sont apparus comme une nouvelle technique pour le traitement des ulcères diabétiques, et ingénierie cellulaire-feuille a amélioré l’efficacité de la transplantation de cellules. Plusieurs rapports ont suggéré que les cellules souches dérivées d’adipeux (ASCs), un type de cellules stromales mésenchymateuses (CSM), présentent un potentiel thérapeutique en raison de leur abondance relative dans les tissus adipeux et leur accessibilité pour la collection par rapport à MSCs provenant d’autres tissus. ASCs semblent donc être une bonne source de cellules souches pour un usage thérapeutique. Dans cette étude, les feuilles de l’ASC de la graisse adipeuse dans l’épididyme de rats normaux de Lewis ont été avec succès créés à l’aide de température Pétri et normal milieu de culture contenant de l’acide ascorbique. Les feuilles de l’ASC ont été transplantés à des rats diabétiques gras (ZDF), Zucker, un modèle de rat de diabète de type 2 et d’obésité, qui présentent une diminution la cicatrisation. Une blessure apparue sur la surface crânienne postérieure, feuilles de l’ASC ont été transplantées dans la plaie et une peau artificielle bicouche a servi à couvrir les feuilles. Rats ZDF qui a reçu les feuilles de l’ASC avaient mieux la guérison des plaies que les rats ZDF sans la transplantation des feuilles de l’ASC. Cette approche a été limitée car les feuilles de l’ASC sont sensibles aux conditions sèches, nécessitant le maintien d’un environnement humide. Par conséquent, la peau artificielle a servi à couvrir la feuille de l’ASC pour éviter le dessèchement. La greffe allogénique de feuilles de l’ASC en combinaison avec la peau artificielle pourrait également s’applique aux autres ulcères insolubles ou des brûlures, tels que ceux observés avec les maladies artérielles périphériques et maladie du collagène et peut être administrée aux patients qui souffrent de malnutrition ou utilisent des stéroïdes. Ainsi, ce traitement pourrait être la première étape visant à améliorer les options thérapeutiques pour diabétique wound healing.

Introduction

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La population de patients diabétiques est en augmentation partout dans le monde et a atteint 400 millions en 2015,1; environ 15 à 25 % des patients atteints de diabète sont menacées par la progression d’un ulcère diabétique de bas-extrémité2. Les ulcères diabétiques de bas-extrémité sont insolubles et peuvent nécessiter une période thérapeutique prolongée avec formation de réadaptation après une récupération complète. Une période longue thérapie souvent se traduit par une réduction significative de la qualité de vie des patients. Ainsi, les nouvelles thérapies qui diminuent ou empêchent aggravation doivent être développés pour le traitement des plaies diabétiques. Pour évaluer la guérison des plaies diabétiques, nous avons optimisé un ulcère diabétique cicatrisation modèle chez les rats, qui imite les conditions cliniques pratiques, et évalué si repiquage feuilles adipeux dérivées de cellules souches (ASC) à l’aide de cellules feuilles génie accéléré la guérison des plaies.

Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) présentent un excellent potentiel pour accélérer la cicatrisation des plaies en raison de leur capacité d’autorenouvellement, leurs effets immunomodulateurs et leur capacité à se différencier en divers de lignées cellulaires3. CRA est un type de MSC provenant de tissus adipeux, et ils présentent plusieurs avantages sur MSCs dérivés d’autres tissus, y compris leur potentiel angiogénique et paracrine activité4,5. Le tissu adipeux est relativement abondant dans le corps humain, et son accessibilité permet à la collection à l’aide de procédures minimalement invasives. Par conséquent, CRA ont été utilisées expérimentalement pour la cicatrisation des applications,6,,7.

Les rapports précédents ont montré que l’injection directe de suspensions MSC unicellulaires dans les zones autour des blessures peut accélérer la cicatrisation des8,9. Cependant, malgré les rapports de l’accélération de la cicatrisation dans les modèles d’ulcère diabétique après l’injection des suspensions de cellules individuelles, le temps de survie des cellules transplantées à la plaie n’est pas clair.

Dans cette étude, nous avons appliqué des cellules feuilles ingénierie utilisant Pétri de température. Ces plats ont la température polymère de N- isopropylacrylamide covalente sur leur surface10. La couche de polymère greffé permet à adhérence cellule isotherme à ou détachement de la surface de la boîte de Pétri. La surface du plat devient hydrophobe à 37 ° C, permettant aux cellules d’adhérer et se multiplient, tandis que les cellules spontanément se détachent de la surface quand il devient hydrophile à une température inférieure à 32 ° C. Les cellules cultivées peuvent être récoltées comme une feuille de cellules contiguës avec des jonctions cellule-cellule intactes et matrices extracellulaires (ECMs) simplement en réduisant la température ; ainsi, des enzymes protéolytiques qui endommagent l’ECM, tels que la trypsine, ne sont pas requis11. Par conséquent, ingénierie cellulaire-feuille peut préserver les connexions de cellule-cellule et améliorer l’efficacité de la transplantation de cellules.

En outre, transplantation de cellules feuilles augmente les taux de survie des cellules par rapport aux cellules injection12. Dans ce protocole, Zucker les rats diabétiques gras (ZDF) ont été sélectionnés comme un modèle de type 2 diabète et l’obésité avec retard de cicatrisation. Rats ZDF développent spontanément l’obésité à environ 4 semaines. Puis, ils développent le diabète de type 2 avec l’obésité entre 8 et 12 semaines d’âge, à quel point ils présentent l’hyperglycémie associé à l’insulino résistance, la dyslipidémie et hypertriglycéridémie13. Retardé la cicatrisation, diminution du débit sanguin dans les vaisseaux sanguins périphériques et la néphropathie diabétique sont également observées14,15,16. En outre, les rats ZDF pourraient être un modèle approprié pour l’étude de la guérison des ulcères cutanés insolubles, tels que les ulcères diabétiques.

Les différences entre les humains et les rongeurs dans les mécanismes de cicatrisation sont associés à des différences anatomiques de la peau. La cicatrisation chez les rats normaux est basée sur la contraction de la plaie, alors que la cicatrisation des plaies chez l’être humain repose sur la formation réépithélialisation et tissu de granulation. En général, plaie éclisser utilisés dans les modèles de rongeurs contribue à minimiser la contraction de la plaie et permet la formation progressive du tissu de granulation17, bien que les blessures chez les rats non diabétiques sont presque complètement fermés par contraction. Cependant, les diabétiques plaie contraction chez ZDF rats est altérée, et la cicatrisation surtout s’effectue via la réépithélialisation et formation de tissu de granulation ; ainsi, ce processus est plus semblable à l’humaine14de cicatrisation.

Plaies diabétiques avec un OS exposé après débridement sont souvent rencontrés sur le plan clinique. Des études antérieures ont examiné plaies peau pleine épaisseur 12 mm de diamètre sur le dos des athymiques souris Nudes18,19 et blessures de peau pleine épaisseur 10 mm de diamètre sur le dos des souris normales20. Pour développer un modèle clinique de graves plaies diabétiques, plus gros défauts de peau pleine épaisseur (15 x 10 mm2) avec exposés des os et sans le périoste ont été créés, comme décrit précédemment21chez des rats souffrant de diabète de type 2 et de l’obésité.

Feuilles de NCP (SRAC) rat de l’ASCs des rats normaux de Lewis ont été créés par le biais de la greffe allogénique de feuilles de l’ASC. Dans la pratique clinique, autogreffe est irréalisable, parce que les patients diabétiques avec ulcères présentent souvent des complications du diabète sévères, tels que la glycémie élevée incontrôlée et indices de masse corporelle élevé et ces troubles de cicatrisation cause des complications qui augmentent la difficulté d’obtenir des tissus adipeux chez ces patients. En outre, CRA d’animaux avec pièce de diabète modifié les propriétés et troubles de fonction22. Par conséquent, le protocole présenté ici décrit la transplantation allogénique de SRAC feuilles des rats normaux et l’application de la peau artificielle aux rats diabétiques.

La peau artificielle utilisée dans le présent protocole en bicouche empêche la contraction spontanée des blessures, favorise la synthèse d’une nouvelle matrice de tissu conjonctif et ressemble à la vrai derme23. Dans ce protocole, la peau artificielle est placée sur une feuille de la SRAC et fixe avec des fils de nylon pour empêcher la contraction de la plaie ou l’élargissement résultant de peau lâche rat. En outre, la peau artificielle fournit un cadre tridimensionnel pour les feuilles de l’ASC, maintient un milieu humide pour les transplantés feuilles ASC et plaies et protège les plaies de l’infection et de forces extérieures. Enfin, un pansement non adhésif est placé sur la plaie pour le protéger des chocs externes, maintenir un environnement humide et absorber l’exsudat.

Une feuille de la SRAC est mince, souple et déformable et déplacement de sites destinataires, comme un battement cardiaque24peut être respectée. Ingénierie cellulaire-feuille a été utilisée pour la reconstruction de divers tissus et peut générer des effets curatifs25,26. Feuilles de NCP qui présentent un potentiel thérapeutique clinique peuvent accélérer la guérison de nombreux types de plaies. Par ailleurs, la transplantation allogénique de feuilles de l’ASC, combinée à l’utilisation de la peau artificielle, pourrait être applicable au traitement des ulcères insolubles ou des brûlures, tels que ceux observés dans la maladie artérielle périphérique ou maladie du collagène, ou ils peuvent être administrés aux patients qui souffrent de malnutrition ou utilisent des stéroïdes. Cette approche augmente l’efficacité de la transplantation ASCs. Le modèle de rat ZDF cicatrisation produit un état de grave blessure qui ressemble la processus de cicatrisation humaine et imite les conditions cliniques chez un animal expérimental de petite taille.

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Protocole

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Tous les protocoles expérimentaux présentés ci-dessous ont été approuvés par le Comité du bien-être animal de la faculté de médecine de l'Université de médecine féminine de Tokyo et ont respecté toutes les exigences des Directives pour la bonne conduite des expériences sur les animaux.

1. Préparation des animaux, des instruments, des milieux de culture et des plats

  1. Préparez le milieu de culture complet en utilisant le minimum de milieu essentiel alpha contenant 20 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Conservez-le pendant plusieurs mois à 4 °C jusqu’à utilisation.
  2. Utilisez des rats ZDF mâles adultes comme modèle d’obésité diabétique de type 2. Utilisez le coussinet adipeux de rats Lewis mâles pour isoler le tissu adipeux afin de préparer les feuilles cellulaires.

2. Isolement et culture des rASCs

  1. Obtenez du tissu adipeux de rats Lewis (âgés de 8 à 33 semaines, mâles) sous anesthésie générale à l’aide d’isoflurane.
    1. Préparez un ventilateur mécanique pour rongeurs et 4 % d’isoflurane. Préparez plusieurs embouts en coton stériles, des gazes propres, un scalpel, un porte-aiguille, des ciseaux opératoires, une paire de pinces et une suture en nylon 5-0. Stérilisez les instruments et les fournitures chirurgicales.
    2. Préparez une boîte de Pétri de 100 mm avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile pour préserver temporairement le tissu adipeux obtenu. Pesez la boîte de Pétri avec PBS à l’aide d’une balance avant de commencer l’intervention chirurgicale pour mesurer le tissu adipeux collecté. Disposez les instruments et les fournitures chirurgicales sur un champ stérile.
    3. Anesthésier les rats en utilisant de l’isoflurane à 3 à 4 % à l’aide d’un ventilateur mécanique pour rongeurs et maintenir les rats à 2 à 3 % d’isoflurane pendant la chirurgie. Surveillez la profondeur de l’anesthésie en observant la profondeur et le rythme respiratoire de chaque rat.
    4. Tout en portant des gants stériles, positionnez le rat en position couchée sur un champ stérile. Rasez la zone opératoire avec un rasoir électrique et nettoyez la partie abdominale du rat à l’aide d’une gaze stérile imbibée d’éthanol à 70 %.
    5. Créez une incision cutanée d’environ 5 cm de long à l’aide d’un scalpel dans la partie inférieure latérale de l’abdomen du rat. Exposez et disséquez le muscle oblique externe. Ensuite, exposez le tissu adipeux épididymaire entourant l’épididyme. Tirez doucement le tissu adipeux épididymaire vers l’extérieur.
      REMARQUE : Le tissu adipeux peut être obtenu de chaque côté de l'abdomen du rat.
    6. Exciser uniquement le tissu adipeux épididymaire pour éviter d’endommager l’épididyme, les testicules et les vaisseaux sanguins de l’épididyme (Figure S1). Faites tremper le tissu adipeux excisé dans le PBS dans la boîte de Pétri pour éviter la sécheresse et peser le tissu.
    7. Fermez le muscle abdominal avec du VICRYL 5-0 et la peau avec une suture en nylon 5-0. Ensuite, retournez chaque rat qui a subi une intervention chirurgicale dans une cage séparée (un rat par cage).
      REMARQUE : Surveillez les rats jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement.
  2. Isolez les rASCs à partir de 2 à 3 g de tissu adipeux (excisé sur un rat Lewis et traité selon une méthode précédemment rapportée)27. Digérer brièvement et par voie enzymatique le tissu adipeux excisé avec 0,1 % de collagénase de type A à 37 °C pendant 1 h pour obtenir la fraction stromo-vasculaire (SVF ; Figure S2).
    1. Préparez plusieurs crépines de cellules de 100 m, plusieurs tubes de 50 ml, plusieurs tubes de 15 ml et deux scalpels sur une paillasse de nettoyage biologique. Allumez une centrifugeuse et faites chauffer un bain-marie à 37 °C. De plus, préparer environ 50 mL de PBS stérile dans un tube de 50 mL avec 0,1 % (concentration finale) de collagénase de type A.
    2. Coupez le tissu adipeux en petits morceaux à l’aide de deux scalpels.
    3. Déplacez tout le tissu adipeux haché dans un tube de 50 ml et ajoutez du PBS pour porter le volume total à 15 ml.
    4. Laisser reposer le tube de 50 ml à la verticale pendant 5 min. Jeter la couche supérieure et recueillir la couche inférieure, à l’exception des débris.
    5. Ajouter 0,1 % de solution de collagénase de type A dans le tube de 50 mL avec du PBS contenant la couche supérieure afin de digérer par voie enzymatique le tissu adipeux.
      REMARQUE : Réchauffer environ 20 ml de PBS pour 2 à 3 g de tissu adipeux dans un bain-marie à 37 °C.
    6. Inclinez et agitez doucement le tube de 50 ml à 120 - 130 tr/min pendant 1 h dans un bain-marie à 37 °C.
    7. Laisser reposer le tube de 50 ml à la verticale pendant 5 minutes après l’avoir secoué.
    8. Filtrez la solution à l’aide d’une crépine de 100 μm et versez la solution dans un nouveau tube de 50 mL. Répartir la solution filtrée dans deux tubes de 15 ml.
    9. Centrifuger la solution dans les tubes de 15 mL pendant 5 min à 700 x g. Retirer délicatement la couche supérieure de surnageant et laisser 5 mL de la couche inférieure de la solution. N’aspirez pas le plomb.
    10. Ajouter environ 5 ml de milieu de culture complet dans chaque tube de 15 ml, jusqu’à 10 ml par tube de 15 ml, et remettre délicatement la pastille en suspension.
    11. Répétez les étapes 2.2.8 et 2.2.9. Ensuite, obtenez le SVF.
  3. Préparez deux plats de culturede 60 cm 2. Recueillir la FVS après deux centrifugations à 700 × g pendant 5 min. Suspendre le FVS et déposer 10 mL de solution de FVS dans chaque boîte deculture de 60 cm 2.
  4. Cultivez les plats pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2.
  5. Préparez du PBS et de l’acide tétraacétique (EDTA) trypsine-éthylènediamine (EDTA) à 0,25 %, conservables pendant plusieurs mois à 4 °C jusqu’à utilisation.
  6. Après le placage initial (24 h), lavez les cellules avec du PBS 3 fois pour éliminer les cellules détachées et les débris. Ajouter du milieu complet frais.
  7. Passage des cellules qui sont presque sous-confluentes le jour 3. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 3 à 5 min
    REMARQUE : Terminez l’étape de trypsinisation dans les 10 minutes pour éviter d’endommager les cellules.
  8. Observez les cellules au microscope optique après la trypsinisation pour confirmer que toutes les cellules se sont complètement détachées des plats. Ensuite, ajoutez 9 ml de milieu de culture complet dans les plats.
  9. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  10. Sous-culture des cellules à une densité de 1,7 x 103 cellules/cm2 tous les 3 jours jusqu’au passage 3. Cultivez les cellules sous-cultivées à 37 °C dans l’atmosphère humidifiée d’un incubateur à 5 % de CO2.

3. Création des feuilles rASC

  1. Préparez plusieurs plats de culture de 35 mm de diamètre sensibles à la température. Pré-enduire la vaisselle de FBS (ou d’un milieu complet contenant du FBS) à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant plus de 1 h
    REMARQUE : Une boîte de culture sensible à la température de 35 mm de diamètre est un produit disponible dans le commerce.
  2. Préparez une plaque thermique et incubez à 37 °C pour les procédures expérimentales suivantes.
    REMARQUE : Effectuez chaque procédure à l’aide de boîtes de culture sensibles à la température sur une plaque thermique à 37 °C pour éviter que les cellules ne se détachent spontanément de la boîte.
    1. Réchauffer l’ensemble du milieu de culture utilisé dans les procédures à 37 °C avant l’expérimentation.
    2. Passage des graines de 3 rASC dérivées de rats Lewis dans une boîte de culture sensible à la température de 35 mm de diamètre à une densité de 1,5 x 105 cellules/boîte pendant 3 jours en utilisant un volume total de 2 mL de milieu de culture complet.
      REMARQUE : Lorsque les rASC sont placés sur une nouvelle boîte de culture, la boîte doit être lentement balancée d’avant en arrière et de gauche à droite dans un incubateur pour obtenir un ensemencement uniforme des rASC et une feuille de rASC uniformément épaisse.
    3. Remplacer 2 mL du milieu par 2 mL de milieu de culture complet contenant 16,4 μg/mL d’acide L-ascorbique, de phosphate, de sel de magnésium, de n-hydrate (AA) le jour 3 après l’ensemencement dans les boîtes de culture sensibles à la température incubées sur une thermoplaque à 37 °C.
      REMARQUE : L’AA dissous peut être stocké à -30 °C pendant des mois.
    4. Cultivez les cellules pendant 4 à 5 jours supplémentaires et remplacez le milieu tous les 2 jours par un milieu frais contenant de l’AA.
    5. Confirmez la prolifération et la génération d’ASC au microscope optique pour déterminer si des espaces se sont produits entre les cellules d’un feuillet de cellules contiguës.
  3. Transférez les feuilles cellulaires de l’incubateur sur la paillasse pendant 15 à 20 minutes pour les refroidir à température ambiante. Observez les cellules se détacher spontanément en tant que feuille cellulaire contiguë. Récoltez la feuille rASC de la surface du plat à l’aide d’une paire de pinces.
    REMARQUE : Habituellement, les feuilles rASC peuvent être manipulées avec une paire de pinces. Si nécessaire, une membrane de transfert peut être utilisée pour transférer une feuille cellulaire de la boîte de culture au site de la plaie si la feuille cellulaire est cassante et fragile.

4. Préparation du modèle de plaie de défaut de peau de pleine épaisseur et transplantation de feuilles rASC

  1. Préparez un ventilateur mécanique pour rongeurs et 4 % d’isoflurane. Préparez plusieurs embouts en coton stériles, une gaze propre, une suture en nylon 5-0, un scalpel, une râpe périostée, un porte-aiguille, des ciseaux opératoires et une paire de pinces. Stérilisez les instruments et les fournitures chirurgicales. Disposez les instruments et les fournitures chirurgicales sur un champ stérile.
  2. Préparez le PBS et conservez-le à température ambiante, avec de la peau artificielle et un pansement non adhésif. Prédécouper la peau artificielle (15 x 10 mm) et le pansement non adhésif (20 × 15 mm). Trempez la couche interne d’éponge de collagène de la peau artificielle dans une solution saline avant d’utiliser la peau artificielle.
    REMARQUE : La peau artificielle est composée de deux couches : une couche extérieure en feuille de silicone et une éponge de collagène intérieure.
  3. Utilisez des rats ZDF (16 à 18 semaines, mâles, 500 à 600 g) comme modèle de cicatrisation des plaies pour le diabète de type 2 et l’obésité.
  4. Anesthésier les rats ZDF par inhalation d’isoflurane à 4 % à l’aide d’un ventilateur mécanique pour rongeurs. Induire l’anesthésie en utilisant de l’isoflurane à 4 à 5 % via un ventilateur mécanique pour rongeurs et le maintenir à 3 à 4 % pendant la chirurgie. Surveillez la profondeur de l’anesthésie en observant la profondeur et le rythme respiratoire de chaque rat par pincement des orteils.
  5. Tout en portant des gants stériles, positionnez le rat en position couchée sur un champ stérile. Nettoyez la tête du rat à l’aide d’une gaze stérile imbibée d’éthanol à 70 %, rasez la zone opératoire avec un rasoir électrique et nettoyez la peau après le rasage à l’aide d’une gaze stérile imbibée d’éthanol à 70 %.
  6. Créer un défaut cutané carré de pleine épaisseur (15 x 10mm2) sur la tête des rats ZDF anesthésiés en retirant le tissu cutané de l’épiderme vers le périoste. Excise la peau et le tissu cutané à l’aide d’un scalpel et ablation du périoste à l’aide d’une framboise périostée.
  7. Déplacez les rASC sur la boîte de culture sensible à la température de 35 mm de l’incubateur vers un environnement à température ambiante immédiatement avant la transplantation.
  8. Observez les rASC sur la boîte de culture sensible à la température de 35 mm se détacher spontanément de la surface de la boîte sous forme de feuille après la formation d’une plaie. Récoltez les feuilles rASC après 7 jours de culture sur des boîtes de culture sensibles à la température. Retirez le milieu de culture et lavez trois fois la feuille de rASC avec du PBS. Faites tremper la feuille rASC dans du PBS jusqu’à la transplantation pour éviter la dessiccation.
  9. Placez la feuille rASC immédiatement sur le défaut du crâne à l’aide d’une paire de pinces. Si la feuille cellulaire est cassante et fragile, une membrane peut être utilisée comme échafaudage pour transférer la feuille cellulaire de la boîte de culture au site de la plaie.
  10. Couvrez la feuille et le défaut de rASC avec la peau artificielle (15 x 10 mm2) et fermez la plaie avec environ 10 points de suture à l’aide de la suture en nylon 5-0. Pour protéger la plaie, placez un pansement non adhésif (20 x 15 mm2) sur la peau artificielle, à l’aide de sutures en nylon 5-0 pour maintenir l’environnement de la plaie humide et absorber les exsudats.
    REMARQUE : Les pansements non adhésifs seront retirés par les rats ZDF quelques jours après l’application. Par conséquent, il est nécessaire de surveiller régulièrement les rats après la transplantation. Habituellement, le pansement non adhésif est remplacé tous les 2 jours sous anesthésie générale.
  11. Remettez chaque rat qui a subi une intervention chirurgicale dans une cage séparée jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli (un rat par cage). Après une période d’observation, euthanasier les rats en utilisant la méthode approuvée de surdosage d’isoflurane.

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Résultats

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Ce protocole a tenté d’établir une nouvelle thérapie cellulaire pour plaies diabétiques insolubles. Brièvement (comme illustré à la Figure 1), SRAC allogéniques feuilles furent créés à partir des rats normaux, à l’aide de cellules feuilles ingénierie et ont été transplantées ensuite à l’aide d’une double couche de peau artificielle sur un défaut de pleine épaisseur de peau sur un rat diabétique. Images de microscopie photonique d’un bon exemple d’une feuille de la SRAC (<...

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Discussion

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Les étapes plus critiques pour cultiver avec succès une feuille SRAC sont comme suit : 1) la température doit être maintenue à environ 37 ° C au cours de la mise en culture sur les plats de la température de la culture. Lors de la création d’une feuille de la SRAC, chaque procédure a été effectuée sur un thermo-plaque de 37 ° C, et chaque réactif a été chauffé à 37 ° C pour empêcher les cellules de détacher spontanément le plat31. 2) les rats ZDF bénéficiaires doivent être surveillés pour empêcher...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs suivants divulguer des relations financières pertinentes à cette publication : Teruo Okano est fondateur et directeur du Conseil d’administration de cellule Seed Inc., dont les licences de technologie et brevets de l’Université médicale des femmes de Tokyo, et Teruo Okano et Masayuki Yamato sont parties prenantes dans l’Université de médecine de cellule Seed Inc. Tokyo féminines reçoit des fonds de recherche de cellule Seed Inc. Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de relations financières pertinentes à cette publication.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Dr Yukiko Koga du Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Juntendo University School of Medicine, de donner des conseils pratiques. Nous remercions également M. Hidekazu Murata du centre de Tokyo les femmes diabétiques de Medical University School of Medicine excellent soutien technique. Cette étude a été financée par la création de centres d’Innovation pour l’avancée de programme de zones de recherche interdisciplinaire du projet pour les systèmes d’Innovation en développement « cellule feuille Tissue Engineering Center (CCCES) » du ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie (MEXT) du Japon.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
&alpha ;-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Sérum fœtal bovin (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Pénicilline/streptomycineLife Technologies15140-122
Collagénase ARoche Diagnostics10 103 578 001Mannheim, Allemagne
60 cm2 Antenne de culture tissulaire PrimariaBD Biosciences353803Franklin Lakes, NJ
Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline (PBS)Life Technologies1490-144
0,25 % Trypsine-éthylènediamine acide tétraacétique (EDTA)Life Technologies25200-056
Acide L-ascorbique phosphate sel de magnésium n-hydratéWako013-19641
Boîte de culture sensible à la température de 35 mm (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Tokyo, Japon
Plaque microchaude (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Ventilateur mécanique pour rongeursStoelting#50206Wood Dale, IL
4 % isofluranePfizer Japon114-13340-3Tokyo, Japon
Peau artificielle (Pelnac® ; )Smith & NeveuPN-R40060  ; Tokyo, Japon
Pansement non adhésif (Hydrosite plus® ; )Smith & Neveu66800679Connu sous le nom d’Allevyn non-adhessing® ; aux États-Unis
5-0 suture en nylonAlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBESgreiner bio-one227 261
15 mL Tube à centrifugerCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEALHu-FriedyP14Chicago, IL

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
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