Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour générer des microréseaux d’antigènes personnalisables qui peuvent être utilisés pour la détection simultanée d’auto-anticorps IgG et IgM sériques chez l’homme et la souris. Ces réseaux permettent une détection quantitative et à haut débit d’anticorps contre tout antigène ou épitope d’intérêt.

Résumé

Les auto-anticorps, qui sont des anticorps contre les auto-antigènes, sont présents dans de nombreux états pathologiques et peuvent servir de marqueurs de l’activité de la maladie. Les niveaux d’auto-anticorps contre des antigènes spécifiques sont généralement détectés à l’aide de la technique ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Cependant, le dépistage de plusieurs auto-anticorps avec ELISA peut prendre du temps et nécessite une grande quantité d’échantillons de patients. La technique des microréseaux d’antigènes est une méthode alternative qui peut être utilisée pour dépister les auto-anticorps de manière multiplexe. Dans cette technique, les antigènes sont disposés sur des lames de microscope spécialement recouvertes à l’aide d’un microréseau robotisé. Les lames sont sondées avec des échantillons de sérum de patients, puis des anticorps secondaires marqués par fluorescence sont ajoutés pour détecter la liaison des auto-anticorps sériques aux antigènes. Les réactivités des auto-anticorps sont révélées et quantifiées en scannant les lames avec un scanner capable de détecter les signaux fluorescents. Nous décrivons ici des méthodes permettant de générer des microréseaux d’antigènes personnalisés. Nos matrices actuelles sont imprimées avec 9 broches pleines et peuvent inclure jusqu’à 162 antigènes repérés en double. Les réseaux peuvent être facilement personnalisés en changeant les antigènes dans la plaque source utilisée par le microarrayer. Nous avons développé un schéma de détection d’anticorps secondaires bicolore qui permet de distinguer les réactivités IgG et IgM sur la même surface de lame. Le système de détection a été optimisé pour étudier la liaison des auto-anticorps humains et murins.

Introduction

Les auto-anticorps sont présents dans de nombreux états pathologiques et peuvent souvent avoir une activité pathogène directe¹. L’identification des auto-anticorps est importante pour le diagnostic de certaines maladies, pour le pronostic de l’évolution de la maladie et pour la classification des patients susceptibles de bénéficier de thérapies spécifiques². Les auto-anticorps sont généralement identifiés dans le sérum du patient à l’aide de la technique ELISA. Cependant, le dépistage de plusieurs antigènes avec cette technique est laborieux et consomme une grande quantité d’échantillon de patient. De nouvelles technologies sont donc nécessaires pour profiler les auto-anticorps à plus grande échelle.

La technique des microréseaux d’antigènes est une technologie protéomique qui permet de profiler les auto-anticorps de manière multiplex³. Dans la première étape de ce processus, une banque d’antigènes est disposée sur une surface de lame à l’aide d’un microarrayer robotisé. Les lames sont sondées avec du sérum dilué, puis des anticorps secondaires marqués par fluorescence sont ajoutés. Les réactivités des anticorps sont visualisées en scannant les lames à l’aide d’un scanner à microréseaux et quantifiées par des intensités fluorescentes. Les puces à antigènes offrent de multiples avantages par rapport à la technique ELISA dans le dépistage des auto-anticorps : 1) elles n’ont besoin que de quelques microlitres de sérum pour établir le profil des auto-anticorps à plusieurs antigènes simultanément, 2) elles utilisent l’antigène avec parcimonie, car seuls des nanolitres d’antigène sont repérés sur les puces, 3) elles ont une sensibilité accrue³ par rapport à l’ELISA et 4) elles permettent le simultané, détection séparée de plus d’un isotype d’anticorps. Des microréseaux d’antigènes ont été utilisés pour profiler les auto-anticorps dans des maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et le lupus érythémateux disséminé^4-6. Dans ces trois maladies, de nouvelles informations sur la pathogenèse de la maladie ont été obtenues en profilant les auto-anticorps à grande échelle avec les réseaux.

Nous décrivons ici un protocole permettant de générer des microréseaux d’antigènes à l’aide de lames recouvertes de nitrocellulose. Une variété d’antigènes, y compris des protéines, des peptides et des lysats cellulaires, peuvent être disposés sur les lames à l’aide de cette technique. Les réseaux peuvent être facilement personnalisés en incluant des antigènes d’intérêt dans la plaque source qui contient la bibliothèque d’antigènes. De plus, nous montrons comment une paire d’anticorps secondaires peut être utilisée pour séparer les réactivités IgG et IgM sur la même surface de lame. Nous avons maintenant optimisé cette technique pour mesurer les auto-anticorps chez l’homme et la souris.

Protocole

1. dilution Antigènes Generating Antigène Microarrays

1. Diluer les antigènes dans du PBS à une concentration finale de 0,2 mg / ml. Imprimer jusqu'à 162 antigènes uniques en double avec une configuration de puces à ADN de 9 broches. Inclure des IgG et IgM antigènes présents dans la banque d'antigène comme témoins positifs. Inclure PBS seulement comme un contrôle négatif.
2. Ajouter 20 pi de chaque antigène au puits plaque source 384. Ajouter des antigènes à la plaque de source dans des groupes qui reflètent la configuration de la tête d' impression (par exemple, disposer d' antigènes dans des groupes de 9 quand 9 broches sont utilisées pour l' impression).
3. Plaque de source avec une feuille et le gel à -80 ° C jusqu'à ce que prêt à imprimer des tableaux.
4. Nettoyer les repères de la microarrayer solides en les incubant dans un bain de sonication avec de l'eau déminéralisée pendant 3 x 1 min. La place des broches dans le rack à sécher et ensuite organiser des épingles dans microarray tête d'impression. Pour 9 broches, utilisez une configuration 3 x 3.
5. microarrayer de programme pour le tirage en réglant les repères de numéro sur la tête d'impression,nombre de diapositives à imprimer, le nombre de plaquettes sur chaque diapositive, et le nombre de taches réplicats pour chaque antigène. En règle générale, utiliser 9 broches, 70 diapositives, 2 pads / slide, et 2 spots réplicats pour chaque antigène. microarrayer du programme à Soniquer épingles dans l'eau entre les différents groupes d'antigènes.
6. plaque source Thaw et la plaque puis centrifuger pendant 1 min à 100 x g. Placer la plaque de source endroit désigné dans microarrayer. Retirer la partie de la feuille qui recouvre le premier groupe d'antigènes à imprimer.
7. Disposer les diapositives non imprimées sur la surface de arrayer et l'exécution du programme d'impression. Imprimer des diapositives à la température ambiante avec une humidité réglées sur le arrayer à 55 - 60% avec la construction dans l'humidificateur de la machine à matrice.
8. Après chaque groupe d'antigènes est imprimé sur toutes les diapositives, mettre en pause le microarrayer. Couvrir les antigènes qui ont été simplement imprimées avec du papier (pour éviter l'évaporation) et de découvrir le prochain groupe d'antigènes à imprimer. Poursuivre le programme d'impression.
9. Après tous les antigènes ont été imprimés, source de couverture plmangé avec le nouveau morceau de papier et le gel à -80 ° C. Placez les diapositives imprimées dans la boîte coulissante et joint à vide. Les lames peuvent être utilisés le lendemain ou jusqu'à un mois plus tard.

2. Sonder Antigène Microarrays avec Dilué Sera

1. Placez les diapositives dans des cadres à l'aide de chambres d'incubation. Ajouter 700 pi de tampon de blocage (2,5% [vol / vol] fœtal de sérum de veau (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 dans du PBS) à chaque surface de la matrice.
2. Placez un film adhésif sur le cadre et le placer dans un récipient hermétique avec un morceau de tissu humide. Incuber O / N à 4 ° C sur une bascule.
3. Diluer les échantillons de sérum 1: 100 dans un tampon de blocage. Aspirer la solution de blocage de tableaux et ajouter 500 ul d'échantillon dilué dans chaque surface de la matrice.
4. Couvrir avec un film adhésif et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec balancement.
5. Diluer Anticorps secondaires dans un tampon de blocage. Pour les études sur l'homme, on dilue un anticorps IgG de chèvre marqué au Cy3 antihumain à 0,33 pg / ml et une Cy5 de chèvre marqué anti human IgM à 0,25 ug / ml. Pour les études sur la souris, diluer une Cy3 de chèvre marqué à l'anticorps anti-IgG de souris à 0,38 pg / ml et un anticorps marqué par Cy5 IgM anti-souris de chèvre à 0,7 pg / ml.
6. Aspirer échantillons à partir des tableaux et rincer les surfaces du tableau 4 fois avec un tampon de rinçage (0,1% de Tween 20 dans du PBS). Verser le tampon sur des diapositives et feuilleter rapidement.
7. Ajouter 700 pi de tampon de blocage pour laver chaque surface de la matrice et incuber 10 min à température ambiante avec bascule. Répétez l'étape de lavage deux fois de plus.
8. Ajouter 500 pi d'anticorps secondaire dilué dans chaque surface de glissement et couvrir avec un film adhésif. Incuber 45 min à 4 ° C avec balancement.
9. Aspirer mélange secondaire d'anticorps à partir de diapositives et rincer 4 fois comme ci-dessus. Laver les lames 3 fois avec 700 pi de tampon de blocage / de dilution comme ci-dessus.
10. Retirer les lames de cadres et les placer dans la grille coulissante métallique qui est immergé dans du PBS. Incuber 20 min à température ambiante avec agitation orbitale. Placer dans le nouveau conteneur de PBS et incuber une autre 20 mavec agitation.
11. Placer la grille coulissante dans un récipient d'eau désionisée 15 sec. Placer la grille dans un nouveau récipient d'eau et incuber une autre 15 sec.
12. Pour diapositives sèches, lieu glisser la grille sur un adaptateur de plaque ELISA dans la centrifugeuse et de spin à 220 g pendant 5 min à température ambiante.
13. Placez les diapositives dans une boîte étanche à la lumière jusqu'au moment de la numérisation.

3. Numérisation Antigène Microarrays et exportation de données

1. Numériser diapositives à l'aide d'un scanner de puces à ADN permettant de détecter des signaux fluorescents Cy3 et Cy5. Afin d'ajuster les niveaux tube photomultiplicateur (PMT) du scanner, pré-numériser une diapositive qui n'a été sondé avec des anticorps secondaires.
   Note: Cette diapositive doit avoir la bibliothèque de l'antigène complet imprimé sur elle, y compris positive (IgG et IgM) et négatifs (PBS) contrôles. Le pré-scan est un balayage à basse résolution qui permet à l'utilisateur de trouver rapidement les réglages optimaux PMT.
2. Définissez les valeurs PMT de sorte que les traits humains IgG (sur le canal Cy3) et le bourdonnementune des caractéristiques IgM (sur le canal Cy5) ont une même intensité de fluorescence médiane moins arrière-plan (MFI B), (typiquement 40 000). Les niveaux PMT sont réglés en appuyant sur le bouton "hardware". Une fois réglée, conserver ces paramètres de PMT constant.
3. Numérisez les diapositives expérimentales sur les deux canaux en appuyant sur le bouton "scan". Enregistrez les images de diapositives (les deux canaux) après chaque balayage.
4. Chargez la diapositive à analyser dans le logiciel de microréseaux en utilisant le bouton "fichier".
5. Chargez la liste de réseaux de gènes (GAL) fichier en utilisant le bouton "fichier". Le fichier GAL a la mise en page du tableau avec les identités des caractéristiques du tableau.
6. Placez le gabarit de tableau sur l'image numérisée de telle sorte que les tableaux caractéristiques correspondent aussi étroitement le modèle que possible.
7. Alignez fonctionnalités dans tous les blocs avec le modèle en appuyant sur le bouton "align". Le programme trouvera généralement les grandes lignes des caractéristiques circulaires mais certains réglages manuels peut être nécessaire. Ces ajustements peuvent être faits en entrant dans le mode de fonction. Le logiciel calcule ensuite un MFI B pour chacun des antigènes.
8. Utilisez le bouton "Fichier" pour exporter ces résultats sous forme de fichier texte.

4. Les données Analyse de tableau avec l'analyse de signification de Microarrays (SAM)

1. Charger des fichiers texte individuels dans Excel et d'identifier les colonnes qui ont MFI-B pour les canaux Cy3 et Cy5.
2. Calculer la moyenne pour les fonctions en double.
3. Pour toute négative MFI-B, remplacer le nombre négatif avec 10. Transformer les données en divisant brutes MFI-B par 100 et puis en calculant log base 2.
4. Analyser journal des données transformées avec l' analyse de signification de Microarrays (SAM) comme décrit précédemment ^7.
5. Pour une étude utilisant deux groupes (par exemple, des contrôles sains contre patients), l' étiquette d' un groupe "1" et le groupe "2." Utilisez un bi-classe, l'analyse apparié dans SAM pour identifier les antigènes réactivités qui sont significantly différente entre les deux groupes (valeur de q <0,05).
6. Utilisez le regroupement et la chaleur carte de génération de logiciels pour faire des images pour la présentation ^8.

Résultats

Les antigènes sont disposés dans une plaque à 384 puits et imprimés sur des lames par un microarrayer robotisé comme représenté sur la figure 1. La figure 2 montre des diapositives placées dans un cadre avec des chambres d'incubation et d' une lame numérisée après traitement. La figure 3 montre des lames de contrôle positif et négatif. La diapositive négative est seulement sondé avec des anticorps secondaires, et la lame de contrôle posi...

Discussion

Le protocole décrit ici permet la quantification d'auto-anticorps en utilisant la technique des puces à ADN antigène. microréseaux d'antigènes offrent plusieurs avantages par rapport à ELISA classique dans le dépistage des auto-anticorps. Tout d'abord, une variété d'antigènes, y compris des acides nucléiques, des protéines, des peptides, et les lysats cellulaires peuvent être revêtus sur les lames de nitrocellulose revêtu, permettant ainsi de criblage d'auto-anticorps multiplexé. En outre, seuls micr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilué à 0,2 mg/ml dans les
IgG humains	PBS Jackson Immuno	009-000-003	dilué à 0,2 mg/ml dans les
IgM humains	PBS Jackson Immuno	009-000-012	dilué à 0,2 mg/ml dans les
IgG de souris	Sigma-Aldrich	I5381	dilué à 0,2 mg/ml dans les
IgM de souris	Biolegend	401601	diluer à 0,2 mg/ml dans
l’ADN double brin	Sigma-Aldrich	D1626	diluer à 0,2 mg/ml dans
l’ADN simple brin	Sigma-Aldrich	D8899	diluer à 0,2 mg/ml dans le
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	de nombreux types de arrayers sont des
broches d’impression solides	Arrayit Corporation	SSP015
logiciel pour microarrayer robotisé	Virtek	Chipwriter Pro  ;
Glissières FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
Châssis FAST	GVS Northa America	10486001
Chambres d’incubation FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 plaques de puits	Whatman	7701-5101
scelleuses de plaques	VWR	60941-062
couvercles	de plaques de filmVWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	12483020
Cy3 chèvre anti-humaine IgG	Jackson Immuno	109-165-096	utiliser le stock de travail dans 50 % de glyercol
Cy5 chèvre anti-humain	IgM Jackson Immuno	109-175-129	utiliser le stock de travail dans 50 % de chèvre glyercol
Cy3 anti-souris IgG	Jackson Immuno	115-165-071	utiliser le stock de travail dans 50 % glyercol
Cy5 chèvre anti-souris	IgM Jackson Immuno	115-175-075	utiliser le stock de travail dans 50 % glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Logiciel de microarray	Molecular Devices Genepix	6.1
Logiciel de clustering	eisenlab.org	Cluster 3.0
Logiciel de carte thermique	eisenlab.org	Treeview 1.60
Logiciel statistique de microarrays	de Stanford	SAM 4.0 (analyse de signification des microarrays)