Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour générer des microréseaux d’antigènes personnalisables qui peuvent être utilisés pour la détection simultanée d’auto-anticorps IgG et IgM sériques chez l’homme et la souris. Ces réseaux permettent une détection quantitative et à haut débit d’anticorps contre tout antigène ou épitope d’intérêt.

Résumé

Les auto-anticorps, qui sont des anticorps contre les auto-antigènes, sont présents dans de nombreux états pathologiques et peuvent servir de marqueurs de l’activité de la maladie. Les niveaux d’auto-anticorps contre des antigènes spécifiques sont généralement détectés à l’aide de la technique ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Cependant, le dépistage de plusieurs auto-anticorps avec ELISA peut prendre du temps et nécessite une grande quantité d’échantillons de patients. La technique des microréseaux d’antigènes est une méthode alternative qui peut être utilisée pour dépister les auto-anticorps de manière multiplexe. Dans cette technique, les antigènes sont disposés sur des lames de microscope spécialement recouvertes à l’aide d’un microréseau robotisé. Les lames sont sondées avec des échantillons de sérum de patients, puis des anticorps secondaires marqués par fluorescence sont ajoutés pour détecter la liaison des auto-anticorps sériques aux antigènes. Les réactivités des auto-anticorps sont révélées et quantifiées en scannant les lames avec un scanner capable de détecter les signaux fluorescents. Nous décrivons ici des méthodes permettant de générer des microréseaux d’antigènes personnalisés. Nos matrices actuelles sont imprimées avec 9 broches pleines et peuvent inclure jusqu’à 162 antigènes repérés en double. Les réseaux peuvent être facilement personnalisés en changeant les antigènes dans la plaque source utilisée par le microarrayer. Nous avons développé un schéma de détection d’anticorps secondaires bicolore qui permet de distinguer les réactivités IgG et IgM sur la même surface de lame. Le système de détection a été optimisé pour étudier la liaison des auto-anticorps humains et murins.

Introduction

Les auto-anticorps sont présents dans de nombreux états pathologiques et peuvent souvent avoir une activité pathogène directe¹. L’identification des auto-anticorps est importante pour le diagnostic de certaines maladies, pour le pronostic de l’évolution de la maladie et pour la classification des patients susceptibles de bénéficier de thérapies spécifiques². Les auto-anticorps sont généralement identifiés dans le sérum du patient à l’aide de la technique ELISA. Cependant, le dépistage de plusieurs antigènes avec cette technique est laborieux et consomme une grande quantité d’échantillon de patient. De nouvelles technologies sont donc nécessaires ....

Protocole

1. dilution Antigènes Generating Antigène Microarrays

1. Diluer les antigènes dans du PBS à une concentration finale de 0,2 mg / ml. Imprimer jusqu'à 162 antigènes uniques en double avec une configuration de puces à ADN de 9 broches. Inclure des IgG et IgM antigènes présents dans la banque d'antigène comme témoins positifs. Inclure PBS seulement comme un contrôle négatif.
2. Ajouter 20 pi de chaque antigène au puits plaque source 384. Ajouter des antigènes à la plaque de source dans des groupes qui reflètent la configuration de la tête d' impression (par exemple, disposer d' antigènes dans des groupes de 9 quand 9 broches sont ....

Résultats

Les antigènes sont disposés dans une plaque à 384 puits et imprimés sur des lames par un microarrayer robotisé comme représenté sur la figure 1. La figure 2 montre des diapositives placées dans un cadre avec des chambres d'incubation et d' une lame numérisée après traitement. La figure 3 montre des lames de contrôle positif et négatif. La diapositive négative est seulement sondé avec des anticorps secondaires, et la lame de contrôle posi.......

Discussion

Le protocole décrit ici permet la quantification d'auto-anticorps en utilisant la technique des puces à ADN antigène. microréseaux d'antigènes offrent plusieurs avantages par rapport à ELISA classique dans le dépistage des auto-anticorps. Tout d'abord, une variété d'antigènes, y compris des acides nucléiques, des protéines, des peptides, et les lysats cellulaires peuvent être revêtus sur les lames de nitrocellulose revêtu, permettant ainsi de criblage d'auto-anticorps multiplexé. En outre, seuls micr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ribosomal P0	Diarect	14100	dilué à 0,2 mg/ml dans les
IgG humains	PBS Jackson Immuno	009-000-003	dilué à 0,2 mg/ml dans les
IgM humains	PBS Jackson Immuno	009-000-012	dilué à 0,2 mg/ml dans les
IgG de souris	Sigma-Aldrich	I5381	dilué à 0,2 mg/ml dans les
IgM de souris	Biolegend	401601	diluer à 0,2 mg/ml dans
l’ADN double brin	Sigma-Aldrich	D1626	diluer à 0,2 mg/ml dans
l’ADN simple brin	Sigma-Aldrich	D8899	diluer à 0,2 mg/ml dans le
microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	de nombreux types de arrayers sont des
broches d’impression solides	Arrayit Corporation	SSP015
logiciel pour microarrayer robotisé	Virtek	Chipwriter Pro  ;
Glissières FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
Châssis FAST	GVS Northa America	10486001
Chambres d’incubation FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 plaques de puits	Whatman	7701-5101
scelleuses de plaques	VWR	60941-062
couvercles	de plaques de filmVWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	12483020
Cy3 chèvre anti-humaine IgG	Jackson Immuno	109-165-096	utiliser le stock de travail dans 50 % de glyercol
Cy5 chèvre anti-humain	IgM Jackson Immuno	109-175-129	utiliser le stock de travail dans 50 % de chèvre glyercol
Cy3 anti-souris IgG	Jackson Immuno	115-165-071	utiliser le stock de travail dans 50 % glyercol
Cy5 chèvre anti-souris	IgM Jackson Immuno	115-175-075	utiliser le stock de travail dans 50 % glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Logiciel de microarray	Molecular Devices Genepix	6.1
Logiciel de clustering	eisenlab.org	Cluster 3.0
Logiciel de carte thermique	eisenlab.org	Treeview 1.60
Logiciel statistique de microarrays	de Stanford	SAM 4.0 (analyse de signification des microarrays)