Génération de deux couleurs Antigène Microarrays pour la détection simultanée des IgG et IgM autoanticorps

Les auto-anticorps sont présents dans de nombreux états pathologiques et peuvent souvent avoir une activité pathogène directe¹. L’identification des auto-anticorps est importante pour le diagnostic de certaines maladies, pour le pronostic de l’évolution de la maladie et pour la classification des patients susceptibles de bénéficier de thérapies spécifiques². Les auto-anticorps sont généralement identifiés dans le sérum du patient à l’aide de la technique ELISA. Cependant, le dépistage de plusieurs antigènes avec cette technique est laborieux et consomme une grande quantité d’échantillon de patient. De nouvelles technologies sont donc nécessaires pour profiler les auto-anticorps à plus grande échelle.

La technique des microréseaux d’antigènes est une technologie protéomique qui permet de profiler les auto-anticorps de manière multiplex³. Dans la première étape de ce processus, une banque d’antigènes est disposée sur une surface de lame à l’aide d’un microarrayer robotisé. Les lames sont sondées avec du sérum dilué, puis des anticorps secondaires marqués par fluorescence sont ajoutés. Les réactivités des anticorps sont visualisées en scannant les lames à l’aide d’un scanner à microréseaux et quantifiées par des intensités fluorescentes. Les puces à antigènes offrent de multiples avantages par rapport à la technique ELISA dans le dépistage des auto-anticorps : 1) elles n’ont besoin que de quelques microlitres de sérum pour établir le profil des auto-anticorps à plusieurs antigènes simultanément, 2) elles utilisent l’antigène avec parcimonie, car seuls des nanolitres d’antigène sont repérés sur les puces, 3) elles ont une sensibilité accrue³ par rapport à l’ELISA et 4) elles permettent le simultané, détection séparée de plus d’un isotype d’anticorps. Des microréseaux d’antigènes ont été utilisés pour profiler les auto-anticorps dans des maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et le lupus érythémateux disséminé^4-6. Dans ces trois maladies, de nouvelles informations sur la pathogenèse de la maladie ont été obtenues en profilant les auto-anticorps à grande échelle avec les réseaux.

Nous décrivons ici un protocole permettant de générer des microréseaux d’antigènes à l’aide de lames recouvertes de nitrocellulose. Une variété d’antigènes, y compris des protéines, des peptides et des lysats cellulaires, peuvent être disposés sur les lames à l’aide de cette technique. Les réseaux peuvent être facilement personnalisés en incluant des antigènes d’intérêt dans la plaque source qui contient la bibliothèque d’antigènes. De plus, nous montrons comment une paire d’anticorps secondaires peut être utilisée pour séparer les réactivités IgG et IgM sur la même surface de lame. Nous avons maintenant optimisé cette technique pour mesurer les auto-anticorps chez l’homme et la souris.

1. dilution Antigènes Generating Antigène Microarrays

1. Diluer les antigènes dans du PBS à une concentration finale de 0,2 mg / ml. Imprimer jusqu'à 162 antigènes uniques en double avec une configuration de puces à ADN de 9 broches. Inclure des IgG et IgM antigènes présents dans la banque d'antigène comme témoins positifs. Inclure PBS seulement comme un contrôle négatif.
2. Ajouter 20 pi de chaque antigène au puits plaque source 384. Ajouter des antigènes à la plaque de source dans des groupes qui reflètent la configuration de la tête d' impression (par exemple, disposer d' antigènes dans des groupes de 9 quand 9 broches sont utilisées pour l' impression).
3. Plaque de source avec une feuille et le gel à -80 ° C jusqu'à ce que prêt à imprimer des tableaux.
4. Nettoyer les repères de la microarrayer solides en les incubant dans un bain de sonication avec de l'eau déminéralisée pendant 3 x 1 min. La place des broches dans le rack à sécher et ensuite organiser des épingles dans microarray tête d'impression. Pour 9 broches, utilisez une configuration 3 x 3.
5. microarrayer de programme pour le tirage en réglant les repères de numéro sur la tête d'impression,nombre de diapositives à imprimer, le nombre de plaquettes sur chaque diapositive, et le nombre de taches réplicats pour chaque antigène. En règle générale, utiliser 9 broches, 70 diapositives, 2 pads / slide, et 2 spots réplicats pour chaque antigène. microarrayer du programme à Soniquer épingles dans l'eau entre les différents groupes d'antigènes.
6. plaque source Thaw et la plaque puis centrifuger pendant 1 min à 100 x g. Placer la plaque de source endroit désigné dans microarrayer. Retirer la partie de la feuille qui recouvre le premier groupe d'antigènes à imprimer.
7. Disposer les diapositives non imprimées sur la surface de arrayer et l'exécution du programme d'impression. Imprimer des diapositives à la température ambiante avec une humidité réglées sur le arrayer à 55 - 60% avec la construction dans l'humidificateur de la machine à matrice.
8. Après chaque groupe d'antigènes est imprimé sur toutes les diapositives, mettre en pause le microarrayer. Couvrir les antigènes qui ont été simplement imprimées avec du papier (pour éviter l'évaporation) et de découvrir le prochain groupe d'antigènes à imprimer. Poursuivre le programme d'impression.
9. Après tous les antigènes ont été imprimés, source de couverture plmangé avec le nouveau morceau de papier et le gel à -80 ° C. Placez les diapositives imprimées dans la boîte coulissante et joint à vide. Les lames peuvent être utilisés le lendemain ou jusqu'à un mois plus tard.

2. Sonder Antigène Microarrays avec Dilué Sera

1. Placez les diapositives dans des cadres à l'aide de chambres d'incubation. Ajouter 700 pi de tampon de blocage (2,5% [vol / vol] fœtal de sérum de veau (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 dans du PBS) à chaque surface de la matrice.
2. Placez un film adhésif sur le cadre et le placer dans un récipient hermétique avec un morceau de tissu humide. Incuber O / N à 4 ° C sur une bascule.
3. Diluer les échantillons de sérum 1: 100 dans un tampon de blocage. Aspirer la solution de blocage de tableaux et ajouter 500 ul d'échantillon dilué dans chaque surface de la matrice.
4. Couvrir avec un film adhésif et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec balancement.
5. Diluer Anticorps secondaires dans un tampon de blocage. Pour les études sur l'homme, on dilue un anticorps IgG de chèvre marqué au Cy3 antihumain à 0,33 pg / ml et une Cy5 de chèvre marqué anti human IgM à 0,25 ug / ml. Pour les études sur la souris, diluer une Cy3 de chèvre marqué à l'anticorps anti-IgG de souris à 0,38 pg / ml et un anticorps marqué par Cy5 IgM anti-souris de chèvre à 0,7 pg / ml.
6. Aspirer échantillons à partir des tableaux et rincer les surfaces du tableau 4 fois avec un tampon de rinçage (0,1% de Tween 20 dans du PBS). Verser le tampon sur des diapositives et feuilleter rapidement.
7. Ajouter 700 pi de tampon de blocage pour laver chaque surface de la matrice et incuber 10 min à température ambiante avec bascule. Répétez l'étape de lavage deux fois de plus.
8. Ajouter 500 pi d'anticorps secondaire dilué dans chaque surface de glissement et couvrir avec un film adhésif. Incuber 45 min à 4 ° C avec balancement.
9. Aspirer mélange secondaire d'anticorps à partir de diapositives et rincer 4 fois comme ci-dessus. Laver les lames 3 fois avec 700 pi de tampon de blocage / de dilution comme ci-dessus.
10. Retirer les lames de cadres et les placer dans la grille coulissante métallique qui est immergé dans du PBS. Incuber 20 min à température ambiante avec agitation orbitale. Placer dans le nouveau conteneur de PBS et incuber une autre 20 mavec agitation.
11. Placer la grille coulissante dans un récipient d'eau désionisée 15 sec. Placer la grille dans un nouveau récipient d'eau et incuber une autre 15 sec.
12. Pour diapositives sèches, lieu glisser la grille sur un adaptateur de plaque ELISA dans la centrifugeuse et de spin à 220 g pendant 5 min à température ambiante.
13. Placez les diapositives dans une boîte étanche à la lumière jusqu'au moment de la numérisation.

3. Numérisation Antigène Microarrays et exportation de données

1. Numériser diapositives à l'aide d'un scanner de puces à ADN permettant de détecter des signaux fluorescents Cy3 et Cy5. Afin d'ajuster les niveaux tube photomultiplicateur (PMT) du scanner, pré-numériser une diapositive qui n'a été sondé avec des anticorps secondaires.
   Note: Cette diapositive doit avoir la bibliothèque de l'antigène complet imprimé sur elle, y compris positive (IgG et IgM) et négatifs (PBS) contrôles. Le pré-scan est un balayage à basse résolution qui permet à l'utilisateur de trouver rapidement les réglages optimaux PMT.
2. Définissez les valeurs PMT de sorte que les traits humains IgG (sur le canal Cy3) et le bourdonnementune des caractéristiques IgM (sur le canal Cy5) ont une même intensité de fluorescence médiane moins arrière-plan (MFI B), (typiquement 40 000). Les niveaux PMT sont réglés en appuyant sur le bouton "hardware". Une fois réglée, conserver ces paramètres de PMT constant.
3. Numérisez les diapositives expérimentales sur les deux canaux en appuyant sur le bouton "scan". Enregistrez les images de diapositives (les deux canaux) après chaque balayage.
4. Chargez la diapositive à analyser dans le logiciel de microréseaux en utilisant le bouton "fichier".
5. Chargez la liste de réseaux de gènes (GAL) fichier en utilisant le bouton "fichier". Le fichier GAL a la mise en page du tableau avec les identités des caractéristiques du tableau.
6. Placez le gabarit de tableau sur l'image numérisée de telle sorte que les tableaux caractéristiques correspondent aussi étroitement le modèle que possible.
7. Alignez fonctionnalités dans tous les blocs avec le modèle en appuyant sur le bouton "align". Le programme trouvera généralement les grandes lignes des caractéristiques circulaires mais certains réglages manuels peut être nécessaire. Ces ajustements peuvent être faits en entrant dans le mode de fonction. Le logiciel calcule ensuite un MFI B pour chacun des antigènes.
8. Utilisez le bouton "Fichier" pour exporter ces résultats sous forme de fichier texte.

4. Les données Analyse de tableau avec l'analyse de signification de Microarrays (SAM)

1. Charger des fichiers texte individuels dans Excel et d'identifier les colonnes qui ont MFI-B pour les canaux Cy3 et Cy5.
2. Calculer la moyenne pour les fonctions en double.
3. Pour toute négative MFI-B, remplacer le nombre négatif avec 10. Transformer les données en divisant brutes MFI-B par 100 et puis en calculant log base 2.
4. Analyser journal des données transformées avec l' analyse de signification de Microarrays (SAM) comme décrit précédemment ^7.
5. Pour une étude utilisant deux groupes (par exemple, des contrôles sains contre patients), l' étiquette d' un groupe "1" et le groupe "2." Utilisez un bi-classe, l'analyse apparié dans SAM pour identifier les antigènes réactivités qui sont significantly différente entre les deux groupes (valeur de q <0,05).
6. Utilisez le regroupement et la chaleur carte de génération de logiciels pour faire des images pour la présentation ^8.

Les antigènes sont disposés dans une plaque à 384 puits et imprimés sur des lames par un microarrayer robotisé comme représenté sur la figure 1. La figure 2 montre des diapositives placées dans un cadre avec des chambres d'incubation et d' une lame numérisée après traitement. La figure 3 montre des lames de contrôle positif et négatif. La diapositive négative est seulement sondé avec des anticorps secondaires, et la lame de contrôle positif est sondé avec le sérum d'un patient souffrant d'un lupus érythémateux systémique. En utilisant deux anticorps secondaires marqués séparément, IgG et IgM réactivités peuvent être séparés sur la même surface de glissement. La figure 4 montre l' intensité de fluorescence des anticorps IgM dirigés contre l' ADN simple brin (ADNsb) et d' IgG d' anticorps contre ribosomal P (Ribo P) sur une large gamme de dilutions de sérum. Dans cette expérience, le sérum de contrôle positif d'un patient avec le lupus érythémateux systémique avec une réactivité connue contre Ribo P a été utilisé. Linles réponses de l'oreille sont observées sur le canal IgM sur toutes les dilutions de sérum. réponses linéaires sont observées sur le canal IgG jusqu'à un MFI-B d'environ 30.000. Après ce point, les réponses commencent à saturer et l' augmentation des anticorps à Ribo P ne conduisent pas à une augmentation correspondante de MFI-B. Figure 5 montre comment les tableaux peuvent être utilisés pour détecter le facteur rhumatoïde dans le sérum humain. Dans cette étude, le sérum d'un patient souffrant vascularite cryoglobulinémique avec un facteur rhumatoïde documenté (anticorps IgM dirigés contre les IgG) de 167 IU / ml (normale <11 IU / ml) a été utilisé. En utilisant des anticorps secondaires seul, aucune réactivité IgM est perçue contre l'IgG qui est repéré sur le réseau. En revanche, la réactivité IgM significative (MFI B d'environ 5000) est détectée contre l' IgG lorsque le tiroir est sondé avec du sérum provenant du patient avec le facteur rhumatoïde. La figure 6 montre l'évolution des deux couleurs antigène puces à ADN pour une utilisation avec du sérum de souris. Dans cette figure, e IgM de sourisat est repéré sur la matrice est seulement détecté par l'anticorps secondaire anti-souris IgM et IgG de souris qui est repéré sur le réseau ne peut être détectée par l'anticorps secondaire anti-IgG de souris. La figure alignement 7 montre une grille de modèle sur une scannée image tableau en utilisant un logiciel d'analyse des microréseaux. Une fois les caractéristiques du tableau ont été alignées sur la grille, les caractéristiques du tableau peuvent être analysées pour obtenir médiane intensité de la fluorescence moins arrière-plan pour chaque fonction.

Figure 1. Génération d'antigène Microarrays. Les antigènes sont d' abord placés dans la plaque de la source. Dans la plaque de source indiqué sur la figure, les antigènes sont disposés en groupes de 9, ce qui correspond au 3 x 3 la disposition des broches de tête d'impression. La plaque de source est ensuite placé dans le microarrayer robotique et les antigènes sont ensuite repéré sur les lames. Dans cet exemple, 2-pad diapositives FAST are utilisé, ce qui permet pour les tableaux identiques à être repéré sur les 2 surfaces de nitrocellulose. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Traitement de l' antigène Microarrays. Slides sont placés dans des cadres FAST en utilisant des chambres d'incubation et sont traitées en ajoutant des échantillons puis des anticorps secondaires. réactivités Antigen sont révélés avec un scanner capable de détecter des signaux fluorescents. L'image numérisée d'une diapositive FAST 2-pad est affiché. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

<br /> Figure 3. Deux couleurs Antigène Microarrays Optimisé pour une utilisation avec des sérums humains. (A) IgG, IgM et IgG Fc sont détectés sur le réseau sondé avec des anticorps secondaires seulement. Ces trois antigènes sont les témoins positifs pour montrer la spécificité des anticorps secondaires. la fluorescence rouge (canal IgM) indique la liaison de l'anticorps secondaire anti-IgM humaine. fluorescence verte (canal IgG) indique la liaison de l'anticorps secondaire anti-IgG humaine. L'antigène IgG Fc est blanche due à la sursaturation. (B) Beaucoup plus de réactivités sont détectés sur le réseau sondé avec du sérum de contrôle positif d'un patient avec le lupus érythémateux systémique avec une réactivité connue à Ribo P antigène. Les cases indiquent les endroits où l' ADN et Ribo P antigènes ont été disposés. (C) La quantification des intensités de fluorescence dans le sérum témoin positif révèle que la majorité des réactivités des anticorps dirigés contre des antigènes d'ADN sont des IgM isotype (D) . La quantification des intensités de fluorescence dans le sérum témoin positif révèle que la majorité des réactivités d'anticorps contre les antigènes Ribo P sont de l'isotype IgG. caractéristiques de tableau sont repérés en double exemplaire et sont d'environ 500 m de diamètre. Les graphiques montrent la moyenne ± SD pour les fonctionnalités de tableau. dsDNA, ADN double brin; ADNss, ADN simple brin; MFI-B, médiane intensité de la fluorescence moins fond; Ribo P, ribosomal P. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Fluorescence Intensity vs Sérum Facteur de dilution. (A) MFI-B sur une large gamme de dilutions de sérum est indiquée pour IgM contre ADNss et IgG contre Ribo P. Pour cesexpériences, sérum de contrôle positif avec la réactivité connue IgG contre Ribo P et ADNss a été utilisé. MFI B est saturé à une valeur d'environ 65.000. (B) Log2 transformation des données MFI-B révèle des réponses linéaires sur les deux canaux IgG et IgM sur une large gamme de réactivités d'antigène. Plus d'un MFI B de 30.000, le signal IgG commence à saturer et perd la linéarité. caractéristiques de tableaux ont été repérés en 6 répétitions. Les graphiques montrent la moyenne ± SD pour les fonctionnalités de tableau. ADNss, ADN simple brin; MFI-B, médiane intensité de la fluorescence moins fond; Ribo P, ribosomal P. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Détection de facteur rhumatoïde avec deux couleurs Antigène Microarrays. (B) Tableau sondé avec du sérum d'un patient avec vascularite cryoglobulinémique avec un facteur rhumatoïde élevé. La caractéristique IgG est vert-jaune due à la liaison de l'IgM dans le sérum du patient immobilisé IgG. Fait intéressant, ce patient a également des anticorps IgG dirigés contre IgM comme la caractéristique IgM apparaît orange. Le patient a aussi une histoire de maladie cardiaque congénitale et est noté pour avoir une réactivité élevée à la troponine cardiaque de la protéine C. (C) Quantification de l'IgG et IgM dispose sur le réseau sondé seulement avec des anticorps secondaires montre que les anticorps secondaires ne sont pas toute réactivité croisée. (D) Quantificationdes caractéristiques IgG et IgM sur la matrice sondées avec le sérum du patient confirme la présence du facteur rhumatoïde. Caractéristiques sont repérés en double exemplaire et sont d'environ 500 m de diamètre. Les graphiques montrent la moyenne ± SD pour les fonctionnalités de tableau. MFI-B, médiane intensité de fluorescence moins de fond. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Développement des Tableaux à deux couleurs au profil de la souris anticorps sériques. (A) Tableau sondée seulement avec des anticorps secondaires. la fluorescence rouge indique la liaison de l'anticorps secondaire anti-IgM de souris. la fluorescence verte indique que la liaison de l'anticorps secondaire anti-IgG de souris. L'IgG de souris qui est repéré sur le réseau est détecté uniquement par l'anti-mouse IgG d'anticorps secondaire, et l'IgM de souris qui est repéré est détectée seulement par l'anticorps secondaire anti-IgM de souris. Les autres caractéristiques sur les réseaux qui sont détectés par les anticorps secondaires sont des anticorps de capture contre IgG de souris ou IgM de souris (B) . Tableau sondé avec un anticorps IgG monoclonal de souris contre les étiquettes histidine. Sur ce tableau, l'antigène Ribo P (protéine recombinante marquée par His) est vert, ce qui indique qu'il est seulement détecté par l'anticorps secondaire IgG anti-souris. Ceci est attendu étant donné que l'anticorps monoclonal est de l'isotype IgG. L'antigène Ribo P n'a pas été détectée lorsque les matrices sont sondées avec un anticorps secondaire seul (boîte orange). (C) La quantification de l' IgG, IgM et Ribo P dispose sur le réseau sondé avec un anticorps monoclonal IgG de souris contre les étiquettes histidine. caractéristiques de tableau sont repérés dans six répétitions et sont d'environ 500 m de diamètre. Les graphiques montrent la moyenne ± SD pour les fonctionnalités de tableau. MFI-B, médiane Fluorescence intensité moins de fond; Ribo P, ribosomal P. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. Alignement d'un modèle de grille sur un tableau image. Dans cette capture d' écran, une grille de modèle, qui a été généré à partir d' un fichier de gal, a été aligné avec un antigène microarray préalablement numérisé. La matrice a été sondé avec du sérum d'un patient souffrant de lupus érythémateux aigu disséminé et un trouble de la coagulation sanguine qui avait beaucoup réactivités autoanticorps. fluorescence verte représente la liaison des anticorps IgG et la fluorescence rouge représente la liaison des anticorps IgM. Les caractéristiques imprimées par des broches pleines sont à peu près circulaire et sont facilement définis par le logiciel de puces à ADN (Genepix). Une fois l'alignement de la grille est terminée, le software peut calculer l'intensité de fluorescence moyenne moins de fond (sur les deux canaux Cy3 et Cy5) pour chacune des fonctions de tableau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.