Visualisation et quantification de la couche acellulaire en artérioles du muscle Cremaster Rat

Summary

Cette étude démontre la préparation chirurgicale du muscle crémaster du rat pour la visualisation de la couche acellulaire in vivo. Des facteurs considérables affectant la précision de la mesure de la largeur de la couche acellulaire sont discutés dans cette étude.

Abstract

La couche acellulaire est définie comme la couche de plasma pariétal dans le flux de microvaisseaux, qui est dépourvue de globules rouges. La mesure de la largeur de la couche acellulaire in vivo et de ses variations spatio-temporelles peut fournir une compréhension complète de l’hémodynamique dans la microcirculation. Dans cette étude, nous avons utilisé un système microscopique intravital couplé à une caméra vidéo à haute vitesse pour quantifier les largeurs de couches acellulaires dans les artérioles in vivo. Le muscle crémaster des rats Sprague-Dawley a été extériorisé chirurgicalement pour visualiser le flux sanguin. Un script d’imagerie personnalisé a également été développé pour automatiser le traitement de l’image et l’analyse de la largeur de la couche acellulaire. Cette approche permet de quantifier les variations spatio-temporelles de manière plus cohérente que les mesures manuelles précédentes. La précision de la mesure dépend toutefois en partie de l’utilisation d’un filtre bleu et de la sélection d’un algorithme de seuillage approprié. Plus précisément, nous avons évalué le contraste et la qualité des images acquises avec et sans l’utilisation d’un filtre bleu. De plus, nous avons comparé cinq algorithmes différents de seuillage basés sur des histogrammes d’images (Otsu, minimum, intermode, sélection itérative et seuillage entropique flou) et illustré les différences dans leur détermination de la largeur de la couche acellulaire.

Introduction

Les études animales in vivo sont essentielles à la science fondamentale pour comprendre la physiologie et la pathologie humaines. En particulier, les études microhémodynamiques in vivo peuvent élucider l’altération potentielle des fonctions microcirculatoires altérées par des conditions rhéologiques anormales du sang. Un certain nombre d’études microhémodynamiques antérieures^ont utilisé le modèle musculaire crémaster du rat pour visualiser le flux sanguin microvasculaire. Le muscle crémaster est une fine couche de muscle strié entourant les testicules. Ainsi, le flux sanguin dans le muscle peut être visualisé à l’aide d’un microscope à trans-illumination au moyen d’une exposition chirurgicale. Cela nous permet d’acquérir les images du flux sanguin in vivo sans utiliser d’agents de fluorescence ou de contraste. De plus, l’ensemble de la perfusion sanguine du réseau musculaire peut être contrôlé en réduisant le flux sanguin en amont avec occlusion de l’aorte abdominale². En raison de ces avantages, le modèle musculaire crémaster a été largement utilisé pour étudier la formation de la couche acellulaire (CFL) dans les microvaisseaux^1,3.

La largeur CFL est un paramètre hémodynamique important dans la microcirculation, qui a été d’un grand intérêt pour ses rôles importants dans la régulation des fonctions microcirculatoires. La LFC est formée par la migration transversale vers l’intérieur des globules rouges (GR) induite par le cisaillement vers le centre d’écoulement⁴. Par conséquent, cette migration conduit à l’épuisement des globules rouges près des parois des vaisseaux, ce qui finit par entraîner une couche de plasma acellulaire. En conséquence, la LFC pariétale devient naturellement une barrière de diffusion à l’apport d’oxygène (O₂) du noyau de globules rouges vers les tissus et au piégeage de l’oxyde nitrique (NO) par les globules rouges^5,6. De plus, la production de NO peut également être modulée par les variations dynamiques de la largeur CFL^7,8. Par conséquent, les rôles des LFC dans le transport des gaz et la régulation de l’homéostasie dans la microcirculation doivent être pleinement déterminés pour mieux comprendre le flux sanguin dans la microcirculation. Des études récentes se sont concentrées sur le rapprochement des fonctions hémodynamiques et de transport de gaz des LFC dans la microcirculation^9-12. De plus, une série distincte d’études a également examiné comment l’élévation pathologique de l’agrégation des globules rouges module la formation des LFC et son effet sur la biodisponibilité de l’O_{, de l’O 2} et du NO dans les tissus^13,14.

Les rôles des LFC deviennent plus importants dans la microcirculation où la taille relative de la largeur de la LFC par rapport au diamètre du récipient est proéminente. Cela nécessite une approche efficace de quantification des LFC dans le flux sanguin in vivo. En particulier, l’acquisition et l’analyse d’images sont les deux éléments clés qui déterminent la précision de la mesure de la largeur des LFC. Une visualisation réussie du flux sanguin tissulaire doit être précédée d’une préparation chirurgicale appropriée du modèle animal. De plus, une technique d’analyse d’image appropriée est nécessaire pour surmonter les limites des mesures manuelles conventionnelles qui sont principalement induites par des erreurs humaines^15,16. Grâce aux progrès de l’instrumentation optique et à la puissance de calcul pour le traitement des images numériques, il est désormais possible d’obtenir une mesure plus précise et plus cohérente de la largeur CFL^17-19. Néanmoins, la précision de ces mesures, basée sur l’image, dépend toujours en fin de compte de la qualité des images.

Par conséquent, cette étude explore les facteurs influençant la mesure de la largeur CFL in vivo. Nous nous sommes particulièrement concentrés sur la démonstration de la préparation chirurgicale et de l’analyse d’images numériques pour les mesures de la largeur des LFC dans les artérioles du muscle crémaster du rat.

Protocol

Cette étude est conforme à l'Université nationale de Singapour Institutional Animal Care et utilisation Commission (protocole approuvé no. R15-0225).

1. Préparation chirurgicale du modèle animal

1. Canules Navire
   1. Anesthésier un des rats mâles Sprague-Dawley (6 - 7 semaines) pesant (203 ± 20) g avec de la kétamine (37,5 mg / ml) et de xylazine (5 mg / ml) cocktail par voie intrapéritonéale (ip) par injection (2 ml / kg) . Ne pas récapituler l'aiguille ou le retirer de la seringue après l'injection.
   2. Une fois que l'animal a été anesthésié (confirmé par orteil pincement), placez-le sur un coussin chauffant pour maintenir sa température corporelle à 37 ° C. raser délicatement les cheveux sur les omoplates, col antérieure, le bas-ventre, jambe arrière médial et scrotum. retenir doucement les jambes à l'aide de bandes de papier adhésif.
   3. Effectuer toutes les interventions chirurgicales en utilisant des ciseaux de microdissection et des pinces inclinées lors de la visualisation par le biaisun stéréomicroscope. Placez tous les outils chirurgicaux pointus sur un plateau résistant à la perforation pour éviter les blessures pendant la chirurgie.
   4. Frotter tous les sites chirurgicaux 3 fois avec une alternance d'iode et 70% d'alcool avant d'effectuer l'incision. Rincer tous les cathéters avec 30 UI / ml solution d'héparine-solution saline.
   5. Faire 1 - 1,5 cm incision cutanée médiane sur les omoplates en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux sur la veine jugulaire droite. Séparer le fascia par dissection pour exposer la veine jugulaire et Cathétériser avec un tube en polyéthylène (PE-50) rempli avec de l'héparine-solution saline en utilisant 5-0 sutures de soie. Perfuser anesthésie supplémentaire lorsque cela est nécessaire (1/3 à 1/2 de la dose initiale par voie intraveineuse (iv)) pendant toute la durée de la chirurgie et l'expérimentation.
   6. Effectuer trachéotomie pour maintenir la perméabilité des voies aériennes. Faire 1 - incision cm 1,5 dans la région cervicale antérieure. Cathétériser la trachée en utilisant un tube de polyethylene (PE-205) avec des sutures en soie 2-0 pour fixer le cathéter en place.
   7. Surveiller la pression artériellepar canulation dans l'artère fémorale. Faire 1 - incision cm 1,5 à la surface interne gauche de la patte arrière. Séparer l'artère fémorale par dissection. Cathétériser l'artère fémorale par un tube en polyéthylène (PE-10) rempli d'héparine-solution saline en utilisant des sutures en soie 5-0.
2. Cremaster Muscle Préparation and Flow Visualization
   1. Insérez une suture 5-0 en soie à travers le sommet du scrotum de l'étendre. Faire une incision le long de la surface ventrale du scrotum. Appliquez régulièrement solution chaude isotonique (37 ° C; pH 7,4) au muscle exposé.
   2. Retirer entourant les tissus conjonctifs soigneusement et minutieusement à l'aide d'un coton-tige.
   3. Insérer un fil de suture en soie 5-0 à travers le sommet du muscle crémaster. Couper le fil de suture en deux morceaux de longueur égale et un nœud de chaque côté. Couper les muscles entre les deux noeuds et l'étirer sur une plate-forme de plexiglas transparent personnalisé en tirant doucement le fil de suture. Réparerl'extrémité de la suture sur la plate-forme avec tack bleu.
      REMARQUE: la suppression approfondie des tissus environnants conjonctifs est crucial dans l'obtention optimale contraste de l'image.
   4. 1.2.3 Répétez l'étape jusqu'à ce que 5 à 6 fixations sont faites. Retirez délicatement le muscle crémaster de l'épididyme en utilisant haute cautérisation de température. Superfuse solution chaude isotonique du muscle exposé pour prévenir la déshydratation du tissu.
      1. Entourez le muscle crémaster avec des pièces jointes de gaze. Couvrir le muscle exposée avec un film de polyvinyle. Les morceaux de gaze avec le film forment un bassin peu profond pour contenir une solution isotonique chaude pour l'objectif immersion dans l' eau microscope (figure 1A).
   5. Transférer l'animal sur la scène des animaux d'un microscope intravitale (figure 1C). Branchez le cathétérisme artériel à un système d'acquisition de données physiologiques pour la surveillance continue de la pression (figure 1E).
   6. Maintenir le temperat musculaireure à 35 ° C , avec un élément chauffant attaché en dessous de la plate - forme d'animaux (figure 1B). Placer une sonde de température côté du muscle pour fournir une rétroaction négative au régulateur de puissance de l'élément chauffant (Figure 1D).
   7. Laissez l'animal sur la scène pendant 15 min à équilibrer avec l'environnement.
   8. Visualiser le flux sanguin sous un microscope intravitale avec un objectif immersion dans l'eau 40X et d'un condenseur à travailler longtemps.
   9. Choisissez une artériole non ramifiées (<60 pm) sur la base d'un foyer image claire et contraste entre le noyau RBC, la LCF et des parois du récipient, afin de se concentrer le microscope sur le plan diamétral du vaisseau sanguin. Faire tourner la caméra montée sur le microscope pour aligner la paroi de la cuve verticale.
   10. Enregistrez le flux de sang à l'aide d'une caméra vidéo à haute vitesse à une cadence de 3.000 / s pendant 1 sec. Enregistrer la vidéo enregistrée comme non compressé format AVI en niveaux de gris de 8 bits pour préserver la qualité de l'image.
       REMARQUE: Un taux minimum d'images d'enregistrement de 3000 images / sec est recommandé de veiller à ce que la mesure de la LCF peut être effectuée au moins une fois par RBC dans des conditions d'écoulement des artérioles physiologiques.
   11. Utilisez un filtre bleu avec transmission de pic à une longueur d'onde de 394 nm et passe-bande spectrale à 310 - 510 nm pour améliorer le contraste entre les globules rouges et le plasma.
       REMARQUE: Assurez-vous que le spectre de la lumière passant à travers le filtre bleu de la source de lumière microscopique (lampe halogène 100 W) est de faible intensité de la lumière pour éviter tout dommage tissulaire potentiel.
   12. A la fin de l'expérience, l'animal euthanasie par surdose de pentobarbital sodique.

2. Analyse de l' image

1. Prétraiter pour la mesure de la largeur de la LCF
   1. Ouvrez MATLAB et exécutez le fichier 'CFL_pre.m'. (Ceci et d'autres fichiers MATLAB peut être trouvé dans leip "> Supplemental MATLAB Archive.)
   2. Cliquez sur "Ouvrir le fichier" pour sélectionner le fichier vidéo à analyser.
   3. Réglez la glissière de la 'Rotation' pour aligner les parois des vaisseaux verticalement.
      REMARQUE: Les utilisateurs peuvent afficher les lignes de la grille aidant à l'alignement du navire en sélectionnant le bouton radio 'Grid On', et d'ajuster le niveau de l'image de zoom en faisant glisser le curseur 'Zoom'.
   4. Cliquez sur le bouton 'Confirmer Edition' pour confirmer l'alignement des navires.
   5. Cliquez sur le bouton «Set ROI à la culture» pour définir la région d'intérêt (ROI). L'image aligné sera affiché dans une fenêtre pop-up. Ajustez l'objectif rectangulaire sur l'image, et double cliquer pour confirmer le retour sur investissement. Passer cette étape si le recadrage de l'image ne soit pas nécessaire.
      NOTE: Inclure seulement un navire dans le retour sur investissement pour analyser la largeur de la LCF du navire. Cliquez sur le bouton «Rétablir l'image" pour restaurer l'image à sa forme originale, le cas échéant.
   6. Clique le9; Extrait de bouton pour extraire toutes les images vidéo éditées en consécutifs d'images en niveaux de gris (8 bits 'Images format bmp'). Les images extraites peuvent être trouvées dans le dossier avec le même nom que le fichier vidéo sélectionné.
2. Mesure de la largeur de la LCF
   1. Ouvrez MATLAB et exécutez le fichier 'CFL_measure.m'.
   2. Cliquez sur "Sélectionner un dossier" pour sélectionner le dossier contenant les images extraites.
   3. Cliquez sur le dossier contenant les images et cliquez sur "Sélectionner un dossier". La première image dans le dossier sera chargé et affiché dans la «image Grayscale 'écran, ainsi que son histogramme d'intensité de gris dans le panneau' image Histogramme '.
   4. Sélectionnez le cadre de l'image souhaitée dans la zone de liste pour effectuer l'analyse, sinon la première image sera sélectionnée.
   5. Cliquez sur "Trouver les parois des vaisseaux» pour identifier la paroi intérieure du vaisseau dans l'image, qui est déterminée à l'endroit où lelumière profil d'intensité de pointe transits de l'obscurité à la lumière sur deux pixels.
   6. Cochez «Filtre médian» pour appliquer un filtre médian à l'image pour réduire le bruit «poivre et sel».
   7. Vérifiez 'Contraste automatique' pour ajuster les intensités de l'image numérique pour améliorer le contraste de l'image.
   8. Sélectionnez un algorithme de seuillage dans la zone de liste qui détermine automatiquement une valeur de seuil (de τ) qui divise les niveaux de gris en deux classes - pixels blancs avec des niveaux de gris ci-dessus τ (CFL), et les pixels noirs avec des niveaux de gris ci-dessous τ (de base RBC).
      NOTE: Comme une méthode alternative, utiliser seuillage manuel si aucun algorithme automatisé-seuillage fournit une image seuillage appropriée. Cliquez sur le bouton «Manuel» de la radio et réglez le curseur pour définir la valeur manuelle de seuillage.
   9. Pour mesurer la variation spatiale des largeurs de la LCF, entrez la résolution en pixels dans la case «Pixel Résolution» (la résolutionavec cette configuration expérimentale était de 0,42 um / pixel).
   10. Cliquez sur le bouton «Calculer» pour obtenir la variation spatiale des largeurs de la LCF. Cliquez sur '.csv Exporter' pour exporter les données de largeur de la LCF dans un format sous forme de tableaux.
   11. Pour mesurer la variation temporelle des largeurs de la LCF à une ligne d'analyse spécifique le long du navire, cliquez sur le bouton radio «variation temporelle» et entrez les informations de fréquence d'images (le taux de trame utilisé dans ce dispositif expérimental était de 3000 images / s).
   12. Saisissez la première image et la dernière image des images pour l'analyse dans les cases «Démarrer Frame 'et' Last Frame ', respectivement.
   13. Sélectionnez la position de la ligne d'analyse le long du vaisseau en faisant glisser la barre de glissement du 'analyse Line'. Vérifiez la position de la ligne d'analyse, qui est illustrée à la fois «l'image en niveaux de gris" et "l'image binaire.
   14. Cliquez sur «Calculer» pour obtenir la variation temporelle des largeurs de la LCF. Click 'Export .csv' pour exporter les données de largeur de la LCF dans un format sous forme de tableaux.

Results

La visualisation de la LCF in vivo est largement tributaire de la préparation chirurgicale de l'animal. la perte de sang excessive ou de la durée de la chirurgie prolongée peuvent soumettre l'animal aux chocs et aux aberrations de la circulation sanguine. Maintien de la température des tissus en utilisant un coussin chauffant, ainsi qu'une plate-forme personnalisée pendant la chirurgie et l'expérience est également cruciale pour le maintien des conditions physiologiques du rat. En utilisant une lampe halogène d...

Discussion

La mesure de la largeur de la LCF est essentielle pour une meilleure compréhension de l'hémodynamique dans la microcirculation. En particulier, la mesure des largeurs de la LCF a été réalisée en mésentérique ^6, spinotrapezius ²⁴ et ²⁵ cérébraux microcirculations. Mesure conventionnelle des largeurs in vivo de la LCF a été limitée aux estimations par une inspection manuelle des images vidéo enregistrées. Les mesures manuelles nécessaires à la moyenne de plusieurs trames vidéo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope intravital	Olympus	BX51WI	Équipement
Caméra haute vitesse	Photron	1024PCI	Équipement
Filtre bleu	HOYA	B390
Équipement Capteur de pression & système biopac	Système Biopac	TSD104A, MP100
Équipement Régulateur de température	Shimaden	SR 1	Équipement
Plasma Lyte A	Baxter	NDC :0338-0221	Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Solution saline 0,9 %	Héparine Braun
(5 000 UI/ml)	LEO
PE-10 tube en polyéthylène	Becton Dickinson	427400.024	» OD x .011 » ID  ;
Tube en polyéthylène PE-50	Becton Dickinson		427411.038 » OD x .023 » ID
Tube en polyéthylène PE-205	Becton Dickinson	427446.082 » OD x .062 » ID
2-0 Suture en soie non résorbable	Deknatel	113-S
Suture en soie non résorbable 5-0	Deknatel	106-S
Coussin chauffant à circulation d’eau	Gaymar
Bain-marie	Fisher Scientific	Isotemp 205	Équipement
Gaze de coton stérile	Fisher Scientific	22-415-468
Applicateurs à embout de coton	Fisher Scientific	23-400-124
Pince Dumont Kent	Scientific	INS14188	Instrument chirurgical
Micro Pince à dissection	Kent Scientific	INS15915	Instrument chirurgical
Pince à iris 1 x 2 dents	Kent Scientific	INS15917	Chirurgical instrument
Pince à canulation vasculaire	Kent Scientific	INS500377	Instrument chirurgical
Micro ciseaux	Kent Scientific	INS14177	Instrument chirurgical
Ciseaux à iris	Kent Scientific	INS14225	Instrument chirurgical
Clip pour vaisseau	Kent Scientific	INS14120	Instrument chirurgical
Gemini système de cautérisation	Braintree Scientific	GEM 5917	Instrument chirurgical